De seriële anesthesie-array voor het high-throughput onderzoek van vluchtige stoffen met behulp van Drosophila melanogaster
24 februari 2023
De fruitvlieg (Drosophila melanogaster) wordt veel gebruikt voor biologisch en toxicologisch onderzoek. Om het nut van vliegen uit te breiden, ontwikkelden we een instrument, de seriële anesthesie-array, die tegelijkertijd meerdere vliegenmonsters blootstelt aan vluchtige algemene anesthetica (VGA's), waardoor het mogelijk wordt om de neveneffecten (toxisch en beschermend) van VGA's te onderzoeken.
De SAA maakt verwerking met een hoge doorvoer mogelijk voor het onderzoeken van de farmacologie van vluchtige stoffen in ongewervelde modelorganismen die zijn begiftigd met een geavanceerd brein en een uitgebreid repertoire aan gedragingen. In combinatie met de genetische gereedschapskist die beschikbaar is in Drosophila melanogaster, maakt deze techniek het mogelijk om de farmacogenetica van vluchtige stoffen snel en betaalbaar te bestuderen. Veel mensen worden blootgesteld aan vluchtige stoffen als verontreinigende stoffen of therapeutische middelen.
Naast anesthesie hebben vluchtige anesthetica tal van toxische en gunstige neveneffecten. De mate van effect wordt mede bepaald door de genetica, die grotendeels onontgonnen is gebleven. Na het maken van het houten frame, wijzigt u 50 milliliter kroniekbuisdoppen door twee gaten in elke dop te boren met een boor van 9/32 inch.
Schuur de gaten om het rafelige plastic op te ruimen. Schuur ook de bovenkant van de dop om het oppervlak op te ruwen. Snijd vervolgens vijf milliliter serologische pipetten op maat door het plastic te scoren en schoon te breken op de gescoorde lijn.
Schuur de uiteinden van de gesneden of gebroken pipetten. Lijm daarna gaas op de buizen en knip het gaas op de buismaat zodra de lijm droogt. Steek de buizen in de gaten van de conische doppen met beide buizen die boven de dop uitsteken.
Zorg ervoor dat de instroombuis langer in de buis steekt dan de uitstroom. Breng lijm aan op de bovenkanten van de doppen rond de buizen om de onderdelen aan elkaar te bevestigen en te laten drogen. Bevestig zelfklevende kabelbinders aan het frame.
Bevestig de doppen aan het frame met ritssluitingen en knip de uiteinden van de ritssluiting kort. Knip en sluit de lengte van de tygonbuizen aan op de in- en uitstroombuizen op elke gewijzigde dop. Begin aan het stroomopwaartse uiteinde en bevestig de buis eerst aan de instroom en vervolgens aan de uitstroom naar de instroom van de volgende positie.
Voeg vervolgens een stroomindicator toe aan de meest stroomafwaartse instroom. Plaats een conische buis van 50 milliliter in de eerste positie en markeer het watervulmerk. Verwijder de buis.
Vul het met water onder de instroombuis en plaats het terug op zijn plaats. Bereid de interfacing voor de vaporizer voor. Verwijder de zuigers, knip inkepingen uit twee doseerspuiten van 10 milliliter en steek ze in de in- en uitstroom van de verdamper met de inkepingen direct naar de voorkant van de verdamper gericht om uit te lijnen met de gaten.
Sluit het hele systeem aan. Gebruik tygonbuizen om de dragergastank te bevestigen met de regelaar, gasspecifieke flowmeter, verdamper en SAA. Vul lege posities op de array met lege kroniekbuizen van 50 milliliter.
Zet nu de gastank aan. Open de flowmeter tot twee liter per minuut en zet de vaporizer aan op 0%Bevestig de gasstroom door het systeem door de flowmeter stroomopwaarts van de vaporizer en de flow-indicator stroomafwaarts van de laatste kamer van de SAA te controleren op flow. U kunt ook het stroomafwaartse uiteinde van de buis in het water steken en op zoek gaan naar bellen.
24 uur of meer voorafgaand aan de blootstelling aan anesthesie sorteert u de vliegcohorten indien nodig voor het experiment met behulp van de voorkeursmethode. Breng vliegen over van voedselflacons in lege conische buizen van 50 milliliter. Tel en noteer dode vliegen voorafgaand aan blootstelling.
Ontkap en schroef 50 milliliter conische buizen met vliegen op de SAA. Schakel het dragergas in en stel het in op het gewenste debiet. Stel de verdovingsverdamper in op de gewenste concentratie en stel de vliegen bloot voor de gewenste duur.
Aan het einde van de blootstelling spoelt u het systeem met de verse gasstroom met 1,5 liter per minuut gedurende vijf minuten, wat overeenkomt met ongeveer 10x volumes van het totale SAA-volume. Open de hogedrukregelaar volledig en sluit deze vervolgens een halve slag om de gasstroom van de drager te garanderen. Volg de slang voor elke lijn naar de flowmeters en vaporizer en controleer het verdovingsniveau in de vaporizers.
Controleer of wanneer gas stroomt, dit de stroom aangeeft op de stroommeter en op de stroomafwaartse stroomindicator. Laat aan het einde van het experiment vier tot vijf minuten luchtstroom de verdoving uitspoelen. Zeven lijnen geïsoleerd uit een enkele populatie door middel van single pair meetings toonden variatie in iso fluor toxiciteit-geïnduceerde mortaliteit als gevolg van evolutionaire druk in ND23 60114 vliegen.
Pre-conditionering vliegt met 15 minuten 2%iso fluor voorafgaand aan traumatisch hersenletsel verminderde de mortaliteitsindex na 24 uur in witte 1118 en geel/witte stammen. De sterfte-index na 24 uur was niet significant lager in de voorgeconditioneerde Oregon R- en Canton S-lijnen. Tijdens de montage moeten de inkepingen in de gemodificeerde spuiten uitlijnen met de gaten van de verdamperpoorten.
