Name: Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Leer zuurstofonafhankelijke assays om mitochondriale functie bij zoogdieren te meten met behulp van massaspectrometrie en stabiele isotooptracering. Deze methoden onthullen hoe mitochondriën zich aanpassen aan hypoxische stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De figuren die in dit handschrift zijn geproduceerd, zijn met BioRender.com gemaakt. We zijn Amy Walker dankbaar voor het geven van feedback op dit artikel. J.B.S. werd ondersteund door de Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.

Stabiele isotopentracering en LC-MS-analyse om DHODH- en SDH-activiteiten te meten

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
<li>Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+growth+of+cancer+cells+in+media+in+which+glucose+is+replaced+by+galactose%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose.</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-deficient+human+fibroblasts+exhibiting+defective+mitochondrial+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication.</a> Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).</li>
<li>Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+auxotrophy+for+pyrimidines+of+respiration-deficient+chick+embryo+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).</li>
<li>Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+metabolism+using+LC-MS+and+isotope+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers.</a> Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).</li>
<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Xiao, Y., Meierhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+hydroethidine-based+probes+reliable+for+reactive+oxygen+species+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).</li>
<li>DeBerardinis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+aerobic+glycolysis%3A+Transformed+cells+can+engage+in+glutamine+metabolism+that+exceeds+the+requirement+for+protein+and+nucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).</li>
<li>Keeley, T. P., Mann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+physiological+normoxia+for+improved+translation+of+cell+physiology+to+animal+models+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).</li>
<li>Ast, T., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+mammalian+cell+culture%3A+Are+we+repeating+the+experiment+of+Dr.+Ox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).</li>
<li>Gu, C., Jun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+hypoxia+decrease+the+metabolic+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Does hypoxia decrease the metabolic rate.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 668(2018).</li>
<li>Voorde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+metabolic+fidelity+of+cancer+models+with+a+physiological+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium.</a> Scientific Advances. 5 (1), 7314(2019).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+medium+rewires+cellular+metabolism+and+reveals+uric+acid+as+an+endogenous+inhibitor+of+UMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase.</a> Cell. 169 (2), 258-272 (2017).</li>
<li>MacPherson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+T+cell+expansion+media+activate+distinct+metabolic+programs+uncoupled+from+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function.</a> Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).</li>
<li>Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+cell+culture+media+tune+mitochondrial+bioenergetics+and+drug+sensitivity+in+cancer+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models.</a> Cancers. 14 (16), 3917(2022).</li>
<li>Chan, S. W., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mtDNA+damage+using+a+supercoiling-sensitive+qPCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).</li>
<li>Doherty, E., Perl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+mass+by+flow+cytometry+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Reactive+Oxygen+Species%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress.</a> Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).</li>
<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
<li>Lee, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+studies+of+isolated+mitochondria+from+normal+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Aangezien opkomend onderzoek aantoont dat mitochondriën van zoogdieren kunnen functioneren zonder moleculaire zuurstof te verbruiken, is het van het grootste belang voor onderzoekers om orthogonale assays te gebruiken, naast OCR-metingen, om de mitochondriale functie nauwkeurig te kwantificeren. Hier hebben we een reeks assays samengesteld die kunnen worden gebruikt om de activiteiten van complexe I, complex II, complexe V en DHODH direct te beoordelen door de mitochondriale NAD + / NADH-balans te meten, het gebruik van adaptieve terminale elektronenacceptoren, de productie van ATP, de novo pyrimidine biosynthese en mitochondriale afgeleide ROS. Met name meten deze assays directer de mitochondriale functie dan OCR-metingen. Bovendien bieden deze testen onderzoekers verhandelbare manieren om de mitochondriale functie tijdens hypoxie te kwantificeren, waarvoor OCR-metingen grotendeels irrelevant zijn omdat fumaraat wordt gebruikt als de favoriete terminale elektronenacceptor. Ten slotte zijn de proliferatie-gebaseerde methoden die hier worden beschreven kosteneffectiever dan klassieke respirometrie-experimenten, waardoor ze een breed toegankelijke manier bieden om de mitochondriale functie in zoogdiersystemen te bestuderen.
