Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor
2 juni 2023
In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.
In ons lab bestuderen we menselijke colorectale kanker. De progressie naar gemetastaseerde ziekte en de reactie op de behandeling, inclusief immunotherapie. We proberen nieuwe voorspellende en prognostische biomarkers te vinden door de tumorimmuunmicro-omgeving en het intratumorale microbioom bij primaire en gemetastaseerde ziekten te onderzoeken.
In ons project implementeren we momenteel verschillende technologieën zoals RNA-sequencing, whole exome sequencing, TCR sequencing circulerende celvrije DNA-analyse, immunofluorescentie en fluorescentie-instituut hybridisatie. Op dit moment is onze grootste uitdaging om fluorescentie-instituut hybridisatiekleuring te combineren met tyramide signaalversterking multiplex immunofluorescentie om de interactie tussen het microbioom en de immuuncellen te bestuderen. Onze methode is robuust, reproduceerbaar, gebruiksvriendelijk en kosteneffectief.
Het kan worden opgezet in elk laboratorium met een fluorescentielichtscanner en de methode kan worden gebruikt met elk commercieel verkrijgbaar IHC-antilichaam in tegenstelling tot commercieel verkrijgbare kits die meestal zijn geoptimaliseerd voor een beperkt paneel van antigenen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) gecombineerd met beeld- en ruimtelijke analyse. De methode is toepasbaar op formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor het kleuren van meerdere antigenen per dia.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Pathologie
Achtergrond
- Onderzoek naar menselijk colorectaal kanker en zijn progressie.
- Focus op de tumor immuun-omgeving en intratumoraal microbioom.
- Gebruik van verschillende technologieën waaronder RNA sequencing en immunofluorescentie.
- Uitdagingen bij het combineren van verschillende kleuringsmethoden voor een uitgebreide analyse.
Doel van het onderzoek
- Om nieuwe voorspellende en prognostische biomarkers te vinden.
- Om de interactie tussen het microbioom en immuuncellen te bestuderen.
- Om een robuuste en reproduceerbare kleuringsmethode te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Handmatige tyramide signaalversterking multiplex immunofluorescentie.
- Beeldanalyse met behulp van high-plex fluorescentie algoritmen.
- Fluorescentie in situ hybridisatie gecombineerd met immunofluorescentie.
- Gedetailleerd kleuringsprotocol voor FFPE weefsel secties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kleuring van meerdere antigenen op een enkele dia.
- Optimalisatie van antilichaam specificiteit en signaal-ruisverhouding.
- Effectieve beeldanalyse die kwantificeerbare gegevens oplevert.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode in verschillende labs.
Conclusies
- De TSA mIF methode is veelzijdig en kosteneffectief.
- Het kan worden aangepast voor verschillende antilichamen en antigenen.
- Deze aanpak verbetert het begrip van tumorbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multiplex immunofluorescence (mIF) with spatial image analysis enables high-content, quantitative mapping of the tumor microenvironment (TME), supporting biomarker discovery and mechanistic de-risking in oncology pipelines. This workflow provides actionable insights into immune and stromal cell interactions, informing predictive biomarker strategies and translational research. Its reproducibility and compatibility with diverse antibodies position it as a scalable capability for enterprise-level oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of immune and tumor cell interactions for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell-type densities and proximities within tumor compartments.
- Facilitates identification of novel predictive and prognostic biomarkers for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed biomarker screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative spatial data for assay development.
- Enables robust evaluation of antibody specificity and signal-to-noise optimization for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker analysis with disease-relevant models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking TME features to therapeutic response hypotheses.
- Provides quantitative outputs for cross-study and cross-cohort comparisons in preclinical research.
Pipeline & Workflow Integration
This mIF and spatial analysis workflow bridges early discovery, biomarker validation, and translational research in oncology portfolios.
- Discovery Biology: Quantifies immune and stromal cell distributions to clarify TME-driven mechanisms.
- Screening: Standardizes multiplexed tissue assays for reproducible, quantitative readouts.
- Analytics: Exports spatial and density data for statistical comparison of tumor compartments and cell interactions.
- Translational Research: Links spatial biomarker patterns to therapeutic response, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any antibody panel and tumor type, enabling broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in biomarker and target selection by resolving spatial cell interactions.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable, and cost-effective multiplexed tissue analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust TME characterization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oncology assets based on spatial biomarker evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, image analysis, and statistical data processing.
- Needs access to a fluorescent slide scanner and compatible image analysis software.
- Demands cross-team standardization of antibody validation and staining protocols.
- Adaptable across tumor types and antibody panels with appropriate optimization.
- Dependent on rigorous antibody specificity and signal-to-noise optimization for reliable outputs.