Controleer tijdens de blootstelling periodiek of er stroming door het systeem is. Deze procedure kan worden gevolgd voor een breed scala aan gedrags-, overlevings- en moleculaire studies die kunnen leiden tot inzichten in de farmacologie van vluchtige stoffen.
Overzicht
De serial anesthesia array (SAA) is een nieuw instrument dat is ontworpen voor high-throughput verwerking van Drosophila melanogaster om de farmacologie van vluchtige algemene anesthetica (VGAs) te bestuderen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om zowel toxische als beschermende effecten van VGAs op fruitvliegen te onderzoeken, gebruikmakend van hun genetische diversiteit.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Farmacologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een veelgebruikt modelorganisme in biologisch onderzoek.
- VGA's hebben diverse collaterale effecten die door genetica worden beïnvloed.
- De SAA faciliteert de gelijktijdige blootstelling van meerdere monsters aan VGA's.
- Inzicht in de effecten van VGA's kan informatie verschaft over hun therapeutische en toxicologische implicaties.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor high-throughput onderzoek naar VGA's in fruitvliegen.
- Het verkennen van de genetische basis van reacties op VGA's.
- Het beoordelen van zowel de toxische als de beschermende effecten van VGA's op Drosophila.
Gebruikte methoden
- Constructie van de SAA met behulp van aangepaste dopjes van 50 milliliter chronicle-buisjes en serologische pipetten.
- Opstelling van een gasstroomsysteem om VGAs bij de vliegenmonsters te brengen.
- Blootstelling van Drosophila aan VGAs onder gecontroleerde omstandigheden.
- Monitoring van de vliegmortaliteit en gedragsresponsen na blootstelling.
Belangrijkste resultaten
- Er werd variatie waargenomen in de mortaliteit geïnduceerd door isofluraan-toxiciteit tussen verschillende vliegenlijnen.
- Pre-conditionering met isofluraan verminderde de mortaliteit in bepaalde stammen.
- De SAA-methode maakt efficiënt en reproduceerbaar testen van VG's mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen leiden tot een beter begrip van de farmacologie van vluchtige anesthetica.
Conclusies
- De SAA is een effectief instrument om de effecten van VGA's bij Drosophila te bestuderen.
- Genetische factoren spelen een belangrijke rol bij de reactie op VGA's.
- Dit onderzoek kan implicaties hebben voor het begrijpen van de effecten van VGA's in bredere biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De Serial Anesthesia Array (SAA) maakt high-throughput, kwantitatief onderzoek naar vluchtige algemene anesthetica (VGAs) in Drosophila mogelijk, wat bijdraagt aan een snelle farmacogenetische en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Door gelijktijdige, gecontroleerde blootstelling van meerdere genotypes of biologische variabelen mogelijk te maken, verhoogt de SAA het voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie en portfoliotriage voor neurofarmacologische en toxicologische pijplijnen. Dit platform voorziet in de behoefte aan schaalbare, reproduceerbare systemen om genetische en omgevingsfactoren van drugrespons te onderzoeken.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt systematisch onderzoek mogelijk naar genetische determinanten die de VGA-respons beïnvloeden in een gecontroleerd in vivo-systeem.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door farmacodynamische en farmacogenetische interacties in diverse vliegenmodellen te verduidelijken.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via reproduceerbare, geparalleliseerde blootstelling en uitkomstmeting.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor de verdere ontwikkeling van programma's voor neuroactieve verbindingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, schaalbare biologische systemen voor voor downstream compound-screening en mechanistische studies.
- Standaardiseert blootstellingscondities en kwantitatieve outputs over meerdere cohorten en genotypen.
- Maakt reproduceerbare high-throughput beoordeling van gedragsmatige, overlevings- en moleculaire eindpunten mogelijk.
- Ondersteunt de assay-gereedheid voor het evalueren van de werkzaamheid en toxiciteit van compounds in genetisch hanteerbare modellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt preklinische modelsystemen af op ziekterelevante genetische en omgevingsvariabelen.
- Zorgt voor continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie van neurofarmacologische hypothesen.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van robuuste, vergelijkende gegevens over verschillende genotypen en condities.
- Ondersteunt translationeel onderzoek naar biomarkers in modellen voor neuroinflammatie en letsel.
Integratie van pipeline en workflow
De SAA is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetesten en targetvalidatie tot leadidentificatie en de ontwikkeling van preklinische modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar de effecten van VGA en genetische modifiers in een schaalbaar in vivo systeem.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor vergelijking tussen cohorten en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische analyse van mortaliteit, gedrag en moleculaire eindpunten mogelijk om besluitvorming te ondersteunen.
- Translationeel Onderzoek: Slaat de brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door ziekterelevante genetische variabelen en letselvariabelen te modelleren.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar, modulair platform dat aanpasbaar is voor uiteenlopende farmacologische en genetische studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontwikkeling van neuroactieve verbindingen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid voor farmacogenetische en toxicologische studies.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste, vergelijkende datageneratie.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van neurofarmacologische activa.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, gedragstests en farmacologie.
- Vereist toegang tot verdampingsinstrumentatie, gasstroomregeling en analytische infrastructuur voor kwantitatieve read-outs.
- Vraagt om standaardisatie van blootstellingsprotocollen en data-analyseworkflows tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse genotypen, biologische variabelen en experimentele eindpunten.
- Praktische beperkingen omvatten de schaalbaarheid naar andere modelorganismen en de vertaling naar mammalische systemen.
