Name: Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Leer de semi-in vitro cum septum methode voor live beeldvorming van pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting in Arabidopsis thaliana. Deze techniek verhoogt de efficiëntie en steekproefgrootte voor fertilisatiestudies aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Sara Simonini en Stefano Bencivenga voor het doneren van de pFG:roGFP2-ORP1-NLS construct en Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter en Celia Baroux voor hun advies over microscopie. We erkennen vriendelijk het advies van Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima en alle anderen op de International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022 die interesse toonden in een protocol over SIV cum septum. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Zürich en subsidies van de Swiss National Science Foundation aan U.G.

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor een lijst van de materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Overwegingen voor het ontwerpen van het beeldvormingsexperiment
<ol><li>Bepaal vooraf de beeldduur en bemonsteringsfrequentie die nodig zijn om het gewenste waargenomen fenomeen vast te leggen. Volgens de bemonsteringsstelling van Nyquist moet de bemonsteringsfrequentie bijvoorbeeld groter zijn dan tweemaal de hoogste frequentie van het invoermonster. Daarom, om synergetische [Ca2 +] cyt-oscillaties nauwkeurig vast te leggen, ongeveer elke 10 s beeldvorming uit te voeren, maar om de snelheid van de zaadcellen bij afvoer van de stuifmeelbuis te meten, zorgt u voor een temporele resolutie van minder dan 1 s10.</li>
	<li>Selecteer fluorescerende markers voor de cellen van belang die voldoende helder zijn buiten de achtergrondautofluorescentie. Selecteer voor het gebruik van biosensoren de helderste lijnen die de celfunctie niet verstoren, omdat ze over het algemeen gevoeliger zijn en minder belichtingstijd vereisen.</li>
	<li>Bedenk welk type fluorescentiemicroscopie en vergroting het meest geschikt zijn om het gewenste fenomeen vast te leggen. Gebruik widefieldmicroscopie en lage vergrotingsdoelstellingen om licht van een grotere scherptediepte vast te leggen en de focus in de loop van de tijd te behouden, grotere objecten zoals hele eitjes in beeld te brengen of ratiometrische sensoren te gebruiken die gevoelig zijn voor chromatische verschuivingsartefacten. Gebruik CLSM of 2PEM met hoge vergrotingsdoelstellingen voor een betere resolutie van cellulaire en subcellulaire objecten, maar let op de moeilijkheid om de focus in de loop van de tijd te behouden.</li>
	<li>Schat het aantal monsters dat per experiment in beeld moet worden gebracht. Gebruik bijvoorbeeld een 10x-objectief met een minimale bemonsteringstijd van ~30 s voor het in beeld brengen van drie septa en het in beeld brengen van maximaal 40 bevruchtingsgebeurtenissen per experiment vanwege de tijd die nodig is voor de autofocus- en meertrapsacquisitiefuncties.</li>
</ol>2. Bereiding van het ontkiemingsmedium voor stuifmeel
<ol><li>Bereid vloeibaar stuifmeelkiemmedium (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0,01% [w/v] H 3 BO3en 10% [w/v] sucrose) met behulp van 1 M aliquote voorraden van elke micronutriënt, die worden opgeslagen bij −20 °C. Stel de pH in op 7,5 met 0,1 M KOH. Bewaar het medium bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken. OPMERKING: De pH kan na verloop van tijd dalen.</li>
	<li>Voeg 2,5 ml vloeibaar medium toe aan een bekerglas van 10 ml en voeg langzaam 32 mg agarose met ultralaag smeltpunt (~ 1,3%) toe met een snel roterende roerstaaf om klonteren te voorkomen.</li>
	<li>Smelt agarose op een kookplaat bij 65 °C en nutteer het bekerglas om eventuele condensatie van de zijkanten op te vangen.</li>
	<li>Pipetteer 130 μL medium in de 14 mm put van een 35 mm glazen bodemschaal en draai de schaal totdat het medium de put bedekt.</li>
	<li>Zuig in totaal 40 μL aan met een pipet vanuit het midden van de schaal, waardoor een totaal volume van 90 μL achterblijft. OPMERKING: Er kan meer medium uit de put worden geaspireerd om een lager totaal volume te bereiken; Dit kan nodig zijn voor hoge vergrotingsdoelen met lage werkafstanden. Hoe dunner het agarpad is, hoe sneller het zal uitdrogen.</li>
	<li>Koel de schotel op een aluminium blok in een vochtigheidskamer om een gelijkmatige koeling te garanderen. Bewaar de borden een nacht bij 4 °C voor gebruik de volgende ochtend.</li>
</ol>3. Bloemenstadiëring van septumdonoren, stigmadonoren en stuifmeeldonoren
