Name: Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer een verbeterd protocol voor de isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel. Deze methode levert hoogzuivere cellen voor onderzoek naar inflammatoire artritis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken het personeel van de afdeling Medical Research Support, het Advanced Research Support Center (ADRES) en de leden van de afdeling Integratieve Pathofysiologie, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, voor hun technische assistentie en nuttige ondersteuning. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-subsidies JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (aan NS) en JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (aan YI); subsidies van de Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (aan NS); en een Takeda Science Foundation Medical Research-beurs, UCB Japan (UCBJ) projectsubsidie en de JSBMR Frontier Scientist-beurs 2019 (aan YI).

Experimenten met dieren werden goedgekeurd door het Animal Experiment Committee van Ehime University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Ehime University Guidelines for Animal Experiments (37A1-1 * 16).
1. Bereiding van instrumenten, reagentia en kweekmedium
<ol><li>Bereid het kweekmedium als volgt voor: vul Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotische antimycotische oplossing (anti-anti).</li>
	<li>Bereid het verteringsmedium als volgt voor: vul het kweekmedium aan met 1 mg/ml collagenase type IV. Pas de collagenaseconcentratie vlak voor gebruik aan.</li>
	<li>Verdun type I-C collageen tot een concentratie van 0,15 mg/ml met 1 mM HCl oplossing. Overspoel cultuurschalen (diameter van 40 of 60 mm) met de verdunde collageenoplossing. Verwijder na 6-12 uur bij kamertemperatuur de collageenoplossing uit de gerechten en droog op kamertemperatuur. De met collageen omhulde gerechten kunnen minstens 1 week op kamertemperatuur worden bewaard. Was de voorgecoate vaat voor gebruik met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of medium.</li>
	<li>Bereid steriele chirurgische instrumenten voor, zoals een schaar, een pincet met gekartelde uiteinden en een pincet met fijne punt. Week voor gebruik in 70% ethanol.</li>
</ol>2. Bereiding van synovitisweefsel bij muizen ( figuur 1A)
<ol><li>Bereid een muis voor met inflammatoire artritis in de achterpoten. OPMERKING: Vrouwelijke C57BL/6-muizen (18-20 g), 7-8 weken postnataal, met collageenantilichaam-geïnduceerde artritis (CAIA) of K/BxN serumtransferartritis (STA) werden gebruikt voor dit protocol8. Het isoleren van SM's uit niet-gezwollen (d.w.z. gezond) weefsel kan moeilijk zijn, omdat het aantal cellen onvoldoende is.</li>
	<li>Verdoof de muizen door een intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine en 16 mg/kg xylazine. Reinig de muizen met 70% ethanol.</li>
	<li>Knip het borstgebied open met een schaar om het hart bloot te leggen. Knip de rechter oorschelp van het hart met een schaar en steek vervolgens een vlindernaald van 23 G in de linkerkamer via de top van het hart, gevolgd door een reflux van 15-20 ml steriele PBS met behulp van een spuit om handmatig perifeer bloed te verwijderen (ongeveer 1 ml / 2 s).</li>
	<li>Versier de achterpoten door de huid te knippen met een schaar en aan de huid te trekken met een pincet met gekartelde uiteinden. OPMERKING: Na deze stap wordt het gebruik van een pincet aanbevolen voor het hanteren van monsters. Raak geen versierd weefsel aan met de vingers, om de aanhechting van murine haar te voorkomen.</li>
	<li>Dislocatie de metatarsofalangeale gewrichten door te trekken, gevolgd door het snijden van de ligamenten van de gewrichten met een schaar om de tenen te verwijderen.</li>
	<li>Knip de pezen van de onderbeenspieren bij de enkel door met een schaar. Pak de pees vast met een pincet en pel de spieren proximaal in het onderbeen om het scheenbeen bloot te leggen. Verwijder het kuitbeen.</li>
	<li>Ontwricht het kniegewricht door te trekken, gevolgd door het doorsnijden van de ligamenten van de gewrichten met een schaar om het scheenbeen los te maken met de gezwollen achterpoot. Bewaar de monsters in ijskoud kweekmedium (0,3 ml/cm2) tot de verwerking tot stap 3.1.</li>
</ol>3. Vertering van synovitisweefsel ( figuur 1B)
<ol><li>Zuig het kweekmedium op, vermijd het monster en voeg vervolgens vers kweekmedium toe (0,3 ml/cm2). Herhaal het wasproces drie of vier keer. OPMERKING: Vanaf deze stap moet de behandeling van monsters aseptisch worden uitgevoerd in een schone bank of veiligheidskast.</li>
	<li>Ontwricht alle gewrichten van de monsters door met een fijnpuntpincet in het kweekmedium onder een stereomicroscoop (bij 10x-20x vergroting) te trekken. Een fijnpuntpincet is handig in deze stap. Verwijder het scheenbeen en zoveel mogelijk vaten, pezen en ligamenten. Pas op dat u de botten niet breekt bij het ontwrichten.</li>
	<li>Bereid twee buisjes van 15 ml per monster voor. Breng de ontwrichte botten met zachte weefsels over naar de eerste buis van 15 ml met een pincet. Voeg 4 ml verteringsmedium per monster, verkregen uit beide achterpoten, toe aan de buis.</li>
	<li>Om resterende cellen en weefselfragmenten te verzamelen, brengt u het medium waarin het monster zich bevond over naar de tweede buis van 15 ml. Centrifugeer het medium op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van het supernatant, resuspensie de pellet met 1 ml verteringsmedium en breng de cel- en weefselfragmentoplossing over naar de eerste buis van 15 ml met bijna al het weefsel (in totaal 5 ml verteringsmedium / achterpoten).</li>