Er zijn belangrijke overwegingen bij het gebruik van deze testen om de mitochondriale functie in gekweekte cellen te meten. Met betrekking tot de proliferatietests is het belangrijk om het aantal gezaaide cellen aan te passen voor de verdubbelingssnelheid van elke cellijn. De cellen moeten worden gezaaid tot ten minste 10% samenvloeiing en met voldoende ruimte om drie tot vier verdubbelingen mogelijk te maken, zodat verschillen in proliferatie kunnen worden gekwantificeerd. Een andere overweging voor elke test is de concentratie van de kleine moleculen die worden gebruikt als controles voor de activiteiten van elk ETC-complex. Omdat verschillende cellijnen verschillende gevoeligheden voor deze remmers kunnen vertonen, is het van cruciaal belang om de dosis van deze kleine moleculen te testen om de optimale concentratie te bepalen.
Een universele beperking van assays die de mitochondriale functie in vitro bestuderen, inclusief OCR-metingen en alle hier beschreven assays, is de metabole samenstelling van het kweekmedium. Standaard celkweekmedium heeft de neiging om systemen te vertekenen in oppervlakkig hoge niveaus van mitochondriale functie. Suprafysiologische glutamineniveaus verhogen bijvoorbeeld de anaplerose van de TCA-cyclus25, die de mitochondriale NADH-synthese voedt en bijgevolg de oxidatieve fosforylering verhoogt. Evenzo varieert de partiële druk van zuurstof tussen 3 mmHg en 100 mmHg (ongeveer 0,1%-13% O2) in weefsels van zoogdieren, maar is atmosferisch (140 mmHg, ongeveer 21%) in vitro26,27. Deze overmaat O2 maximaliseert de mitochondriale ademhalingscapaciteit en superoxideproductie28. Onlangs zijn er pogingen gedaan om cultuurmedia te ontwerpen om meer fysiologischte zijn 29,30. Met name het kweken van cellen in menselijke plasma-achtige media vermindert de mitochondriale ademhaling in sommige kankercellijnen30, mitochondriale ROS in T-cellen 31 en mitochondriale aanpassingen aan kankertherapieën32. Het is dus van cruciaal belang om rekening te houden met de samenstelling van de gebruikte cultuurmedia en te begrijpen hoe dit de mitochondriale functie kan beïnvloeden.
Een andere belangrijke en universele beperking in de interpretatie van mitochondriale functie is het potentieel voor verschillen in het aantal mitochondriën. Het is daarom van cruciaal belang om het mitochondriale gehalte te meten door middel van de kwantificering van mtDNA33, de meting van mitochondriale massa met membraanpotentiaalongevoelige kleurstoffen34, of western blotting van mitochondriale markers. Dit is een kritische controle, zodat een afname van het aantal mitochondriën niet wordt verward met een afname van de mitochondriale functie.
Er zijn ook specifieke beperkingen en probleemoplossing die van toepassing zijn op de hier beschreven testen. Ten eerste, aangezien gedifferentieerde cellen niet prolifereren, zullen de op proliferatie gebaseerde assays niet nuttig zijn voor het beoordelen van de mitochondriale functie in deze context. Een belangrijke beperking van het 13C 4-aspartaat traceringsprotocol om DHODH-activiteit te meten, is dat de opname van aspartaat in cellen extreem inefficiënt kan zijn35. Om deze potentiële beperking te overwinnen, kunnen onderzoekers de aspartaattransporter, SLC1A3, overexpressie om 13C 4-aspartaatopname35 te vergemakkelijken.
Een beperking van het protocol met behulp van 13C5-glutamine tracing om SDH-activiteit te meten, is dat deze test vereist dat cellen de reductieve carboxyleringsroute gebruiken om de M + 3-isotopologen te verrijken om de omgekeerde activiteit te meten. Sommige cellijnen zijn niet in staat tot reductieve carboxylatieflux als gevolg van lage ATP-citraatlyase-expressie36, onvoldoende HIF-stabilisatie 37 of een α-KG: citraatverhouding die te laag is38. Om deze beperking te overwinnen, zou men 13C 4-aspartaat tracing kunnen gebruiken om de SDH voorwaartse en omgekeerde activiteiten te meten7. In deze test kan de SDH-voorwaartse activiteit worden gemeten aan de hand van de verhouding fumaraat M+2:succinaat M+2 en de omgekeerde reactie door succinaat M+4:fumaraat M+4. Met name omzeilt deze tracering de meeste enzymen in de reductieve carboxyleringsroute.