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig01.jpg"> Figuur 1: Bloemenstadiëring van septumdonoren, stigmadonoren en stuifmeeldonoren. (A) Stadia van Arabidopsis-bloemen (Ler-0) binnen een bloeiwijze. Knoppen in stadium 12B, die bloemblaadjes hebben die op het punt staan te openen en gele onopvallende helmknoppen, moeten worden uitgemergeld door alle kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraden te verwijderen. Stampers (die de vrouwelijke gametofytenmaker herbergen) zijn dan 24 uur later bruikbaar als septumdonor. (B) Stadia van Arabidopsis-bloemen (Col-0) binnen een bloeiwijze. Knoppen in stadium 12B, die gele ondehiscente helmknoppen en stigma's hebben die nauwelijks uit de bloemblaadjes komen, moeten worden uitgemergeld door alle kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraden te verwijderen. De stampers zijn dan 24 uur later bruikbaar als stigmadonoren, wanneer ze moeten worden bestoven door bloemen (met de mannelijke gametofytmarker) die open zijn en stuifmeel afstoten. Bestoven stigma's moeten binnen 1 uur na bestuiving worden ontleed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Kies de ochtend voor de beeldvorming Arabidopsis-planten om te worden gebruikt als septumdonoren en stigmadonoren; Zorg ervoor dat ze gezond zijn en zijn onlangs begonnen met het produceren van siliques. OPMERKING: Landsberg erecta (L er-0) is een goede toetreding voor gebruik als septumdonor, omdat de septa stevig zijn ener kleine internodes tussen de eicellen zijn. Columbia (Col-0) is een goede aanwinst om te gebruiken als stigmadonor omdat ze bevorderlijk lijken te zijn voor de groei van stuifmeelbuizen.</li>
	<li>Emasculeer ten minste drie fase 12B septum donorbloemen en 12 stadium 12B stigmadonorbloemen door hun meeldraden, kelkbladen en bloemblaadjes te verwijderen (figuur 1A, B). Verwijder ook oudere bloemen op dezelfde bloeiwijze, die mogelijk de uitgemergelde bloem kunnen bestuiven.</li>
	<li>In de ochtend, 24 uur later, bestuif de stigmadonoren met de stuifmeeldonorbloemen (bijvoorbeeld met stuifmeelbuis of spermacelmarkers) die gemakkelijk stuifmeel afstoten. De bestuiving is voltooid wanneer de stigma's bijna volledig bedekt zijn met stuifmeel (figuur 1B).</li>
</ol>4. Septumdissectie
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig02.jpg"> Figuur 2: Een korte handleiding voor septum- en stigmadissectie . (A) Stappen van septumdissectie. Speld de stamper vast op dubbelzijdige tape met een injectiespuitnaald en maak sneden op de stijl-eierstokverbinding en de ovarium-pedikelverbinding, gevolgd door een ondiepe snede langs het septum van een van beide carpels (stap 1). Pel de carpelwanden terug op de tape (stap 2). Snijd de replum onder het bovenste septum (stap 3). Knip het septum in de stijl en verwijder het met een tang aan de steel (stap 4). Plaats het septum op agarmedia en sluit het voorzichtig in met een tang. (B) Stappen van stigmadissectie. Speld de stamper (<1 uur eerder bestoven) vast op dubbelzijdige tape en snijd op de stijl-eierstokverbinding met een scheermesje (stap 6). Plaats het stigma op agarmedium met een insulinenaald naast het septum en pas de afstand aan tot ongeveer 250 μm (stappen 7-8). Zorg ervoor dat zich een semi-vloeibare pool vormt rond de micropyles en de basis van de stijlen (stap 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Verzamel dertig minuten na de bestuiving gezonde en volwassen septumdonorstampers bij de pedikel en plaats ze op verse dubbelzijdige plakband gemonteerd op een glazen dia, waarbij het stigma net buiten de rand van de tape plakt. OPMERKING: Beperk de dissectietijd waarvoor de stampers op de plakband zitten om ervoor te zorgen dat deze zo kort mogelijk is. De dissectie moet worden uitgevoerd bij een hoge luchtvochtigheid, wat kan worden bereikt door een luchtbevochtiger naast de dia te plaatsen.</li>
	<li>Speld de stamper stevig vast op de tape door zachtjes op de steel en langs de eierstok te drukken met behulp van de achterkant van een nieuwe insulinespuitnaald voordat u de kelkblad-, bloemblad- en meeldradenresten verwijdert die overblijven van de emasculatie.</li>
	<li>Gebruik onder een stereoscoop een injectiespuitnaald om twee sneden per carpel te maken op de stijl-eierstokovergang en de ovarium-pedikelverbinding, gevolgd door ondiepe sneden langs het septum van elke carpel (figuur 2, stap 1). OPMERKING: Te diep snijden langs het septum zal de eicellen bij de funiculus doorsnijden.</li>
	<li>Pel de eierstokwanden voorzichtig terug op de tape (figuur 2, stap 2) en schuif de naald voorzichtig tussen de twee septa om de replum over de gehele lengte van de stamper te snijden zonder de eitjes te verstoren (figuur 2, stap 3). OPMERKING: Snijd de replum in de richting van de stijl naar de steel om ervoor te zorgen dat de eitjes op het bovenste septum zo min mogelijk worden verstoord.</li>
	<li>Snijd het bovenste septum voorzichtig af op zowel de kruising met de stijl als met de steel en verwijder het septum met een tang van de pedikelzijde (figuur 2, stap 4). OPMERKING: Houd deze snede recht en zacht, zodat het septum vlak blijft en niet kromt.</li>
