Automatisering van citrus budwood verwerking voor downstream pathogene detectie door middel van instrument engineering

De gedemonstreerde techniek maakt gebruik van een goedkoop instrument om floëemrijk citrusweefsel snel te verwerken, waardoor arbeidsintensieve protocollen en gespecialiseerde laboratoriumapparatuur niet meer nodig zijn. Dit zorgt voor een snelle downstream detectie en beheer van citrus viroïden, virussen en bacteriën. Deze methode kan de doorvoer verhogen en de kwaliteit en uniformiteit van testdiensten verbeteren, wat de citrusindustrie ten goede komt en mogelijk helpt bij het diagnosticeren en behandelen van ziekten in kwekerij- en veldactiviteiten.

Citrusplanten zijn geïnfecteerd door ziekteverwekkers, veroorzaken wereldwijd aanzienlijke economische verliezen. Geavanceerde detectietechnieken voor pathogenen, zoals de Budwood Tissue Extractor of AHO, zijn nodig om pathogeengetest teeltmateriaal te produceren voor grootschalige boomproductie. Hoewel getest en gevalideerd met citrusmonsters, kan de methode worden toegepast in diagnostische laboratoria en veldoperaties voor vele andere gewassen.

Beginners die deze techniek uitvoeren, moeten vertrouwd raken met het protocol, de instructies nauwkeurig volgen en geduldig zijn. Gebruik om te beginnen de telefoon-app Test Tracker om een boom te selecteren en houd een Near-Field Communication of NFC-halsband tegen de telefoon om de boominformatie in de tag te laden. Plaats drie tot vier citrusknophoutmonsters in de Budwood Tissue Extractor, of AHO, compatibele plastic zakdrager en sluit deze met de clip.

Nadat u de kwaliteit van het monster hebt gecontroleerd door de stappen te volgen die in de tekst worden beschreven, gebruikt u de testtracker van de telefoonapp om de NFC-halsbandtag van de boom te scannen en deze te koppelen aan de NFC-cliptag op de monsterzak. Draai in een goed gedesinfecteerde zuurkast de schakelaar aan de achterkant van de weefselextractorbasis om. Zorg ervoor dat de schakelaar aan de linkerkant van de doos aan de bovenkant is ingedrukt en wacht tot de knipperende groene LED aangeeft dat de kamer klaar is.

Om de AHO-kamer voor te bereiden, bevestigt u een lege monsterzak aan de achterkant van de kamer door deze met een O-ring aan het achtermondstuk te bevestigen. Inspecteer het mes op tekenen van slijtage of schade, zoals snijwonden op het mes dat doorloopt in het plastic of snijwonden op de punt. Zorg ervoor dat de pijl op het blad in lijn ligt met het enkele slotsymbool en dat de luchtafgifte aan de onderkant van de kamer naar het O-symbool is gedraaid.

Plaats het doorzichtige deksel over de kameropening. Gebruik de baan aan de rechterkant van de kamer en schuif de doorzichtige AHO-schuif op de kamer en druk het slot aan de onderkant van de kamer zo ver mogelijk in de glijbaan. Zorg ervoor dat de zuigerdop aan de bovenkant van de glijbaan is gemonteerd.

Om de AHO-kamer op de AHO-basis te laden, plaatst u de voorbereide kamer op de basis met het AHO-basismondstuk dat in de achterkant van de kamer steekt. Laad het monster op de AHO-basis door de witte sticker op de NFC-cliptag in een langzame cirkelvormige beweging naar een Z aan de rechterkant van de doos te verplaatsen totdat het gele lampje begint te knipperen. Nadat u het monster aan de basis hebt bevestigd, moet u ervoor zorgen dat er geen gaten in de monsterzak zitten.

Plaats vervolgens de O-ring over de monsterzak om deze aan de voorkant van het AHO-mondstuk te bevestigen. Om de ongebruikte spuitset te laden, scheurt u eerst de spuitset. Plaats vervolgens de ongebruikte spuitset op de weegschaaltoren.

Verwijder de spuitset wanneer een rood lampje begint te knipperen of wanneer de weegschaal nul aangeeft. Verwijder de zuiger met het filter uit de spuit en zorg ervoor dat de vloeistof in de onderste spuit blijft. Plaats de zuiger op een papieren handdoek of de toren, waar deze geen oppervlak raakt.

Bevestig ten slotte de spuit aan de schuifuitgangspoort door de uitgangspoort in de spuit te drukken en deze 90 graden te draaien. Om te beginnen met het verwerken van het knophoutmonster, drukt u op de bovenste zwarte knop om de machine te starten. Pak een knopenhouten stokje uit de zak en steek deze door de bovenkant van het AHO-mondstuk.

Pak de knophouten stok aan de andere kant van de kamer met de andere hand en schuif langzaam naar beneden in het mes. Beweeg het knophout langzaam heen en weer terwijl je het draait. Wanneer een licht gezoem wordt gehoord, beweegt u de tak dieper in de machine om u op het floëem te concentreren.

Nadat u hetzelfde voor alle takken hebt voltooid, drukt u op de bovenste zwarte knop om de verwerking te stoppen en wacht u tot het lampje weer geel begint te knipperen. Om het gewicht van het monster te controleren, draait u de spuit 90 graden en trekt u deze naar beneden. Plaats de zuiger terug op de spuit en plaats de spuit op de toren.