Een beperking van de complexe I-activiteitstest met DCPIP-reductie als uitlezing is dat de mitochondriën niet structureel intact zijn. Het proces van het bevriezen en ontdooien van de mitochondriën om hun NADH-opname voor de test mogelijk te maken, kan zeker de structurele integriteit van het mitochondriale membraanaantasten 39. Deze test moet parallel worden uitgevoerd met assays zoals de complex I-proliferatietest om ervoor te zorgen dat de waargenomen veranderingen in complexe I-activiteit ook waar zijn met intacte cellen.
In toekomstige studies kunnen sommige van deze technieken worden aangepast voor het meten van mitochondriale functies in vivo met behulp van modelorganismen zoals muizen en Caenorhabditis elegans. De huidige methoden die worden gebruikt om de mitochondriale functie in vivo te meten, zijn gericht op OCR op organismeniveau, met name de ademhalingswisselkoers bij het gebruik van muismodellen. Een duidelijke beperking van deze methode is dat zuurstof veel biochemische en signalerende functies heeft die verder gaan dan zijn rol als alomtegenwoordige terminale elektronenacceptor in het mitochondriale ETC. Zuurstof wordt bijvoorbeeld "verbruikt" door de katalytische activiteit van enzymen in de dioxygenasefamilie. Hoewel deze enzymen bijdragen aan het cellulaire zuurstofverbruik, nemen ze niet deel aan, reguleren of weerspiegelen ze de mitochondriale functie niet. Klassieke respirometrie-experimenten in vitro controleren meestal op "niet-mitochondriale OCR", terwijl organismale respiratoire uitwisselingsratio (RER) -experimenten dit niet kunnen controleren, waardoor de interpretatie van RER als een metriek voor mitochondriale functie in vivo wordt beperkt. Het is echter mogelijk om de protocollen aan te passen om DHODH-activiteit te meten via 13 C 4-aspartaattracering, complexe II-activiteit via 13C5-glutaminetracering, complexe I-activiteit op mitochondriën gezuiverd uit weefsels en mitochondriale ROS met behulp van LC-MS-vriendelijke verbindingen zoals MitoB om de mitochondriale functie in vivo te meten . Deze directe testen om mitochondriale functies te ondervragen, in combinatie met klassieke respirometrie-experimenten, bieden onderzoekers een uitgebreidere en nauwkeurigere beoordeling van de mitochondriale functie in zoogdiercellen en -weefsels.

Mitochondriale functie is een kritische metriek van cellulaire gezondheid, omdat het belangrijke biosynthetische, bio-energetische en signaleringsfuncties in zoogdiercellen ondersteunt1. De overgrote meerderheid van mitochondriale functies vereist elektronenstroom door de elektronentransportketen (ETC) en verstoringen in de elektronenstroom in de ETC veroorzaken ernstige mitochondriale ziekte2. De ETC bestaat uit een reeks reductie- en oxidatiereacties (redox) die zijn ingebed in het binnenste mitochondriale membraan, en deze elektronenoverdrachtsreacties geven vrije energie vrij die kan worden gebruikt om ATP-synthese, fysiologische processen zoals thermogenese, biosynthetische routes zoals de novo pyrimidine biosynthese en de balans van de redoxstatus van co-factoren zoals NADH te ondersteunen. ETC-complex I en III produceren reactieve zuurstofsoorten (ROS)3,4,5, die op hun beurt signaalroutes zoals HIF, PI3K, NRF2, NFκB en MAPK 6 reguleren. Bijgevolg worden metrieken van elektronenstroom in de ETC klassiek gebruikt als een proxy voor mitochondriale functie in zoogdiercellen.
