Name: Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer cybrid-generatie uit kankercellen om de rol van mitochondriën in tumorgroei en metastase te onderzoeken. Deze methode onthult hoe mitochondriale genotypen bijdragen aan agressief kankergedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidienummer PID2019-105128RB-I00 aan RSA, JMB en AA, en PGC2018-095795-B-I00 aan PFS en RML, beide gefinancierd door MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 en subsidienummers B31_20R (RSA, JMA en AA) en E35_17R (PFS en RML) en gefinancierd door Gobierno de Aragón. Het werk van RSA werd ondersteund door een subsidie van de Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. De auteurs willen graag het gebruik van Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza, erkennen.

OPMERKING: Alle cultuurmedia en buffersamenstellingen zijn gespecificeerd in tabel 1. Voorafgaand aan de cybridegeneratie moeten zowel mitochondriale als nucleaire DNA-profielen van de donor- en ontvangercellen worden getypeerd om de aanwezigheid van genetische verschillen in beide genomen tussen cellijnen te bevestigen. In deze studie werd gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare L929-cellijn en de daarvan afgeleide cellijn, L929dt, die spontaan werd gegenereerd in ons laboratorium (zie13 voor meer informatie). Deze cellijnen vertonen twee verschillen in de sequentie van hun mt-Nd2-gen die kunnen worden gebruikt om de zuiverheid van mtDNA te bevestigen zodra het cybridisatieproces is voltooid13. In dit geval werd de zuiverheid van de nucleaire achtergrond bevestigd door antibioticagevoeligheid, omdat L929, in tegenstelling tot L929dt-cellen, resistent was tegen geneticine.
1. Mitochondriale depletie door rhodamine 6G-behandeling (ontvangende cellen)
OPMERKING: De eerste stap voor een succesvolle cybridegeneratie is het volledig en onomkeerbaar afschaffen van mitochondriale functies in de ontvangende cellen. Voor dit doel is het noodzakelijk om vooraf, voor elke cellijn, de juiste concentratie en behandelingsduur met rhodamine 6G te bepalen. Deze adequate concentratie moet net onder de door het geneesmiddel geïnduceerde celdood liggen (de hoogste die de cellen tijdens de behandeling niet doodt). Voer het volgende uit zodra de optimale omstandigheden zijn gedefinieerd.
<ol><li>Zaai 10 6 cellen in een6-well plaat met behulp van volledig kweekmedium (zie tabel 1 voor details) en behandel ze dagelijks met de optimale concentratie rhodamine 6G gedurende 3-10 dagen, afhankelijk van de cellijn. Traditionele concentraties variëren van 2 tot 5 μg/ml gedurende 3-10 dagen20,21. In deze studie, voor L929-afgeleide cellen, was 2,5 μg / ml rhodamine 6G gedurende 7 dagen de geselecteerde behandeling13,22.</li>
	<li>Om de cellen in leven te houden, vult u het celkweekmedium aan met 50 μg / ml uridine en 100 μg / ml pyruvaat en vernieuwt u het elke 24 uur.</li>
	<li>Verander na de behandeling en voorafgaand aan de fusie het medium van met rhodamine 6G behandelde cellen in een compleet celkweekmedium zonder rhodamine 6G en laat ze 3-4 uur in dit medium in een incubator bij 37 °C met 5% CO2. OPMERKING: Het rhodamine 6G toxische effect is onomkeerbaar en cellen met niet-functionele mitochondriën mogen niet herstellen20. Dus, na de behandeling, moeten cellen die geen functionele mitochondriën ontvangen, zelfs in met uridine aangevuld kweekmedium sterven. Daarom zou er geen nucleaire selectie nodig moeten zijn. Een controlefusie van met rhodamine 6G behandelde cellen zonder mitochondriën wordt echter aanbevolen.</li>
</ol>2. Expansie en mitochondriale isolatie (donorcellen)
<ol><li>Breid de mitochondriale donorcellen uit tijdens het tijdsverloop van rhodamine 6G-behandeling om ongeveer 25 x 106-cellen te verkrijgen.</li>
	<li>Oogst op dag 7 exponentieel groeiende cellen in een buis van 50 ml en verzamel ze door centrifugeren bij 520 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Was de cellen 3x met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en bezink ze door centrifugatie op 520 x g gedurende 5 minuten bij RT. Voer vanaf nu alle stappen van mitochondriale extractie uit bij 4 ° C, gebruik koude reagentia en houd de buizen met cellen of mitochondriën op ijs.</li>
	<li>Na de derde centrifugatie gooit u het supernatant weg door aspiratie met behulp van een glazen pipet gekoppeld aan een vacuümpomp en resuspensie u de verpakte cellen in een volume hypotone buffer dat gelijk is aan 7x het volume van de celpellet. Breng vervolgens de celsuspensie over in een homogenisatorbuis en laat de cellen opzwellen door ze gedurende 2 minuten op ijs te broeden.</li>