	<li>Plaats het septum zo plat mogelijk op het medium, zodat de micropyles van de eitjes naar boven en in hetzelfde brandpuntsvlak liggen. Druk het septum zachtjes in het medium totdat de eitjes net iets in het medium zijn ingebed (figuur 2, stap 5). OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het septum zo wordt geplaatst dat de micropyles van de eicellen toegankelijk zijn voor de stuifmeelbuizen (eventuele ontoegankelijke eitjes kunnen voorzichtig worden herschikt met een naald). Een kleine plas vloeistof moet zich na inbedding rond het septum vormen.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.6 voor nog maximaal twee stampers en plaats de septa van begin tot eind.</li>
</ol>5. Stigmadissectie
<ol><li>Plaats de bestoven stigmadonorstampers op verse dubbelzijdige plakband die op een glazen dia is gemonteerd, zodat de overgang in eierstokstijl van de rand van de tape is (figuur 2, stap 6).</li>
	<li>Gebruik een vers scheermesje om de stijl recht naar beneden te snijden en weg te tillen om het stigma op het mes te houden (figuur 2, stap 6). OPMERKING: Knip aan de rand van de tape voor de schoonste snede.</li>
	<li>Verwijder het stigma van het mes met een injectiespuitnaald en plaats het plat op ongeveer 250-300 μm van de eicellen (figuur 2, stappen 7-8). OPMERKING: De stijl moet horizontaal op zijn kant worden georiënteerd; Anders zullen de meeste stuifmeelbuizen onder het septum groeien. Een kleine plas vloeistof bij de ingang van de stijl moet verschijnen nadat deze 1 minuut op het medium heeft gelegen; Dit is een goed teken, omdat de stuifmeelbuizen een gladde uitgang van de stijl hebben.</li>
	<li>Herhaal stap 5.1-5.3 voor maximaal 12 stigma's en plaats er twee aan weerszijden van elk septum. Zoek naar een kleine plas vloeistof die zich vormt rond de micropyle van de eicellen; dit helpt de toegankelijkheid en het richten van de stuifmeelbuizen naar de embryozakken (figuur 2, stap 9). OPMERKING: Beperk de hoeveelheid tijd dat het gerecht open is om te voorkomen dat het medium en de eicellen uitdrogen.</li>
</ol>6. Beeldvorming
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig04.jpg"> Figuur 3: SIV cum septum imaging schema. (A) Volledige SIV cum septum opstelling met 12 bestoven stigma's en 3 septa, gezien door een stereoscoop. (B) Samengevoegde beelden van de volledige SIV cum septum-opstelling gezien in A 5 uur na incubatie met behulp van een 10x-objectief, met de vijf overzichtsgebieden (~ 1 mm elk) gemarkeerd voor meertrapsacquisitie. De groene dozen tonen de eitjes die stuifmeelbuizen hebben ontvangen die een explosieve uitbarsting in de synergiden ondergaan. (C) Nadere weergave van overzichtsgebied 2 op verschillende tijdstippen. Ongeveer 3 uur na het broeden in de vochtigheidskamer op de microscoop, zouden de stuifmeelbuizen in de buurt van de micropyles moeten aankomen en tegen 6 uur beeldvorming zouden de meeste eitjes pollenbuizen (groene vierkanten) goed moeten hebben ontvangen; Deze eitjes ondergaan vervolgens een explosieve stuifmeelbuisbreuk (sterretje). Schaalstaven = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Zodra de dissectie is voltooid en het gerecht klaar is om te worden afgebeeld, laat u het incuberen in een vochtigheidskamer op de microscoop die op 92% relatieve vochtigheid en 21 ° C wordt gehouden. OPMERKING: Als er geen vochtigheidskamer beschikbaar is voor de microscoop, zal het bekleden van de buitenranden van het deksel en de schaal met een klein volume water helpen om een hoge luchtvochtigheid in de schaal te handhaven.</li>
	<li>Breng de samples scherp onder brightfield bij een lage lichtintensiteit en schakel vervolgens over op fluorescerend licht, waarbij de gebieden van het monster op het werkgebiedoverzicht worden gemarkeerd om te worden afgebeeld. OPMERKING: Bij een vergroting van 10x kunnen ongeveer vijf gebieden worden gemarkeerd voor een totaal van drie septa (figuur 3). Beperk de hoeveelheid tijd die wordt gebruikt voor het markeren van de overzichtsgebieden om fototoxiciteit of de opwarming van het monster door het fluorescerende licht te minimaliseren.</li>
	<li>Begin met beeldvorming met behulp van een meertraps acquisitieschema met een autofocusfunctie aan het begin van elk overzichtsgebied. Omdat stuifmeelbuizen ~ 1 uur na het incuberen van het monster uit de stijl komen, vertraagt u de verwerving met 2 uur of totdat de stuifmeelbuizen de micropyle hebben bereikt. Zorg ervoor dat de autofocus is ingesteld met een bereik van 100 μm (7 μm grote stappen en 1 μm fijne stappen) om de eitjes scherp te houden terwijl de septa in de loop van de tijd enigszins beweegt en zakt.</li>
	<li>Stop de beeldacquisitie ~ 9 uur na het starten van de incubatie van het monster, omdat tegen die tijd de meeste eitjes een stuifmeelbuis zouden moeten hebben aangetrokken en ontvangen. OPMERKING: Als een laag aantal eitjes stuifmeelbuizen aantrekt, is zorgvuldige observatie van het gerecht onder een stereoscoop nuttig om te bepalen hoe de eicel- of stijloriëntatie de volgende keer kan worden verbeterd.</li>
</ol>