Respirometrie-experimenten worden vaak gebruikt om de mitochondriale functie in zoogdiercellen te meten. Aangezien O2 de meest alomtegenwoordige terminale elektronenacceptor is voor het ETC van zoogdieren, wordt de reductie ervan gebruikt als een proxy voor de mitochondriale functie. Opkomend bewijs toont echter aan dat mitochondriën van zoogdieren fumaraat kunnen gebruiken als elektronenacceptor om mitochondriale functies te ondersteunen die afhankelijk zijn van de ETC, waaronder de novo pyrimidine biosynthese 7, NADH-oxidatie7 en de ontgifting van waterstofsulfide8. In bepaalde contexten, vooral in hypoxische omgevingen, geven metingen van de O2-consumptiesnelheid (OCR) dus geen nauwkeurige of nauwkeurige indicatie van de mitochondriale functie.
Hier schetsen we een reeks testen die kunnen worden gebruikt om de mitochondriale functie onafhankelijk van de OCR te meten. We bieden assays om direct complexe I-gemedieerde NADH-oxidatie, dihydroorotaatdehydrogenase-gemedieerde de novo pyrimidine biosynthese, complexe V-afhankelijke ATP-synthese, de netto directionaliteit van het succinaatdehydrogenase (SDH) complex en mitochondriaal afgeleide ROS te meten. Deze testen zijn bedoeld om te worden uitgevoerd op gekweekte zoogdiercellen, hoewel veel kunnen worden aangepast om mitochondriale functies in vivo te bestuderen.Met name de assays beschreven in dit protocol zijn meer directe metingen van mitochondriale functies dan de OCR. Bovendien maken ze het mogelijk om de mitochondriale functie bij hypoxie te meten, een context waarin de OCR geen indicatieve meting is. Samen zullen deze testen, in combinatie met klassieke respirometrie-experimenten, onderzoekers een uitgebreidere beoordeling van de mitochondriale functie in zoogdiercellen bieden.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;1.5 mL tube</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tube</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Cell Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-aspartate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 mm tissue culture dish</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-buffered saline</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dichlorophenolindophenol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter 500 mL, 0.22 &micro;m, PES 9 9 mm membrane diameter</td><td>Cell Treat</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Cold Trap</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Tablets</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter Cups</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubiquinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-free DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-free DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide</td><td>Thermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade formic acid</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade MeOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900688</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Human Osteosarcome Cell Line 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Isotone buffer</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate-free DMEM media</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver Incubator</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu;m 150 x 2.1 mm analytical column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC guard kit</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, Pellets</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butyl hydroperoxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter Particle count and size analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

De stroom van elektronen in de mitochondriale elektronentransportketen (ETC) ondersteunt veelzijdige biosynthetische, bio-energetische en signaleringsfuncties in zoogdiercellen. Aangezien zuurstof (O 2) de meest alomtegenwoordige terminale elektronenacceptor is voor de ETC van zoogdieren, wordt de O2-consumptiesnelheid vaak gebruikt als een proxy voor de mitochondriale functie. Opkomend onderzoek toont echter aan dat deze parameter niet altijd indicatief is voor de mitochondriale functie, omdat fumaraat kan worden gebruikt als een alternatieve elektronenacceptor om mitochondriale functies bij hypoxie te ondersteunen. Dit artikel stelt een reeks protocollen samen waarmee onderzoekers de mitochondriale functie onafhankelijk van de O 2-consumptiesnelheid kunnen meten. Deze testen zijn vooral nuttig bij het bestuderen van de mitochondriale functie in hypoxische omgevingen. Specifiek beschrijven we methoden om mitochondriale ATP-productie, de novo pyrimidine biosynthese, NADH-oxidatie door complex I en superoxideproductie te meten. In combinatie met klassieke respirometrie-experimenten zullen deze orthogonale en economische assays onderzoekers een uitgebreidere beoordeling bieden van de mitochondriale functie in hun interessesysteem.