	<li>Breek de celmembranen door 8 tot 10 slagen uit te voeren in de homogenisator gekoppeld aan een motoraangedreven stamper die met 600 tpm draait. OPMERKING: De stap van celmembraanverstoring kan variëren tussen celtypen; Het moet dus worden geoptimaliseerd voor elk celtype.</li>
	<li>Voeg hetzelfde volume hypertone buffer toe aan de celsuspensie (7x het celpelletvolume) om een isotone omgeving te genereren.</li>
	<li>Breng het homogenaat over in een buis van 15 ml en centrifugeer het in een vaste rotor bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verzamel vervolgens slechts 3/4 van het supernatant en laat een grote marge van de pellet achter, om besmetting met kernen of intacte cellen te voorkomen en breng het over naar een andere buis. Herhaal hetzelfde proces twee keer. Merk op dat het supernatant moet worden bewaard en de pellet moet worden weggegooid.</li>
	<li>Bewaar de mitochondriale fractie (supernatant). Breng het over in buizen van 1,5 ml en centrifugeer op maximale snelheid (18.000 x g) gedurende 2 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en was de met mitochondriën verrijkte pellet met buffer A, waarbij de inhoud van de twee buizen in één wordt gecombineerd en gecentrifugeerd onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.7. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal zich in slechts één buis bevindt.</li>
	<li>Maak een extra wasbeurt met 300 μL buffer A en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test23. Voor elke cybridisatietest moet de optimale hoeveelheid mitochondriën voor de overdrachtsprocedure worden bepaald (in ons geval een concentratie tussen 10-40 μg mitochondriaal eiwit per 106 cellen).</li>
	<li>Bereid tegelijkertijd de rhodamine 6G-voorbehandelde cellen voor op de fusie door ze te verzamelen in een buis van 15 ml en te centrifugeren bij 520 x g gedurende 5 minuten bij RT. Merk op dat de pellet een neonroze kleur krijgt als gevolg van rhodamine 6G-behandeling.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat zowel mitochondriale functie-afschaffing in receptorcellen als organelzuivering van donoren correct zijn uitgevoerd, zaait u een klein aantal met rhodamine 6G behandelde cellen en geïsoleerde mitochondriën met behulp van het volledige kweekmedium in een 6-putplaat en kweekt u ze gedurende een maand om te controleren of er geen overlevende cellen in een van de putten achterblijven (figuur 2).</li>
	<li>Evalueer tegelijkertijd de afwezigheid van nuclei-contaminanten in de mitochondriale fractie door immunodetectie van nucleaire eiwitten (d.w.z. lamin bèta, histon H3, enz.) of door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) amplificatie van een nucleair gen (d.w.z. SDH, 18S-rRNA, enz.). OPMERKING: Om verontreinigingen te voorkomen, wordt aanbevolen om alle stappen in aseptische omstandigheden uit te voeren onder een laminaire stroomkap.</li>
</ol>3. Fusie en cybride generatie
<ol><li>Om door te gaan met de fusie, voegt u voorzichtig 106 van de rhodamine 6G-behandelde cellen toe aan de geïsoleerde mitochondriale pellet (10-40 μg mitochondriaal eiwit) en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 520 x g om de cellen te laten mengen met de mitochondriën.</li>
	<li>Voeg 100 μL polyethyleenglycol (PEG, 50%) toe en resuspensie de pellet voorzichtig gedurende 30 s. Laat vervolgens nog eens 30 s onaangeroerd rusten.</li>
	<li>Breng ten slotte het mengsel over in een 6-putsplaat met vers compleet celkweekmedium en plaats het in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Na een paar dagen (meestal 1 week) zouden transmitochondriale cybriden moeten beginnen te groeien (figuur 2), wat aanleiding geeft tot klonen die individueel kunnen worden geselecteerd of gemengd in een pool voorafgaand aan hun analyse.</li>
</ol>4. Verificatie van zowel mitochondriale als nucleaire achtergrond
OPMERKING: Zodra de nieuwe cellijn is vastgesteld en cellen exponentieel beginnen te groeien, moet de zuiverheid van hun mitochondriale en nucleaire DNA's worden geverifieerd. De oorspronkelijke cellijnen moeten dus verschillende mutaties of polymorfismen in hun genomen bevatten om ze herkenbaar te maken.
