Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor
2 juni 2023
In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.
In ons lab bestuderen we menselijke colorectale kanker. De progressie naar gemetastaseerde ziekte en de reactie op de behandeling, inclusief immunotherapie. We proberen nieuwe voorspellende en prognostische biomarkers te vinden door de tumorimmuunmicro-omgeving en het intratumorale microbioom bij primaire en gemetastaseerde ziekten te onderzoeken.
In ons project implementeren we momenteel verschillende technologieën zoals RNA-sequencing, whole exome sequencing, TCR sequencing circulerende celvrije DNA-analyse, immunofluorescentie en fluorescentie-instituut hybridisatie. Op dit moment is onze grootste uitdaging om fluorescentie-instituut hybridisatiekleuring te combineren met tyramide signaalversterking multiplex immunofluorescentie om de interactie tussen het microbioom en de immuuncellen te bestuderen. Onze methode is robuust, reproduceerbaar, gebruiksvriendelijk en kosteneffectief.
Het kan worden opgezet in elk laboratorium met een fluorescentielichtscanner en de methode kan worden gebruikt met elk commercieel verkrijgbaar IHC-antilichaam in tegenstelling tot commercieel verkrijgbare kits die meestal zijn geoptimaliseerd voor een beperkt paneel van antigenen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor handmatige tyramide-signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeld- en ruimtelijke analyse. De methode is toepasbaar op in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) coupes voor het kleuren van meerdere antigenen per objectglas.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Pathologie
Achtergrond
- Onderzoek naar colorectale kanker bij de mens en de progressie daarvan.
- Focus op de immuunmicro-omgeving van de tumor en het intratumorale microbioom.
- Gebruik van diverse technologieën, waaronder RNA-sequencing en immunofluorescentie.
- Uitdagingen bij het combineren van verschillende kleuringsmethoden voor een uitgebreide analyse.
Doel van de studie
- Om nieuwe predictieve en prognostische biomarkers te vinden.
- Om de interactie tussen het microbioom en immuuncellen te bestuderen.
- Om een robuuste en reproduceerbare kleuringsmethode te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Handmatige tyramide signaalversterking multiplex immunofluorescentie.
- Beeldanalyse met behulp van high-plex fluorescentie-algoritmen.
- Fluorescentie in situ hybridisatie gecombineerd met immunofluorescentie.
- Gedetailleerd kleuringsprotocol voor FFPE-weefselcoupes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kleuring van meerdere antigenen op een enkele slide.
- Optimalisatie van de antilichaamspecificiteit en de signaal-ruisverhouding.
- Effectieve beeldanalyse die leidt tot kwantificeerbare gegevens.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode in diverse laboratoria.
Conclusies
- De TSA mIF-methode is veelzijdig en kosteneffectief.
- Deze kan worden aangepast voor diverse antilichamen en antigenen.
- Deze aanpak vergroot het begrip van de tumrobiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Multiplex immunofluorescentie (mIF) met ruimtelijke beeldanalyse maakt hoogwaardige, kwantitatieve mapping van de tumormicro-omgeving (TME) mogelijk, wat bijdraagt aan biomarker-ontdekking en mechanische risicoreductie in oncologie-pipelines. Deze workflow biedt bruikbare inzichten in interacties tussen immuun- en stromale cellen, wat voorspellende biomarkerstrategieën en translationeel onderzoek ondersteunt. De reproduceerbaarheid en compatibiliteit met diverse antilichamen maken dit tot een schaalbare capaciteit voor oncologische R&D op ondernemingsniveau.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt ruimtelijk opgeloste analyse van interacties tussen immuun- en tumorcellen mogelijk voor targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het kwantificeren van celtype-dichtheden en proximiteiten binnen tumorcompartimenten.
- Faciliteert de identificatie van nieuwe predictieve en prognostische biomarkers voor portfoliotriage.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefselsystemen voor voor downstream multiplexe biomarker-screening.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en kwantitatieve spatiale gegevens voor assay-ontwikkeling.
- Maakt een robuuste evaluatie van antilichamen-specificiteit en optimalisatie van de signaal-ruisverhouding mogelijk voor screening-gereedheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijst ruimtelijke biomarkeranalyse af met ziekterelevente modellen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door TME-kenmerken te koppelen aan hypothesen over therapeutische respons.
- Levert kwantitatieve resultaten voor vergelijkingen tussen studies en cohorten in preklinisch onderzoek.
Integratie van pipeline en workflow
Deze workflow voor mIF- en ruimtelijke analyse slaat een brug tussen vroege ontdekking, biomarker-validatie en translationeel onderzoek in oncologieportefeuilles.
- Discovery Biology: Kwantificeert de distributie van immuun- en stromale cellen om TME-gestuurde mechanismen te verduidelijken.
- Screening: Standaardiseert multiplexe weefselassays voor reproduceerbare, kwantitatieve read-outs.
- Analytics: Exporteert ruimtelijke gegevens en dichtheidsgegevens voor statistische vergelijking van tumorcompartimenten en celinteracties.
- Translationeel onderzoek: Koppelt ruimtelijke biomarkerpatronen aan therapeutische respons, wat de continuïteit van preklinisch naar klinisch onderzoek ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan elk antilichaampanel en tumortype, waardoor brede toepassing binnen een portfolio mogelijk is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van biomarkers en targets door ruimtelijke celinteracties te ontrafelen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, schaalbare en kosteneffectieve gemultiplexte weefselanalyse.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium door middel van een robuuste karakterisering van de TME.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van oncologie-assets mogelijk op basis van bewijs uit ruimtelijke biomarkers.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie, beeldanalyse en statistische gegevensverwerking.
- Vereist toegang tot een fluorescente slide-scanner en compatibele beeldanalysesoftware.
- Vereist cross-team standaardisatie van antilichaamvalidatie en kleuringsprotocollen.
- Aanpasbaar voor verschillende tumortypen en antilichaampanels mits passend geoptimaliseerd.
- Afhankelijk van strikte antilichaamspecificiteit en optimalisatie van de signaal-ruisverhouding voor betrouwbare resultaten.