De activiteiten van DHODH, complex I en complex V kunnen allemaal worden beoordeeld met behulp van proliferatietests. Bij deprivatie van uridine uit het kweekmedium worden de cellen afhankelijker van de de novo route voor pyrimidine biosynthese. Dus wanneer cellen werden uitgedaagd om te prolifereren in een uridinevrij medium, waren ze gevoeliger voor de remming van DHODH-activiteit door brequinar dan cellen gekweekt in een medium dat uridine bevat (figuur 6A). Evenzo maakt de deprivatie van pyruvaat uit het kweekmedium de cellen afhankelijker van complexe I-activiteit voor proliferatie. Dus wanneer cellen werden uitgedaagd om te prolifereren in een pyruvaatvrij medium, waren ze gevoeliger voor de remming van complexe I-activiteit door rotenon dan cellen gekweekt in een pyruvaatbevattend medium (figuur 6B). Complexe V-activiteit kan worden beoordeeld door cellen uit te dagen om te prolifereren in een medium dat galactose bevat in plaats van glucose. Omdat galactose netto nul ATP oplevert in glycolyse, zijn cellen die in deze brandstof groeien meer afhankelijk van mitochondriale ATP-synthese via complexe V-activiteit. Cellen die zich vermenigvuldigen in een galactosebevattend medium waren dus gevoeliger voor complexe V-remming door oligomycine dan cellen die zich vermenigvuldigen in een glucosebevattend medium (figuur 6C).
SDH-activiteit kan worden gemeten met behulp van 13C 5-glutaminetracering en door de opname ervan in fumaraat- en succinaatisotopologen te monitoren. In met voertuigen behandelde omstandigheden gaf het SDH-complex de voorkeur aan de voorwaartse activiteit en was de opname van 13 C 4-succinaat in 13 C4-fumaraat hoger dan de opname van 13 C 3-fumaraat in 13C 3-succinaat (figuur 7). In met antimycine behandelde omstandigheden gaf het SDH-complex de voorkeur aan de omgekeerde activiteit en de opname van 13 C 3-fumaraat in 13 C3-succinaat was groter dan de opname van 13 C 4-succinaat in 13C 4-fumaraat (figuur 7).
De productie van superoxide in de mitochondriën kan worden gemeten met behulp van de fluorescerende reporter MitoSox, die 2-hydroxy-mitoethidium genereert na reactie met superoxide. In deze studie hadden cellen behandeld met MitoSox in de aanwezigheid van tertbutylwaterstofperoxide hogere niveaus van 2-hydroxy-mitoethidium op een manier die werd onderdrukt door de toevoeging van NAC, een antioxidant die cellulaire ROS dooft (figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Figuur 1: Mechanistische basis voor de complexe V-proliferatietest. Oxidatie van glucose en galactose via glycolyse. Glucose levert netto twee ATP op uit glycolyse, terwijl galactose netto nul ATP oplevert omdat UTP-synthese vereist is voor UDP-galactose. Cellen gekweekt in galactose zijn dus meer afhankelijk van mitochondriale ATP-synthese vanwege een gebrek aan ATP geproduceerd uit glycolyse. Afkortingen: GALK = galactokinase; GALT = galactose-1-fosfaat uridylyltransferase; PGM1 = fosfoglucomutase 1; GPI = glucose-6-fosfaatisomerase, UGP = UDP-glucosepyrofosforylase; GALE = UDP-galactose-4-epimerase; NDK = nucleotidedifosfaatkinase; UMPK = uridinemonofosfaatkinase; HK = hexokinase; PFK = fosfofructokinase; ALDO = aldolase; TPI = triosefosfaatisomerase; GAPDH = glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase; PGK = fosfoglyceraatkinase; PGM = fosfoglucomutase; ENO = enolase; PK = pyruvaatkinase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Figuur 2: Mechanistische basis voor de complexe I proliferatietest. Schema van de metabole routes die worden gewijzigd bij de remming van complexe I-activiteit. In media met een hoog pyruvaatgehalte wordt complexe I-remming omzeild via LDH-gemedieerde NADH-oxidatie. In media met een laag pyruvaatgehalte is deze aanpassing minder haalbaar, waardoor cellen meer afhankelijk zijn van complexe I-activiteit om NADH te reoxideren. Afkortingen: LDH = lactaatdehydrogenase; TCA-cyclus = tricarbonzuurcyclus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Figuur 3: Schema van de DHODH-reactie op 13C 4-aspartaattracering. Brequinar remt dihydroorotaatoxidatie tot orotaat, waardoor de stroomafwaartse synthese van UMP wordt voorkomen. 