<ol><li>Totale DNA-isolatie<ol><li>Isoleer het genomische DNA van alle cellijnen die worden gebruikt voor het genereren van cybriden door gebruik te maken van een commerciële genomische DNA-extractiekit (zie tabel met materialen) of door een standaardprotocol uit te voeren met behulp van fenol-chloroform-isoamylalcoholextractie en alcoholprecipitatie24.</li>
	</ol></li>
	<li>mtDNA-evaluatie (figuur 3) OPMERKING: Verschillende technieken, zoals sequencing, rflp-analyse (restriction fragment length polymorphism) of allelspecifieke qPCR, kunnen worden uitgevoerd om de zuiverheid van mtDNA te analyseren. Om de aanwezigheid van mtDNA-sequentievariaties door RFLP te bevestigen, volgt u de volgende protocolstappen.<ol><li>Amplificeer een mtDNA-fragment dat de nucleotideverandering door PCR bevat.<ol><li>Hier vertonen L929dt-cellen een mtDNA-mutatie op positie 4206, binnen een mt-Nd2-gen (m.4206C>T) dat afwezig is in L929-cellen. Om de aanwezigheid van deze substitutie in de transmitochondriale cybriden te bevestigen, versterkt u een fragment van 397 bp door PCR met behulp van een standaardprotocol en de volgende primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (posities 3862-3884) en 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posities 4236-4258).</li>
		</ol></li>
		<li>Analyseer de aanwezigheid van de gewenste nucleotidesubstitutie door RFLP, met behulp van een specifieke endonuclease die de sequentieverandering herkent en een ander snijpatroon voor beide cellijnen genereert. OPMERKING: Wanneer de L929dt mtDNA-variant aanwezig is (4206T), bevat het amplicon verkregen in stap 4.2.1 twee restrictieplaatsen voor SspI (zie tabel met materialen) die drie DNA-fragmenten van 306 bp, 52 bp en 39 bp produceren. De beperkingssite die de 52- en 39-banden genereert, wordt verstoord wanneer de wild-type (WT) versie C4206 aanwezig is en een nieuwe band van 91 bp verschijnt. Daarom is een interne controle voor volledige vertering voor SspI opgenomen in de analyse. De verteringsreactie wordt uitgevoerd bij 37 °C, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Scheid de restrictiefragmenten door elektroforese en vergelijk het bandpatroon.<ol><li>Zodra de spijsvertering is uitgevoerd, analyseert u de verkregen restrictiefragmenten door elektroforese in 10% polyacrylamide-Tris-boraat-EDTA (TBE) -gels (zie tabel 1 voor 1x TBE-samenstelling). Voer de elektroforese uit op 80 V gedurende 1 uur bij RT. Visualiseer de DNA-fragmenten na gelkleuring in een oplossing van ethidiumbromide in 1x TBE gedurende 15 minuten bij RT (zie tabel 1 voor de samenstelling van de gelkleuringsoplossing).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Nucleaire DNA-genotypering OPMERKING: Nucleaire DNA-genotypering moet worden uitgevoerd met behulp van het vorige DNA-extractiemonster dat is gebruikt voor RFLP-analyse.<ol><li>Versterk 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 en AMEL) met behulp van een pool van commercieel-specifieke oligonucleotiden (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Voer elektroforese uit met behulp van een genetische analysator om de eerder verkregen fragmenten te scheiden. OPMERKING: Eenmaal versterkt, worden de verschillende loci geanalyseerd door elektroforese met behulp van een capilarsysteem (zie tabel met materialen). De fragmenten worden gescheiden in een 50 cm lange capilar gevuld met een commercieel polymeer. Kathode- en anodebuffers zijn ook in de handel verkrijgbaar, zoals weergegeven in de materiaaltabel. Elektroforese wordt uitgevoerd bij 19,5 kV gedurende 20 minuten bij 60 °C.</li>
		<li>Gebruik bioinformatica-instrumenten om de allelen te bepalen die overeenkomen met elke versterkte locus (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Vergelijk de gegevens verkregen in stap 4.3.3 met de nucleaire DNA-profieldatabank (tabel 1) om te controleren of het nucleaire DNA-profiel overeenkomt met het mitochondriale receptorcellijnprofiel (figuur 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Transmitochondriale cybrid-generatie uit suspensie-groeiende kankercellen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Sinds Otto Warburg meldde dat kankercellen hun metabolisme verschuiven en "aerobe glycolyse" versterken3,4 terwijl ze mitochondriale ademhaling verminderen, is de interesse in de rol van mitochondriën in kankertransformatie en -progressie exponentieel gegroeid. In de afgelopen jaren zijn mutaties in het mtDNA en mitochondriale disfunctie gepostuleerd als kenmerken van veel kankertypen25. Tot op heden hebben talrijke studies de mtDNA-variat...

