Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen
21 april 2023
Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.
Mijn onderzoek richt zich op neurale codering en mechanismen voor visuele verwerking. We proberen een antwoord te vinden op de vraag hoe verschillende informatie in de hersenen wordt gecodeerd, met name in de superieure colliculus onder de onderliggende neuromechanismen. Om visuele verwerking te begrijpen, combineren wetenschappers verschillende benaderingen, waaronder neuronale morfologie, antegrade en retrograde tracing, IL-sequencing, neuromodellering, machine learning, wordt goed begrepen.
De uitdaging is om de schedel over de SSA te verwijderen, snijden en in het bot in één groter stuk laten, zal waarschijnlijk mislukken omdat het bot aan de dura is bevestigd. Door twee foto's te combineren op een calciumbeeld met een breed veld, onthulde ons recente werk de functiearchitectuur van bewegingsrichting in de SC van de muis bij zowel een enkele celresolutie als een globale schaal. We ontdekten dat neuronen met een vergelijkbare voorkeur patches vormen tot 500 micrometer onder globaal naar boven op de nasale beweging.
Met ons protocol pakken we twee lacunes in het onderzoek aan. Ten eerste kunnen onderzoekers langdurige castbeeldvorming uitvoeren in SC van muizen met een enkele celresolutie zonder de cortex te breken. Ten tweede kunnen onderzoekers de neuroactiviteit over de hele SC registreren met behulp van widefield microscoping.
Ons protocol biedt een maat om de posterieure mediale SC in beeld te brengen met een resolutie van één cel met een intacte cortex bij muizen. Ook gebruiken we een biocompatibele plug om de SC bloot te leggen, wat infectie vermindert voor chronische beeldvorming. Onze resultaten bieden een manier om de neurale codering van visuele informatie over een groot gezichtsveld te bestuderen.
In combinatie met optogenetica kan men de helft van de input van verschillende hersengebieden bestuderen die de neuroactiviteit in SC moduleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie biedt een protocol voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkeren muizen, waarbij twee-fotonenmicroscopie wordt gebruikt om de activiteit van individuele neuronen vast te leggen terwijl de cortex behouden blijft bij wild-type muizen, en breedveldmicroscopie wordt ingezet voor de gehele SC bij muizen met een partiële cortexmutatie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Visuele Verwerking
Achtergrond
- De colliculus superior speelt een cruciale rol bij de verwerking van visuele informatie.
- Het begrijpen van de neuronale codering in de SC is essentieel voor het ontrafelen van de mechanismen van visuele verwerking.
- Eerdere beeldvormingsmethoden kunnen de corticale integriteit verstoren, wat langetermijnregistratiestudies bemoeilijkt.
- Dit protocol beoogt deze uitdagingen aan te pakken door een minimaal invasieve benadering voor beeldvorming te bieden.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor langetermijn calcium-imaging in de SC van de muis.
- Om de registratie van neuroactiviteit over de gehele SC te vergemakkelijken zonder de cortex te verstoren.
- Om het begrip te vergroten van hoe visuele informatie op neuronaal niveau in de SC wordt gerepresenteerd.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van tweefoton- en breedveldmicroscopietechnieken.
- Er worden wildtype- en mutante muismodellen gebruikt, waarbij een adeno-geassocieerd virus wordt ingezet om GCaMP6m tot expressie te brengen voor calcium-imaging.
- Belangrijke methodologieën omvatten de implantatie van een hoofdfixatieplaat, chirurgische benaderingen om het ruggenmerg (SC) bloot te leggen en het gebruik van een zuignap voor chronische imaging.
- Na de virale injectie wordt een herstelperiode van drie weken aangehouden voordat de imaging begint.
- Gedetailleerde chirurgische stappen zorgen voor minimale schade aan het omringende weefsel.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol maakt een gedetailleerd onderzoek mogelijk van neuronale activiteit die geassocieerd is met voorkeuren voor bewegingsrichting binnen de SC.
- Bevindingen wijzen erop dat neuronen met vergelijkbare voorkeuren kunnen clusteren, wat de verwerking van visuele signalen over uitgestrekte gebieden beïnvloedt.