<ol><li>Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+feronia+disrupts+the+female+gametophytic+control+of+pollen+tube+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception.</a> Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).</li>
<li>Rotman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+control+of+male+gamete+delivery+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).</li>
<li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+short-range+ovule+signals+attract+or+repel+Arabidopsis+thaliana+pollen+tubes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro.</a> BMC Plant Biology. 6, 7(2006).</li>
<li>Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+F-actin+dynamics+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+changes+dynamically+during+the+interaction+of+the+pollen+tube+with+synergid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells.</a> Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).</li>
<li>Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+dialog+mediated+by+the+FERONIA+signal+transduction+pathway+controls+plant+sperm+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery.</a> Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).</li>
<li>Denninger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-female+communication+triggers+calcium+signatures+during+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4645(2014).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+calcium+spikes+during+double+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4722(2014).</li>
<li>Ponvert, N., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergid+calcium+ion+oscillations+define+a+new+feature+of+pollen+tube+reception+critical+for+blocking+interspecific+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dit manuscript introduceert een efficiënt protocol voor de beeldvorming van pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting in Arabidopsis. De verbeterde methode, SIV cum septum, verhoogt het percentage en het totale aantal succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen die per beeldvormingssessie waarneembaar zijn, aanzienlijk. De hier getoonde representatieve resultaten tonen een beeldvormingssessie met 41 succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen en 10 eicellen die ontvangstdefecten vertonen (~ 80% eff...