	<li>Verwerk het monster gedurende 60-120 minuten bij 37 °C met schudden in een hybridisatieoven. OPMERKING: De optimale tijd om de monsters te verteren moet worden bepaald. De tijd is afhankelijk van de mate van zwelling in de enkels en collagenasen. In de meeste gevallen is 60-120 min voldoende. Verzamel na 60 minuten incubatie een deel van het verteerde monster door pipetteren en observeer onder een microscoop. Als de spijsvertering onvoldoende is, moet de incubatie doorgaan en moet de spijsvertering elke 30 minuten worden gecontroleerd.</li>
	<li>Pipetteer de oplossing goed. Filter de celoplossing door een celzeef (poriegrootte van 40 μm) tot een buis van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 10 ml kweekmedium toe aan de buis van 50 ml door de celzeef. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeerde met 10 ml kweekmedium. Herhaal de centrifugatie. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeerde met 2 ml kweekmedium.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig01.jpg"> Figuur 1: Procedure voor bemonstering van muizenartritisweefsel en collagenasevertering . (A) (i) Muriene achterpoot met inflammatoire artritis. ii) Verwijdering van de huid op de achterpoot. iii) Dislocatie van de metatarsofalangeale gewrichten en verwijdering van de tenen. iv) Doorsnijden van de pezen in de enkel. (v) Verwijdering van de spieren in de onderbenen. (vi) Dislocatie van het kniegewricht. b) links; Uitgesneden benen in kweekmedium. Rechts; ontwrichte tarsus en metatarsus in kweekmedium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Isolatie van synoviale fibroblasten ( figuur 2A)
<ol><li>Zaai alle celsuspensies verkregen uit beide enkels op de met collageen bedekte schaal. OPMERKING: Als u enkels met zwakke of matige zwelling gebruikt om de cellen te verkrijgen, wordt een schaal met een diameter van 40 mm aangebracht. De met collageen gecoate schotelgrootte kan worden gewijzigd in een schaal met een diameter van 60 mm als beide enkels ernstige zwelling hebben.</li>
	<li>Voeg kweekmedium toe (ongeveer 222 μL/cm2). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.</li>
	<li>Verzamel niet-hechtende cellen met behulp van een pipet (gebruik in stap 5.1). Was de met collageen bedekte schaal met kweekmedium en verzamel het medium. Kweek de aanhangende cellen in vers medium (figuur 2B,i). De meeste cellen die zich snel hechten aan de met collageen bedekte schaal vertonen een fibroblastoïde (spindelvormige) morfologie.</li>
	<li>Passage sub-confluente cellen door behandeling met 0,05% trypsine in Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Bij deze methode is de besmetting van andere cellen beperkt, zelfs als het in de eerste expansie is. Als meer gezuiverde fibroblastachtige cellen nodig zijn, voer dan herhaalde passaging uit om de zuiverheid te verbeteren; de uitbreiding van het cytoplasma van de cellen in adhesie wordt echter ook waargenomen (figuur 2B,ii). Omdat overmatige passages het verlies van naïeve kenmerken in de cellen beïnvloeden, gebruikt u cellen met minder dan 5 passages.</li>
</ol>5. Isolatie van synoviale macrofagen ( figuur 2A)
<ol><li>Zaai alle niet-hechtende cellen uit stap 4.4 uit op schalen (diameter van 40 of 60 mm) die niet met collageen zijn bedekt. OPMERKING: Niet-adherente cellen omvatten macrofagen, andere lymfocyten en resterende fibroblasten uit synovitisweefsel.</li>
	<li>Kweek de bulkcellen gedurende 1 dag bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.</li>
	<li>Om niet-aanhangende lymfocyten te verwijderen, zuigt u het gekweekte medium op en voegt u vervolgens vers kweekmedium toe. Herhaal dit proces twee of drie keer (figuur 2B,iii).</li>
	<li>Kweek de aanhangende bulkcellen gedurende 1-2 weken in kweekmedium, met mediumwisselingen om de 2 dagen met behoud van confluentie (figuur 2B, iv). OPMERKING: Het aantal SM's neemt langzaam toe onder co-cultuur omstandigheden met SF's. Daarom moet de co-cultuurperiode indien nodig worden aangepast.</li>
	<li>Twee keer wassen met PBS of HBSS. Behandel met 0,05% trypsine in HBSS (ongeveer 55 μL/cm 2) gedurende 3 minuten bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Fibroblasten maken zich gemakkelijk los van de kweekschaal door trypsinebehandeling en macrofagen vertonen resistentie tegen trypsinebehandeling. Gebruik deze eigenschap voor de selectie van synoviale macrofagen.</li>
	<li>Voeg kweekmedium (ongeveer 222 μL/cm2) voorzichtig toe aan 0,05% trypsine in HBSS. Giet het medium na deze stap niet rechtstreeks op de cellen.</li>
	<li>Om losgemaakte cellen te verwijderen, zuigt u het gekweekte medium op en voegt u vervolgens voorzichtig vers kweekmedium toe. Herhaal dit proces twee of drie keer. Bewaar de resterende cellen op de schaal in vers kweekmedium tot gebruik (figuur 2B,v). OPMERKING: Na behandeling met trypsine vertonen aanhangende cellen macrofaagachtige morfologische kenmerken.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig02.jpg"> Figuur 2: Scheiding van macrofaagrijke en fibroblastrijke fracties van inflammatoir artritisweefsel. (A) Schema van de procedure om macrofaagrijke en fibroblastrijke cellen te scheiden van artritisweefsel. (B) Representatieve fasecontrastbeelden van fasen van de procedure, (i) tot en met (v) in figuur 2A. De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Onthulling van inflammatoire artritis: onderzoek naar functies van synoviale cellen