- Chronische beeldvorming is mogelijk terwijl de corticale integriteit behouden blijft, wat voortdurende studies naar neuronale dynamiek faciliteert.
- Door beeldgegevens te combineren met optogenetica kunnen modulerende input van andere hersengebieden worden onderzocht.
Conclusies
- Deze studie introduceert een robuuste methode om calciumsignalering in de SC te analyseren, wat aanzienlijk bijdraagt aan het begrip van mechanismen van visuele verwerking.
- De beschreven beeldvormingstechnieken bieden kansen voor vooruitgang in longitudinale studies naar neuronale activiteit bij wakkere dieren.
- Dergelijke methodologieën zullen het onderzoek naar neuronale mechanismen en hun implicaties voor visueel gedrag en stoornissen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Hoge-resolutie calcium-imaging in de superieure colliculus (SC) van de muis maakt directe bevraging mogelijk van de neurale codering die ten grondslag ligt aan visuele verwerking, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie tijdens de fase van targetvalidatie. De mogelijkheid om zowel single-cell- als gehele structuuractiviteit bij wakker dieren vast te leggen, biedt voorspellend vertrouwen voor translationele neurowetenschappen en neurofarmaceutische portfolio's. Deze dual-scale benadering versterkt vroege ontdekkingsbeslissingen en informeert de verdere ontwikkeling van assays voor targets in het visuele systeem.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele mapping van visuele verwerkingscircuits op cellulair en netwerkniveau mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door onderscheid te maken tussen overgeërfde versus de novo neurale codering in de SC.
- Levert kwantitatieve neurale activiteitsgegevens ter ondersteuning van doelwitselectie en -validatie.
- Faciliteert hypothese-gestuurde analyse van de codering van visuele kenmerken in ziekte-relevante systemen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde beeldvormingsplatforms vast voor reproduceerbare meting van neuronale responsen.
- Levert kwantitatieve, schaalbare read-outs die geschikt zijn voor compound-screening in modellen van de visuele baan.
- Maakt standaardisatie van assaycondities mogelijk voor vergelijkbaarheid tussen studies en teams.
- Ondersteunt de ontwikkeling van robuuste fenotypische screeningassays voor neuroactieve verbindingen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt neurale activiteitsmetingen uit met translationele biomarkers van de visuele functie.
- Zorgt voor continuïteit van neurale codering in de ontdekkingsfase naar preklinische validatie van interventies in het visuele systeem.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van targets in het visuele pad mogelijk op basis van functionele in vivo-gegevens.
- Ondersteunt mechanistische studies naar circuitmodulatie met behulp van optogenetische integratie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit beeldvormingsprotocol slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-testen, pathway-verduidelijking en kwantitatieve analyses in de SC mogelijk te maken. Het is gepositioneerd voor integratie vanaf target-validatie tot lead-identificatie en translationele studies.
- Discovery Biology: Faciliteert directe meting van neurale codering en pathway-functie in de SC.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert high-content data over neuronale activiteit, wat statistische vergelijking van experimentele condities ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vivo neurale activiteit met potentiële biomarkers voor stoornissen in het visuele systeem.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar imaging-platform dat aanpasbaar is aan andere hersengebieden en onderzoeksvragen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar visuele verwerking.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende studies heen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en de kapitaalefficiëntie door vroeg in de pipeline robuuste functionele gegevens te leveren.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets in het visuele systeem mogelijk en ondersteunt beslissingen over verdere ontwikkeling met kwantitatief bewijs.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in in vivo beeldvorming, chirurgische voorbereiding en data-analyse.
- Vereist toegang tot twee-fotonen- en wide-field microscopieplatformen en de bijbehorende infrastructuur.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor de omgang met dieren, virale aflevering en beeldvormingsprotocollen.
- Aanpasbaar naar andere hersenregio's met protocolwijzigingen, zoals ondersteund door de bron.
- Stabiliteit van beeldvorming op lange termijn en nauwkeurige targeting zijn praktische overwegingen voor chronische studies.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
