Verbetering van Bacillus subtilis sporentelling en labelanalyse in flowcytometrie

Het verzamelen van sporen van Bacillus subtilis met behulp van traditionele methoden kan een arbeidsintensieve taak zijn, aangezien deze methoden volledig handmatig kunnen zijn en hun nauwkeurigheid afhankelijk is van de ervaring van de operator. Dit protocol maakt het mogelijk om slapende en ontkiemende sporen te inventariseren. Bovendien maakt de techniek het ook mogelijk om het percentage coping van fluorescerende eiwitten op het oppervlak te bepalen.

Gezien de installatiestap die in dit protocol aanwezig is, demonstreert de visie met faciliteiten en het technische begrip en de gedetailleerdheid van zorg in deze uitvoering. Begin met inloggen op de cytometersoftware. Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer, gevolgd door Fluidic Startup.

Kies vervolgens Reinigingsmodi. En tot slot, start SIT Flush. Neem 50 microliter autoclaafsporen en incubeer ze met ethidiumbromide met een verdunningsfactor van 0,05% volume gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht.

Was de sporen driemaal met PBS door gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 17.949 g en opnieuw te suspenderen in PBS. Voeg vervolgens 10 microliter korrels toe volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor verdunning en analyseer het monster met behulp van een flowcytometer. Definieer de poortstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van de deeltjes met behulp van de negatieve controle als referentie.

Meng vervolgens de tube voorzichtig. Bevestig het aan de flowcytometersonde en klik op Verwerven. Om het laservermogen in te stellen, gaat u naar het tabblad Parameters in het cytometervenster, stelt u de voorwaartse verstrooiing in op 375 en de zijverstrooiing op 275.

Selecteer vervolgens het tabblad Drempelwaarde en stel deze in op 500. Analyseer vervolgens het kleurstofvrije monster dat alleen sporen bevat om autofluorescentie te elimineren. Stel op het tabblad Parameters de spanningen van de filterdetector drie in op 603 en de spanningen van filterdetector vijf op 538 om onderscheid te maken tussen negatieve en positieve populaties met behulp van fluorescentie in de controles.

Klik vervolgens op Compensatie en stel de 5 bij 3 ingestelde setoffset van de filterdetector in op één. Als u het apparaat wilt configureren voor acquisitie, selecteert u Experiment, kiest u de experimentlay-out en stelt u de acquisitie in op 30.000 gebeurtenissen. Nadat u de parameters hebt aangepast, verkrijgt u gegevens voor de monsters die zijn gelabeld en kralen bevatten in de flowcytometer.

Centrifugeer 50 microliter sporen bij 17.949 G gedurende 10 minuten. Vervolgens suspendeer je de sporen opnieuw met 25 microliter 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide en incubeer je ze gedurende 15 minuten. Voeg daarna 25 microliter N-hydroxysulfosuccinimide in een concentratie van 50 millimolair toe aan de sporensuspensie.

Incubeer de sporensuspensie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de sporen driemaal met PBS door te centrifugeren zoals eerder getoond. Voeg fluorescerend eiwit toe aan de monsters en incubeer een nacht bij 15 graden Celsius.

Voeg 10 milligram per milliliter ethidiumbromide verdund op 1 tot 50 toe en laat de monsters vervolgens een uur op ijs liggen, beschermd tegen licht. Na het wassen van de sporen en het definiëren van de poorten zoals eerder weergegeven, wijzigt u de parameters voor filterdetector drie op de x-as en filterdetector vijf op de Y-as van de dotplot. De telkralenmethode detecteerde twee keer 10 tot de derde sporen per microliter in autoclaafsporenmonsters.

Een ethidiumbromidekleuring van autoclaafsporenmonsters vertoonde een hogere gemiddelde fluorescentie-intensiteit dan de kleuring van niet-geautoclaveerde sporen, wat wijst op een grotere kleuring van genetisch materiaal. Het autoclaafsporenoppervlak, in combinatie met APC-gelabeld, anti-humaan interleukine 10-antilichaam, vertoonde een grotere koppelingsefficiëntie in vergelijking met de niet-geautoclaveerde sporen. De aanwezigheid van sporen die doorlaatbaar zijn voor ethidiumbromide duidde op de mogelijke aanwezigheid van ontkiemde sporen in de totale populatie.

Op basis van de flowcytometrie-analyses werd waargenomen dat het fluorescerende antilichaam een hoger percentage koppeling met de slapende sporen vertoonde in vergelijking met de ontkiemde. Bovendien, naarmate de concentratie van fluorescerende antilichamen toenam, werd een toename van het percentage gekoppelde sporen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit waargenomen. Het is belangrijk om een grondige homogenisatie van de huidige korrels uit te voeren om nauwkeurige metingen door middel van flowcytometrie en nauwkeurige telling van sporen te garanderen.

Door de concentratie van antigenen die aan sporen zijn gehecht te standaardiseren, analyseren Canadese studies het gebruik van sporen als vaccinantilichamen.