Volledige neonatale cochleaire explantaten als een in vitro model

Dit protocol bevat een eenvoudige aanpak om kweekstappen te stroomlijnen, explantaten van hoge kwaliteit te verkrijgen en zal bijdragen aan het verkennen en onthullen van moleculaire mechanismen van cochleaire cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de minimale directe behandeling van organen door het coördineren van de dissectiestappen, de juiste polymeeroppervlaktecoating, het geoptimaliseerde gemiddelde volume en de hechtingstijd van de explantaten. Deze techniek is een populaire in-vitrobenadering om perceptief gehoorverlies te bestuderen.

Dit kan worden gebruikt om ototoxische modellen op te stellen, structurele analyses uit te voeren, signaalroutes te evalueren en onderzoeken naar geneesmiddelenscreening uit te voeren. In principe kan deze methode worden toegepast op verschillende weefsels explantaties. Het kan ook worden gebruikt bij onderzoek naar het binnenoor om inzicht te krijgen in embryonale ontwikkelingsstadia.

Plaats om te beginnen de kop van de onthoofde rat op het steriele kussentje. Gebruik een schaar en een tang om de onderkaak te verwijderen, til vervolgens de huid op en pel deze terug van de schedel. Plaats de pincet in de orbitale holtes om de schedel vast te houden.

Snijd met een scherp scalpelmesje voorzichtig de schedel langs de sagittale hechting en vervolgens het coronale hechtgebied zonder het slakkenhuis te beschadigen. Verwijder nu de hersenen van de twee schedelhelften. Lokaliseer onder de microscoop het slakkenhuis in het slaapbeen en maak het omringende weefsel tussen het slakkenhuis en het slaapbeen los.

Plaats vervolgens de pincet in het superieure halfcirkelvormige kanaal. Trek het slaapbeen voorzichtig weg van het slakkenhuis en houd het slakkenhuis vast aan de vestibule met het slaapbeen. Steek de punten van de pincet in het topgebied dat zichtbaar is als een witte lijn, en verwijder het kraakbeenachtige cochleaire kapsel stuk voor stuk om het cochleaire kanaal bloot te leggen.

Plaats de tang onder het slakkenhuis en maak ze los van het evenwichtsorgaan en het slaapbeen. Breng het slakkenhuis over in een nieuwe schaal van 60 millimeter met ijskoude PBS. Om Corti-explantatieorganen te isoleren, houdt u het orgaan aan de basis en het cochleaire kanaal bij het basale haakgebied vast en wikkelt u het cochleaire kanaal voorzichtig af van de modiolus zonder het te scheuren.

Houd vervolgens de ductus cochlearis aan de basis vast en trek het spiraalligament en de stria vascularis weg. Voor het isoleren van cochleaire explantaten, gebruikt u een pincet om het spiraalvormige ganglion los te maken van de ossale spiraallamina en wikkelt u de modiolus af tijdens het losmaken. Pak met een tang het haakgebied vast en verwijder het spiraalligament met de stria vascularis.

Trek verder het membraan van Reissner stuk voor stuk los. Om de cochleaire explantaten over te brengen, dompelt u een laboratoriumspatel in de schaal met de explantatie. Til de explantatie op met de haarcellen naar boven gericht, samen met een paar microliter PBS door met een spatel te zwaaien.

Plaats de explantatie in een kamerglaasje met acht putjes door zachtjes met de spatel in het medium te zwaaien. Laat de explantatie in de kamer glijden. Verwijder met een pipet van 100 microliter 80 microliter medium en gooi het weg.

Controleer de zichtbaarheid van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuroncellen onder de microscoop. Gebruik indien nodig een tang om overlappend weefsel uit elkaar te duwen. Verwijder het resterende medium uit het putje.

De explantatie zal nu vlakker op het oppervlak van de kamer liggen. Na 10 seconden pipet u een of twee druppels van het medium net naast de explantatie en het resterende medium op enige afstand om loslating van de explantatie te voorkomen. Zorg ervoor dat de explantaten niet bewegen tijdens het toevoegen van het medium.

Incubeer de kamer gedurende twee uur om de organen stevig aan de bodem van de kamer te bevestigen. Na incubatie het medium opzuigen. En voeg met een pipet van 100 of 200 microliter voorzichtig 300 microliter vers, voorverwarmd compleet medium toe.

De confocale microscopische beelden van de draaiende schijf toonden aan dat het rattenorgaan van Corti explantaten hun structuur en totale lengte behielden onder zowel normale als gestreste omstandigheden. Bovendien toonde een confocale scanmicroscoop overlevende haarcellen van explantaten van de muizenorganen aan, samen met haarcellen die apoptose ondergingen. Het protocol maakte het mogelijk om biologische processoren in levende cochleaire cellen te monitoren met behulp van geschikte celdoorlatende sondes en een confocale microscoop met draaiende schijf.

De kweek van deze cochleaire explantaten verbetert de analyse van de interactie tussen haarcellen en spiraalvormige ganglioncellen. De haarcellen van cochleaire implantaten werden gedetecteerd met de haarcelmarker MYO7A. Evenzo werden gezonde en beschadigde spiraalvormige ganglioncellichamen en neurieten geïdentificeerd met behulp van de neuronale marker, Tuj 1.

In het vergrote overzicht waren de cellichamen van de haarcellen met het MYO7A-antilichaam zichtbaar. Stereocilia van de buitenste haarcellen en gedeconvolueerde beelden van individuele stereocilia van de binnenste haarcellen gelabeld met falloidine werden geïdentificeerd. Voorzichtigheid is geboden tijdens de procedures onder de microscoop, vooral bij het scheiden van het spiraalvormige ganglion van de botachtige spiraallamina.

De intacte explantaten moeten zorgvuldig worden overgebracht en uitgelijnd. Dit protocol optimaliseerde in-vitro-onderzoeken naar explantaten in het binnenoor. De uitkomsten van deze onderzoeken, zoals signaalroutes en toxiciteit van geneesmiddelen, kunnen als leidraad dienen voor het ontwerp van verdere in-vivo-onderzoeken.