Het herprogrammeren van het energiemetabolisme is een kenmerk van kanker1 dat voor het eerst werd waargenomen door Otto Warburg in de jaren 19302. Onder aerobe omstandigheden zetten normale cellen glucose om in pyruvaat, dat vervolgens acetyl-coA genereert, de mitochondriale machinerie voedt en cellulaire ademhaling bevordert. Niettemin toonde Warburg aan dat, zelfs onder normoxische omstandigheden, de meeste kankercellen pyruvaat verkregen uit het glycolyseproces omzetten in lactaat, waardoor ze hun weg verleggen om energie te verkrijgen. Deze metabole aanpassing staat bekend als het "Warburg-effect" en stelt sommige kankercellen in staat om te voorzien in hun energetische behoeften voor snelle groei en deling, ondanks het feit dat ATP minder efficiënt wordt gegenereerd dan het aërobe proces 3,4,5. In de afgelopen decennia hebben talrijke werken de implicatie van herprogrammering van het metabolisme in de progressie van kanker ondersteund. Vandaar dat tumor energetica wordt beschouwd als een interessant doelwit tegen kanker1. Als een centrale hub in het energetisch metabolisme en in de toevoer van essentiële voorlopers, spelen mitochondriën een sleutelrol in deze celaanpassingen die we tot op heden slechts gedeeltelijk begrijpen.
In overeenstemming met het bovenstaande zijn mitochondriale DNA (mtDNA) mutaties voorgesteld als een van de mogelijke oorzaken van deze metabole herprogrammering, die zou kunnen leiden tot een verminderde elektronentransportketen (ETC) prestaties6 en zou verklaren waarom sommige kankercellen hun glycolytische metabolisme verbeteren om te overleven. Er is inderdaad gemeld dat mtDNA mutaties in kankercellen accumuleert, aanwezig in ten minste 50% van de tumoren7. Een recente studie uitgevoerd door Yuan et al. meldde bijvoorbeeld de aanwezigheid van hypergemuteerde en afgeknotte mtDNA-moleculen in nier-, colorectale en schildklierkankers8. Bovendien hebben veel werken aangetoond dat bepaalde mtDNA-mutaties geassocieerd zijn met een agressiever tumorfenotype en met een toename van het metastatische potentieel van kankercellen 9,10,11,12,13,14,15,16.
Ondanks de schijnbare relevantie van het mitochondriale genoom in de progressie van kanker, is de studie van deze mutaties en hun bijdrage aan de ziekte een uitdaging geweest vanwege beperkingen in de experimentele modellen en technologieën die momenteel beschikbaar zijn17. Er zijn dus nieuwe technieken nodig om de echte impact van mitochondriaal DNA in de ontwikkeling en progressie van kankerziekten te begrijpen. In dit werk introduceren we een protocol voor transmitochondriale cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen, gebaseerd op de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën, dat de belangrijkste uitdagingen van traditionele cybridisatiemethoden overwint18,19. Deze methodologie maakt het gebruik van elke kerndonor mogelijk, ongeacht de beschikbaarheid van hun overeenkomstige ρ0-cellijn en de overdracht van mitochondriën van cellen die, volgens de traditionele technieken, moeilijk te enucleeren zouden zijn (d.w.z. niet-aanhangende cellijnen).