<ol><li>Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).</li>
<li>Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+tissue+macrophages%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Synovial tissue macrophages: friend or foe.</a> RMD Open. 3 (2), (2017).</li>
<li>Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophages%3A+from+ordinary+eaters+to+extraordinary+multitaskers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers.</a> Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).</li>
<li>Alivernini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synovial+tissue+macrophage+subsets+regulate+inflammation+and+remission+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis.</a> Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).</li>
<li>Saeki, N., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+synovial+macrophage+metabolism+by+synovial+fibroblasts+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).</li>
<li>Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+normal+and+arthritogenic+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts.</a> Protocol Exchange. , (2009).</li>
<li>Saeki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulator+UHRF1+orchestrates+proinflammatory+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+in+a+suppressive+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).</li>
<li>Midwood, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+an+endogenous+activator+of+Toll-like+receptor+4+that+is+essential+for+maintaining+inflammation+in+arthritic+joint+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease.</a> Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).</li>
<li>You, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+engineered+stem+cell-derived+exosomes+to+regulate+macrophage+heterogeneity+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis.</a> Science Advances. 7 (23), 0083(2021).</li>
<li>Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+propagation+method+for+resident+macrophages+by+co-culture+and+subculture%2C+and+their+isolation+from+various+organs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs.</a> BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).</li>
<li>Andrä, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+T-cell+functionality+after+flow+cytometry+sorting+revealed+p38+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).</li>
<li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+%28SICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).</li>
<li>Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+rheumatoid+arthritis%3A+dangerous+liaisons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons.</a> Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).</li>
<li>Croft, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+subsets+drive+inflammation+and+damage+in+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis.</a> Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).</li>
<li>Wei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+drives+synovial+fibroblast+identity+and+arthritis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology.</a> Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Deze hier ontwikkelde methode verbetert eerdere technieken voor het isoleren van zowel SF's van muizenartritis als residente macrofagen van een aantal organen 7,11. De gemodificeerde methode kan zowel macrofagen als fibroblasten isoleren van inflammatoir synovium met een hoge zuiverheid, en het is eenvoudig en reproduceerbaar. Omdat de methode geen complexe instrumenten zoals een celsorteerder vereist, kan iedereen het uitvoeren. Bovendien vermijdt de huidige tec...