Het genereren van genetisch unieke nakomelingen in seksueel reproducerende organismen is afhankelijk van de succesvolle fusie van mannelijke en vrouwelijke gameten. In bloeiende planten is de interactie van twee mannelijke gameten (zaadcellen) met twee vrouwelijke gameten (eicel en centrale cel) tijdens dubbele bevruchting afhankelijk van de afgifte van sperma uit de stuifmeelbuis (de mannelijke gametofyt). Dit proces, de ontvangst van stuifmeelbuizen, wordt grotendeels gecontroleerd door de synergetische cellen die zich in de embryozak (de vrouwelijke gametofyt) bevinden1,2. Omdat de ontvangst van stuifmeelbuizen diep in de bloem plaatsvindt, is eenmethode vastgesteld die live-cell imaging van het proces mogelijk maakt, genaamd semi-in vitro (SIV) pollenbuisontvangst, 3. Met deze methode worden weggesneden Arabidopsis-eitjes op semi-vloeibaar stuifmeelkiemmedium geplaatst en gericht op stuifmeelbuizen die groeien door het stigma en de stijl van een stamper die is afgesneden op de stijloverlatende tractusjunctie 3,4. Sinds de ontwikkeling van deze techniek hebben gedetailleerde waarnemingen geleid tot verschillende ontdekkingen rond pollenbuisgeleiding, ontvangst en bevruchting. Deze ontdekkingen omvatten onder andere de verwerving van stuifmeelbuisgericht competentie door groei door het stigma3, het begin van intracellulaire calciumoscillaties in de synergiden bij aankomst van de stuifmeelbuis 5,6,7,8,9, en de dynamiek van het vrijgeven en bevruchten van zaadcellen bij stuifmeelbuisuitbarsting10 . Niettemin, omdat deze techniek afhankelijk is van de excisie van eicellen, zijn de waarnemingen van bevruchting beperkt in aantal en is de ontvangst van stuifmeelbuizen vaak afwijkend, wat resulteert in het falen van stuifmeelbuisruptuur (Video 1 en Aanvullend Dossier 1). Daarom is er behoefte aan een efficiëntere aanpak die analyses met een hoge doorvoer van de ontvangst en bemesting van pollenbuizen mogelijk maakt.
Bij de ontwikkeling van dit protocol werden verschillende nieuwe benaderingen voor het analyseren van pollenbuisontvangst, variërend van de meest "in vitro" tot de meest "in vivo" -methoden, getest en werd een efficiënte techniek op basis van de excisie van het hele septum vastgesteld, die tot 40 observaties van bevruchting per dag mogelijk maakt. Hier worden de nuances en kritische punten van de techniek geschetst, waaronder bloemstadiëring, dissectie, mediumvoorbereiding en beeldvormingsinstellingen. Door dit protocol te volgen, moet onderzoek gericht op pollenbuisgeleiding, pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting worden vergemakkelijkt. De hogere steekproefgroottes die de methode mogelijk maakt, zullen naar verwachting de wetenschappelijke deugdelijkheid van de conclusies uit live beeldvormingsexperimenten versterken. De mogelijke toepassingen van deze techniek omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het uitvoeren van observaties van de moleculaire en fysiologische veranderingen in cytosolische calciumconcentraties ([Ca2+]cyt), pH ofH 2 O2 tijdens gametofyteninteracties door het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren. Bovendien kunnen cytologische veranderingen, zoals degeneratie van de receptieve synergie, spermacelmigratie of karyogamie, gemakkelijker worden waargenomen met behulp van deze verbeterde methode. Ten slotte kan de timing van de verschillende stadia van bevruchting worden gevolgd onder widefieldmicroscopie, en vervolgens kunnen meer gedetailleerde analyses met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) of tweefoton excitatiemicroscopie (2PEM) worden uitgevoerd voor een hogere resolutie en 3D-reconstructie.