Nadat de weegschaal het monster automatisch detecteert, geeft een groene LED die knippert aan dat het monstergewicht binnen het juiste bereik ligt. Als het rode lampje knippert en aangeeft dat het monster een te laag monstergewicht heeft, herhaalt u de monsterverwerking. Als het gewicht te hoog is, verwijdert u enkele monsters en wordt het knipperen van de gele LED langzamer.

Om het monster te homogeniseren, verwijdert u de zuiger uit de spuit met het monster. Duw de vloeistof in de spuit en plaats de zuiger terug. Duw op de zuiger om de buffer te passeren en plant sap door het gaasfilter via de rubberen slang in de lege spuit.

Meng het monster door de buffer te duwen en plant sap drie tot vier keer heen en weer van de ene spuit naar de andere totdat het monster verandert in een homogene groene vloeistof. Eenmaal goed gehomogeniseerd, duwt u het plantensapmonster in de spuit zonder het gaasfilter en maakt u de rubberen slang en de spuit met het filter ervan los. Haal vervolgens het plantensapmonster uit de spuit in een steriele microcentrifugebuis van twee milliliter.

Nadat u het monster met het zaknummer hebt geëtiketteerd met behulp van een permanente marker, bewaart u het bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. Ontsmet de AHO-verwijderbare kamer nadat het 10e monster is verwerkt en de groene LED blijft knipperen in plaats van blauw te worden. Om de kamer te demonteren en alle verontreinigingen te reinigen, verwijdert u de doorzichtige plastic afdekking, de doorzichtige kamerschuif en de klompenpoort op de kamerschuif.

Draai vervolgens de luchtafvoerklep aan de onderkant van de kamer naar het open hangslot. Nadat u de kamercomponenten in de ultrasone reiniger hebt geplaatst, plaatst u de kamer in het bad met het deksel eronder om te voorkomen dat het deksel zweeft. Laat de ultrasone reiniger 15 minuten draaien.

Spoel de kamercomponenten gedurende ten minste 30 seconden in het waterbad voordat u de kameronderdelen naar het droogstation verplaatst. Om te beginnen met drogen, plaatst u het luchtpistool in lijn met de groef van de bovenste opening van de kamer en drukt u op de trekker van het pistool om gedurende ongeveer 30 seconden lucht af te geven. Draai het luchtpistool naar de bovenste spuitmonden van de kamer en na het indrukken van de trekker, traceer langzaam drie volledige cirkels van elke mondstukingang.

Plaats het luchtpistool in het midden van de BE en houd vanaf het binnenste punt de trekker ingedrukt en beweeg totdat het luchtpistool naar de glijbaan wijst. Laat snel lucht over de hele kamer voor en achter lopen om het oppervlaktewater van de buitenkant te krijgen. Vergelijking van de AHO en het conventionele laboratoriumprotocol voor de verwerking van citrusweefsel gaf aan dat de geëxtraheerde nucleïnezuurconcentraties die werden bepaald door de absorptie op 260 nanometer te meten, in beide gevallen vergelijkbaar waren.

De zuiverheid van de nucleïnezuren geëxtraheerd door de AHO, bepaald als de verhouding van de absorpties op 260 en 280 nanometer was hoog met een lage eiwitverontreiniging. De nucleïnezuurintegriteit geanalyseerd door RT-qPCR gericht op het mRNA van het citrus NADH-dehydrogenase-gen was zeer vergelijkbaar voor zowel AHO als het standaard handmatige protocol. De conventionele laboratoriumprocedure vereiste bijna zeven tot 10 minuten voor het met de hand hakken per monster en meer tijd voor weefselverwerking, inclusief vriesdrogen, malen en centrifugeren.

De AHO verwerkte echter elk monster voor een nucleïnezuurextractie in drie minuten, inclusief voorbereidings-, weeg- en reinigingsstappen. Geen van de 72 gezonde monsters van de eerste AHO-monsterverwerking produceerde amplificatiecurves voor de geteste citruspathogenen, waardoor de AHO-verwerking van citrusweefsel werd gevalideerd. In de tweede AHO-monsterverwerking, met twee geïntroduceerde mix-geïnfecteerde monsters, toonden de geëxtraheerde nucleïnezuren de aanwezigheid van verschillende citrusvirussen en viroïden in batches één en vijf.

Er werden echter geen kruisbesmetting tussen hoofden of vals-positieve of negatieve resultaten gedetecteerd. Tijdens de verwerking kan het te lang op één plaats laten staan van de tak te diep in de tak snijden, waardoor de kans op verstopping toeneemt en acellulair vezelachtig materiaal wordt verzameld. Eenmaal verwerkt, is het materiaal klaar voor de meeste DNA- en RNA-extractie- en zuiveringsprotocollen en kan het worden getest met elke moleculaire detectietest voor plantpathogenen.

De ontwikkeling van de Budwood Tissue Extractor opende de deur naar een gebied met een hoge doorvoer en een scherming in het hele bos. Samen met de Leaf Tissue Extractor maakt het het mogelijk om op grote schaal plantenweefsels te verwerken die voorheen als moeilijk te verwerken werden beschouwd, zoals wortels en steeltjes.