Reumatoïde artritis (RA) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door hyperplasie van het synovium, wat leidt tot gewrichtsvernietiging 1,2. Weefsel-residente macrofagen en fibroblasten zijn aanwezig in gezond synovium om de gezamenlijke homeostase te behouden. Bij RA-patiënten prolifereren synoviale fibroblasten (SF's) en infiltreren immuuncellen, waaronder monocyten, in het synovium en gewrichtsvloeistof, processen geassocieerd met ontsteking 1,3,4. Synoviale macrofagen (SM's), waaronder residente macrofagen en van perifere bloedmonocyten afgeleide macrofagen, en SF's worden afwijkend geactiveerd en hebben een belangrijke rol in de pathogenese van RA. Recente studies hebben gesuggereerd dat cel-cel interacties tussen SM's en SF's bijdragen aan zowel de exacerbatie als de remissie van RA 5,6.
Om RA-pathogenese te begrijpen, zijn verschillende knaagdiermodellen van inflammatoire artritis gebruikt, waaronder K / BxN-serumtransferartritis, collageen-geïnduceerde artritis en collageenantilichaam-geïnduceerde artritis. Celgebaseerde assays zijn over het algemeen nodig om moleculaire functies bij artritis te verduidelijken. Daarom zijn primaire cellen uit diermodellen van artritis geïsoleerd. De methode om SF's te isoleren uit muizenartritisweefsel is goed ingeburgerd en deze cellen hebben bijgedragen aan de opheldering van moleculaire mechanismen in artritispathogenese 7,8. Aan de andere kant zijn van beenmerg afgeleide macrofagen, van bloedmonocyten afgeleide macrofagen en macrofaagcellijnen vaak gebruikt als macrofaagbronnen voor artritisstudies 9,10. Omdat macrofagen functies kunnen verwerven die verband houden met hun micro-omgeving, kunnen algemene bronnen van macrofagen reacties missen die specifiek zijn voor artritisweefsel. Bovendien is het moeilijk om voldoende synoviale cellen te verkrijgen door te sorteren, omdat muizensynovium een zeer klein weefsel is, zelfs in artritismodellen. Het gebrek aan gebruik van synoviale macrofagen voor in vitro studies is een beperking geweest in artritisstudies. De vaststelling van een protocol om synoviale macrofagen te isoleren en uit te breiden zou een voordeel zijn voor de opheldering van pathologische mechanismen bij RA.
Bij de vorige methode om SF's te isoleren, werden SM's weggegooid7. Daarnaast werd een methode gemeld om residente macrofagen uit sommige organen te isoleren en uit te breiden11. Daarom werden bestaande protocollen in combinatie aangepast. De modificatie is gericht op het bereiken van de primaire cultuur van zowel SM's als SF's met een hoge zuiverheid. Het algemene doel van deze methode is om zowel SM's als SF's uit muizenartritisweefsel te isoleren en uit te breiden.