<table><tbody><tr><td>1 mm glass slide&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td>16211551</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dish (14 mm well)</td><td>Mattek&nbsp;</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride&nbsp;</td><td>Roth&nbsp;</td><td>CN93.1</td><td></td></tr><tr><td>Columbia (Col-0)&nbsp;</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td>stigma donor</td></tr><tr><td>Dissecting Scope&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX2-ILLT</td><td></td></tr><tr><td>Insulin needle (0.3 G)</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Landsberg erecta (Ler-0)&nbsp;</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td>septum donor</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Merck</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Beldura</td><td>7026797</td><td></td></tr><tr><td>Scotch double sided tape&nbsp;</td><td>Scotch</td><td>768720</td><td>Minder dik en goed voor stigma dissectie</td></tr><tr><td>Sodium Chloride&nbsp;</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>ITW reagents</td><td>A2211,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tesa double sided tape&nbsp;</td><td>Tesa</td><td>05681-00018</td><td>Zeer plakkerig en goed voor septum dissectie</td></tr><tr><td>Ultra low gelling temperature agarose</td><td>FMC SeaPrep</td><td>50302</td><td></td></tr></tbody></table>

live beeldvorming van arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Bij bloeiende planten zijn de groei en begeleiding van de stuifmeelbuis (mannelijke gametofyt) in de stamper en de ontvangst van de stuifmeelbuis door de vrouwelijke gametofyt essentieel voor dubbele bevruchting en daaropvolgende zaadontwikkeling. De interacties tussen mannelijke en vrouwelijke gametofyten tijdens de ontvangst van de stuifmeelbuis culmineren in stuifmeelbuisruptuur en de afgifte van twee zaadcellen om dubbele bevruchting te bewerkstelligen. Omdat stuifmeelbuisgroei en dubbele bevruchting diep verborgen zijn in de weefsels van de bloem, is dit proces moeilijk in vivo waar te nemen.
Een semi-in vitro (SIV) methode voor de live-cell imaging van bevruchting in de modelplant Arabidopsis thaliana is ontwikkeld en geïmplementeerd in verschillende onderzoeken. Deze studies hebben geholpen om de fundamentele kenmerken op te helderen van hoe het bevruchtingsproces plaatsvindt in bloeiende planten en welke cellulaire en moleculaire veranderingen optreden tijdens de interactie van de mannelijke en vrouwelijke gametofyten. Omdat deze live cell imaging-experimenten echter de excisie van individuele eicellen omvatten, zijn ze beperkt tot een laag aantal observaties per beeldvormingssessie, waardoor deze aanpak vervelend en zeer tijdrovend is. Naast andere technische problemen wordt vaak een falen van de stuifmeelbuizen om de eicellen in vitro te bevruchten gemeld, wat dergelijke analyses ernstig verstoort.
Hier wordt een gedetailleerd videoprotocol geleverd voor het in beeld brengen van de ontvangst en bevruchting van pollenbuizen op een geautomatiseerde en high-throughput manier, waardoor tot 40 observaties van pollenbuisontvangst en -breuk per beeldvormingssessie mogelijk zijn. In combinatie met het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren en markerlijnen maakt deze methode het genereren van grote steekproefgroottes mogelijk met een verminderde tijdsinvestering. Nuances en kritische punten van de techniek, waaronder bloemstadiëring, dissectie, mediumvoorbereiding en beeldvorming, zijn duidelijk gedetailleerd in videoformaat om toekomstig onderzoek naar de dynamiek van pollenbuisgeleiding, ontvangst en dubbele bevruchting te vergemakkelijken.