<table><tbody><tr><td>3500XL Genetic Analyzer&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4406016</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplificatiekit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4427368</td><td></td></tr><tr><td>Anode Buffer Container 3500 Series</td><td>Applied Biosystems</td><td>4393927</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>PanReac</td><td>131015</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Cathode Buffer Container 3500 Series</td><td>Applied Biosystems</td><td>4408256</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flasks</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131026</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Geneticine</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer Teflon stamper</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>L929 cel lijn</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom producten</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide Oplossing 30%</td><td>PanReac</td><td>A3626</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>POP-7</td><td>Applied Biosystems</td><td>4393714</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocatechuurzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Serum Foetale Rund</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>SspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3132</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine/penicilline</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>P14030b</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

transmitochondriale cybride generatie met behulp van kankercellijnen

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In de afgelopen jaren is het aantal studies gewijd aan het vaststellen van het verband tussen mitochondriën en kanker aanzienlijk gestegen. Er zijn echter nog meer inspanningen nodig om het verband met veranderingen in mitochondriën en tumorigenese volledig te begrijpen, evenals om tumor-geassocieerde mitochondriale fenotypes te identificeren. Om bijvoorbeeld de bijdrage van mitochondriën in tumorigenese en metastaseprocessen te evalueren, is het essentieel om de invloed van mitochondriën van tumorcellen in verschillende nucleaire omgevingen te begrijpen. Voor dit doel bestaat een mogelijke benadering uit het overbrengen van mitochondriën naar een andere nucleaire achtergrond om de zogenaamde cybride cellen te verkrijgen. In de traditionele cybridisatietechnieken wordt een cellijn zonder mtDNA (ρ0, nucleaire donorcel) opnieuw bevolkt met mitochondriën die zijn afgeleid van enucleated cellen of bloedplaatjes. Het enucleatieproces vereist echter een goede celhechting aan de kweekplaat, een kenmerk dat in veel gevallen gedeeltelijk of volledig verloren gaat in invasieve cellen. Bovendien is een andere moeilijkheid die in de traditionele methoden wordt gevonden, het bereiken van volledige verwijdering van het endogene mtDNA uit de mitochondriale ontvangercellijn om zuivere nucleaire en mitochondriale DNA-achtergronden te verkrijgen, waarbij de aanwezigheid van twee verschillende mtDNA-soorten in het gegenereerde cybride wordt vermeden. In dit werk presenteren we een mitochondriaal uitwisselingsprotocol toegepast op suspensie-groeiende kankercellen op basis van de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën. Deze methodologie stelt ons in staat om de beperkingen van de traditionele benaderingen te overwinnen en kan dus worden gebruikt als een hulpmiddel om het begrip van de mitochondriale rol in kankerprogressie en metastase uit te breiden.

Na het volgen van het hierboven gepresenteerde protocol moet een homoplasmatische cybride cellijn met een geconserveerde nucleaire achtergrond maar met een nieuw mitochondriale genotype worden verkregen, zoals weergegeven in de schema's in figuur 1 en figuur 2. De zuiverheid van het mitochondriale en nucleaire DNA in de cybriden kan worden bevestigd door RFLP, zoals weergegeven in figuur 3, en door nucleaire DNA-genotyperingsanalyse...

Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Dit onderzoek heeft tot doel de bijdrage van mitochondrion aan kankerprogressie en metastase beter te begrijpen. De transmitochondriale cybride generatie kan ons helpen om op te helderen hoe en op welk niveau mitochondriale genotypes betrokken zijn bij de agressiviteit van een tumorcel. Een van de technologieën om informatie te verkrijgen over de mitochondriale rol bij kanker is cybride generatie.We combineren deze tool met een verscheidenheid aan andere methoden, waaronder donatieve elektroforese, ademhalingsanalyse en andere mitochondriale functionele assays, flowcytometrie, proteomics, enzovoort. De plasticiteit van kankercellen samen met de interactienetwerken tussen nucleaire en mitochondriale genen, verhoogt de complexiteit van onze experimenten en gegevensinterpretatie. Dit is een van de redenen waarom het nodig is om een nieuwe experimentele aanpak te ontwikkelen.Een van de meest opwindende bevindingen uit ons onderzoek is de ontdekking van twee mitochondriale DNA-mutaties geassocieerd met het loslaten van cellen van de speelschaal die lijken op het genereren van metastase en de cellen volledig afhankelijk maken van aerobe glycolyse, en ze ook meer tumorogene en metastatische in in vivo modellen maken. Dit mitochondriale uitwisselingsprotocol kan worden toegepast op suspensie groeiende kankercellen. De chronologie kan de beperkingen van traditionele benaderingen overwinnen, waarbij het nucleatieproces en de volledige verwijdering van mitochondriaal DNA uit mitochondriale ontvangercellijnen vaak een echte uitdaging worden.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.

Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression

De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.

Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

Dit manuscript beschrijft een methode die wordt gebruikt om xenografts (PDX's) van prostaatkankerpatiënten te genereren vanuit circulerende tumorcellen (CTC's). Het genereren van PDX-modellen uit CTC's biedt een alternatief experimenteel model om prostaatkanker te bestuderen; de meest vaak gediagnosticeerde tumor en een frequente doodsoorzaak door kanker bij mannen.

Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

Hier, wordt een protocol (MitoCeption) voorgelegd aan mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) over te dragen, glioblastoma stamcellen (GSC), met als doel het bestuderen van hun biologische effecten op het metabolisme en de functies SGR. Een soortgelijk protocol kan worden aangepast aan mitochondriën dragen tussen andere celtypen.

MitoCeption: overbrengen geïsoleerde menselijke MSC Mitochondriën aan glioblastoma Stamcellen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.

Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel

Hier presenteren we een protocol met mitochondriale tracering, directe co-cultuurprocedures van mesenchymale stamcellen (MSC's) en retinale pigmentepitheelcellen (ARPE19), evenals de methoden voor het observeren en statistisch analyseren van de vorming van tunnelende nanobuisjes (TNT) en mitochondriale overdracht om mitochondriale uitwisseling via TNT's tussen MSC's en ARPE19-cellen te karakteriseren.

Mitochondriale overdracht via tunnelende nanobuisjes tussen mesenchymale stamcellen en retinaal pigmentepitheel in vitro

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Weerstand tegen kankertherapieën draagt bij aan de progressie van de ziekte en dood. Het bepalen van de mechanistische onderbouwing van resistentie is cruciaal voor de verbetering van de therapeutische respons. Dit manuscript details het protocol voor het genereren van taxane-resistente cel modellen van prostaatkanker (PC) om te helpen met het ontleden van de trajecten betrokken bij progressie naar Docetaxel resistentie bij patiënten van de PC.

Generatie van prostaatkanker modellen van de cel van de weerstand tegen de anti-mitotische Agent Docetaxel

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Leer cybrid-generatie uit kankercellen om de rol van mitochondriën in tumorgroei en metastase te onderzoeken. Deze methode onthult hoe mitochondriale genotypen bijdragen aan agressief kankergedrag.

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

Meer video's verkennen