<table><tbody><tr><td>5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA-oplossing</td><td>nacalai tesque</td><td>35556-44</td><td>Verdund met HBSS</td></tr><tr><td>Antibiotic&ndash;antimycotic (anti/anti)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Butterflynaald</td><td>TERUMO</td><td>SV-23DLK</td><td>23G</td></tr><tr><td>Celzeef</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro;m poriën, Nylon</td></tr><tr><td>Cellmatrix Type I-C</td><td>Nitta gelatin</td><td>637-00773</td><td>Type I-C collageen</td></tr><tr><td>Centrifugebuis 15</td><td>TPP</td><td>91014</td><td>15 mL buis</td></tr><tr><td>Centrifugebuis 50</td><td>TPP</td><td>91050</td><td>50 mL buis</td></tr><tr><td>Collagenase uit C. Histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>Type IV collagenase</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle Medium GlutaMax (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>SIGAM</td><td>173012</td><td>Hitte-inactivatie werd uitgevoerd</td></tr><tr><td>Hanks' balanced salt solution (HBSS)</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI28-1525A</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal 40</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>Voor celkweek</td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal 60</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Voor celkweek</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>KFI</td><td>1-9749-31</td><td>Fijnpunt</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI28-1522</td><td>Gekartelde punt</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>ZEISS</td><td>STEMI305-EDU</td><td>Stereomicroscoop</td></tr></tbody></table>

isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Reumatoïde artritis is een auto-immuunziekte die leidt tot chronische ontsteking van gewrichten. Synoviale macrofagen en synoviale fibroblasten spelen een centrale rol in de pathogenese van reumatoïde artritis. Het is belangrijk om de functies van beide celpopulaties te begrijpen om de mechanismen te onthullen die ten grondslag liggen aan pathologische progressie en remissie bij inflammatoire artritis. Over het algemeen moeten in vitro experimentele omstandigheden de in vivo omgeving zoveel mogelijk nabootsen. Primaire weefsel-afgeleide cellen zijn gebruikt in experimenten die synoviale fibroblasten bij artritis karakteriseren. Daarentegen zijn in experimenten die de biologische functies van macrofagen bij inflammatoire artritis onderzoeken, cellijnen, van beenmerg afgeleide macrofagen en van bloedmonocyten afgeleide macrofagen gebruikt. Het is echter onduidelijk of dergelijke macrofagen daadwerkelijk de functies van weefselresidente macrofagen weerspiegelen. Om residente macrofagen te verkrijgen, werden eerdere protocollen aangepast om zowel primaire macrofagen als fibroblasten uit synoviaal weefsel te isoleren en uit te breiden in een inflammatoir artritismuismodel. Deze primaire synoviale cellen kunnen nuttig zijn voor in vitro analyse van inflammatoire artritis.

Vrouwelijke C57BL / 6-muizen op de leeftijd van 7-8 weken ondergingen collageenantilichaam-geïnduceerde artritis. Macrofaagachtige cellen en fibroblastachtige cellen werden onafhankelijk geïsoleerd uit inflammatoir artritisweefsel volgens de hierboven beschreven procedure (figuur 2A, B). Macrofaagachtige cellen werden onmiddellijk gebruikt na stap 5.7. Fibroblastachtige cellen werden aanvankelijk gekweekt om sub-confluent te zijn na stap 4.4, en vervolgens overgegaan naar ee...