Om de timing van nucleaire degeneratie in de receptieve synergie met betrekking tot stuifmeelbuisruptuur in Arabidopsis te beoordelen, en om te observeren of de linker- of rechtersynergie voorbestemd is om de receptieve synergie te worden, werd de hier beschreven SIV cum septum-methode gebruikt met behulp van een vrouwelijke gametofyt-nucleaire marker gestapeld met een synergetische cytosolische marker (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) als septumdonor en een mannelijke gametofytenmarke...

Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

Deze methode zal het onderzoek naar seksuele voortplanting in Arabidopsis vergemakkelijken door de observatie van gametofytinteracties met hoge efficiëntie en met een hoog steekproefgrootteaantal per beeldvormingssessie mogelijk te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door de eicellen op het septum te houden, de hoeveelheid en ontvankelijkheid van de eicellen sterk wordt verhoogd ten opzichte van eerdere methoden. De dissectietechniek kan in eerste instantie moeilijk zijn en vereist een vaste hand.Daarom is het aan te raden om een paar keer te oefenen op uitgemergelde stampers voordat je aan de slag gaat met het experiment. Begin met het voorbereiden van het ontkiemingsmedium voor pollen zoals uitgelegd in de tekst. Nadat de agar volledig is gesmolten, pipetteer je 130 microliter van het medium in de 14 millimeter put van een glazen bodemschaal van 35 millimeter.Draai de schaal totdat het medium de put bedekt. Zuig 40 microliter medium uit het midden van de schaal met behulp van een pipet en laat 90 microliter medium achter. Om een gelijkmatige koeling van het medium te garanderen, koelt u de schaal op een aluminium blok in een vochtigheidskamer voordat u de p

live-imaging-arabidopsis-pollen-tube-reception-double-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen...

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Chromosoombeweging tijdens de meiotische profase is een slecht begrepen fenomeen dat fundamenteel is voor sporenvorming. Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen, analyseren en kwantificeren van centromeerbewegingen tijdens de meiotische profase in mannelijke meiocyten van Arabidopsis thaliana .

Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

Dit is een high-throughput sperma cryopreservatie protocol voor zebravis. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% in de daaropvolgende vruchtbaarheid vitro fertilisatie en is stabiel gedurende vele jaren.

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Leer de semi-in vitro cum septum methode voor live beeldvorming van pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting in Arabidopsis thaliana. Deze techniek verhoogt de efficiëntie en steekproefgrootte voor fertilisatiestudies aanzienlijk.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Meer video's verkennen