13C 4-aspartaat wordt opgenomen in 13C3-UMP via DHODH-activiteit. Afkortingen: OMM = buitenste mitochondriale membraan; IMM = binnenste mitochondriale membraan; DHODH = dihydroorotaatdehydrogenase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Figuur 4: Meten van voorwaartse en omgekeerde complexe II-activiteit via 13C5-glutamine tracing. Om de voorwaartse complexe II-activiteit (links) te meten, wordt de opname van 13 C 5-glutamine in 13 C 4-succinaat en 13C 4-fumaraat gecontroleerd. Om de omgekeerde complexe II-activiteit (rechts) te meten, wordt de opname van 13 C5-glutamine in 13 C 3-succinaat en 13C 3-fumaraat gecontroleerd. Afkortingen: SDH = succinaatdehydrogenase; CytC = cytochroom C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Figuur 5: MitoSox Rode reactie met superoxide. De reactie van MitoSox met mitochondriale superoxiden om 2-OH-MitoE2+ te vormen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Figuur 6: Proliferatie-gebaseerde assays om mitochondriale functie te meten (A) Proliferatie van 143B osteosarcoomcellen behandeld met 5 uM brequinar, een DHODH-remmer, in medium met ±100 ug / ml uridine. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM; N = 3 per voorwaarde. (B) Proliferatie van 143B osteosarcoomcellen behandeld met het 2 uM rotenon, een complex I-remmer, in medium met ±5 mM pyruvaat. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM; N = 3 per voorwaarde. (C) Proliferatie van 143B osteosarcoomcellen behandeld met de 5 uM oligomycine, een complexe V-remmer, in medium met 10 mM glucose of 10 mM galactose als enige centrale koolstofbron. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM; N = 3 per voorwaarde. * geeft p < 0,05 aan met behulp van een eenrichtings ANOVA-test in Graphpad Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Figuur 7: 13C5-glutamine tracing om complexe II-activiteit te meten. Succinaat oxidatie en fumaraat reductie (SDH reverse) in DMSO en 500 nM antimycine A-behandelde Caki1 en DLD1 cellen. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM; N = 3 per voorwaarde. geeft p < 0,05 aan met behulp van een ongepaarde t-test in GraphPad Prism. Afkortingen: SDH = succinaat oxidatie; SDH reverse = fumaraatreductie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Figuur 8: LCMS-gebaseerde MitoSox-test om superoxide te detecteren. Geëxtraheerd ionchromatogram van 2-OH-Mito E2+ geïsoleerd uit Caki1-cellen behandeld met MitoSox gedurende 30 minuten in aanwezigheid van tBuOOH ± NAC. Afkortingen: LCMS = vloeistofchromatografie-massaspectrometrie; NAC = N-acetylcysteïne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Samenstelling van reagentia, buffers en media die in dit protocol worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Ons onderzoek richt zich op hoe mitochondriën metabole stressoren waarnemen en zich eraan aanpassen. Een belangrijke metabole stressor is hypoxie, die optreedt wanneer cellen worden uitgehongerd van zuurstof. We ontwikkelen betere testen om de mitochondriale functie in zuurstofarme omgevingen te bestuderen.Hogere resolutie massaspectrometrie werd gebruikt om cel- en weefselmetabolietniveaus te bestuderen. We gebruikten stabiele isotopentraceringsstudies om het lot van specifieke metabolieten te volgen en nieuwe metabole routes te ontdekken die relevant zijn voor gezonde en zieke zoogdierfysiologie. Groep heeft ontdekt dat mitochondriën van zoogdieren kritieke functies kunnen ondersteunen in zuurstofarme omgevingen.Mechanistisch gebruiken ze fumaraat als een alternatieve elektronische scepter voor de elektronentransportketen. Dit protocol verzamelt verschillende testen die onderzoekers kunnen gebruiken om de mitochondriale functie in zoogdiercellen beter te beoordelen. Belangrijk is dat deze protocollen kunnen worden gebruikt om de mitochondriale functie bij hypoxie te bestuderen, omdat klassieke respirometrie-experimenten niet voldoende zullen zijn.

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

Leer zuurstofonafhankelijke assays om mitochondriale functie bij zoogdieren te meten met behulp van massaspectrometrie en stabiele isotooptracering. Deze methoden onthullen hoe mitochondriën zich aanpassen aan hypoxische stress.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Meer video's verkennen