De huidige studie biedt een aangepast protocol om synoviale macrofagen en fibroblasten te isoleren uit murine inflammatoire artritisweefsel.

Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

Celgebaseerde assays zijn nodig om moleculaire functies te verduidelijken. In artritisstudies is de methode om primaire cellen te isoleren goed ingeburgerd in synoviale fibroblasten, maar niet in synoviale macrofagen. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld om zowel synoviale macrofagen als synoviale fibroblasten uit artritismodellen te isoleren en uit te breiden.Primaire synoviale fibroblasten uit muizenartritisweefsel hebben bijgedragen aan de opheldering van moleculaire mechanismen in de pathogenese van artritis. Aan de andere kant zijn van beenmerg afgeleide macrofagen, van bloedmonocyten afgeleide macrofagen en macrofaagcellijnen vaak gebruikt als macrofaagbronnen voor artritisstudies. Omdat macrofagen functies kunnen verwerven die verband houden met hun micro-omgeving, kunnen algemene bronnen van macrofagen reacties missen die specifiek zijn voor artritisweefsel.Bovendien is het moeilijk om voldoende synoviale cellen te verkrijgen door te sorteren, omdat muizensynovium een zeer klein weefsel is, zelfs in artritismodellen. Bij de vorige methode om synoviale fibroblasten te isoleren, werden synoviale macrofagen weggegooid. Daarnaast werd een methode gemeld om residente macrofa

isolation-culture-primary-synovial-macrophages-fibroblasts-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video showcases a cell-based therapy for autoimmune arthritis in mice. iPSC-derived T regulatory cells expressing ovalbumin-specific receptors are injected with methylated bovine serum albumin (mBSA) emulsified in an adjuvant. Murine antigen-presenting cells (APCs) process and present the mBSA to T cells, prompting T cell activation and migration to the knee joint's synovial membrane. Subsequent injections involve mBSA alone in the left knee and a combination of mBSA and ovalbumin in the...

A Cell-Based Therapy for Autoimmune Arthritis in a Murine Model

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van de patiënt afgeleid fibroblast-achtige synoviocyten, met behulp van een lentivirale systeem zonder feeder-cellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Een protocol dat mesenchymale stamcellen (MSC's) vaststelt die geïsoleerd zijn uit de synoviale vloeistof en het beenmerg van minivarkens en op niet-invasieve wijze verzameld worden met behulp van het afzuigapparaat van een spuit, wordt gepresenteerd. Cellulair fenotypen werd uitgevoerd met behulp van flowcytometrie na celisolatie en in vitro cultivatie van beenmerg en synoviale vloeistoffen afgeleid van MSC's.

Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.

Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

Hier beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar stroomcytometrieprotocol om monocyten/macrofaag en T-celsubsets te identificeren met behulp van zowel extra- als intracellulaire kleuringstesten in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovaal weefsel, gebruikmakend van een gevestigd chirurgisch model van murineartrose.

Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

We ontwikkelden een menselijk ex vivo transwell-systeem dat in staat is acute ontstekings-, infectieuze en structurele veranderingen in het synovium te evalueren.

Een preklinisch model van synovitis met ex vivo menselijk synoviaal weefsel met behouden functie en architectuur

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 ×...

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

In deze publicatie beschrijven we een snelle en gemakkelijke werkwijze voor het isoleren en kweken van primaire acinaire cellen van de pancreas muizen. Deze methode vormt een waardevolle benadering van de fysiologie van verse primaire normale / getransformeerde exocriene pancreas cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

De myofibro is een invloedrijke stromale cellen van het maagdarmkanaal die belangrijk zijn fysiologische processen reguleert zowel in normale als ziektebeelden. We beschrijven een techniek die voor de isolatie van primaire myofibroblasten van zowel muis als humaan colon weefsel, dat kan worden gebruikt voor in vitro experimenten.

Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue

Leer een verbeterd protocol voor de isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel. Deze methode levert hoogzuivere cellen voor onderzoek naar inflammatoire artritis.

Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel

Meer video's verkennen