Name: Evaluatie van lipidedruppelgrootte en fusie in boviene levercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Ontdek hoe je lipidedruppelgrootte en fusie in boviene levercellen evalueert met Oil Red O kleuring en live cell imaging. Deze methode biedt inzicht in vetleverontwikkeling en lipidenmetabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gezamenlijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U1904116).

Alle procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van de Animal Care Committee van de Henan Agricultural University (provincie Henan, China).
1. Rijpe hepatocytencelkweek bij runderen
<ol><li>Ontdooi de primaire hepatocytencellen17 en centrifugeer 400 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: De primaire hepatocytencellen werden gekweekt en onderhouden na een eerder gepubliceerd rapport17.</li>
	<li>Gooi de bevroren opslagoplossing weg met een pipet en suspensie met 1 ml medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) bevat. Gebruik vervolgens een celtelkamer om het aantal cellen per milliliter te berekenen en bereken vervolgens de concentratie van de bovenstaande celsuspensie en pas de celconcentratie aan op 1 x 107 cellen / ml.<ol><li>Voeg de celsuspensie toe aan een celkweekschaal van 60 mm met 3 ml van het bovenstaande medium. Kweek de cellen en incubeer ze bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Wanneer de cellen groeien tot 80%, gooi het medium weg en spoel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), voeg vervolgens 750 μL van 0,25% trypsine toe om de cellen te verteren. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 3 minuten en neutraliseer ze vervolgens met dezelfde hoeveelheid 10% FBS. Verzamel de celsuspensie om te centrifugeren bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.</li>
</ol>2. Olie rode O kleuring
<ol><li>Voeg 800 μL kweekmedium met 10% FBS en DMEM toe aan elk putje van de 24-well celkweekplaat met glazen coverslips. Neem 50 μL van de celsuspensie (verkregen in stap 1.3) en voeg deze toe aan 950 μL PBS om te mengen. Gebruik een celtelkamer om het aantal cellen per milliliter te berekenen en bereken vervolgens de concentratie van de bovenstaande celsuspensie. Stel ten slotte de celconcentratie in elke put in op 4 x 104/ml en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 .</li>
	<li>Gooi na 24 uur het kweekmedium weg en was het met PBS. Suspensie met 800 μL DMEM-inductiemedium dat 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) bevat.</li>
	<li>Los in totaal 100 μL LA (zie tabel met materialen) op in 900 μL watervrij ethanol en bereid een standaardoplossing (100 mmol/l). Voeg een gradiënt van 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L en 200 μmol/L LA toe aan de 24-putplaat. Herhaal elke behandeling vier keer. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en was de cellen drie keer met PBS. Fixeren met 400 μL van 4% paraformaldehyde gedurende 20 min. Gooi de fixatieve oplossing weg en was deze drie keer met PBS.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 60% isopropylalcohol gedurende 5 minuten en gooi het vervolgens weg. Voeg vers bereide olierode O-werkoplossing (zie materiaaltabel) (3:2-verhouding van olierood O:water) gedurende 20-30 minuten toe en gooi de kleuringsoplossing weg. Was de cellen twee tot vijf keer met PBS totdat er geen overtollige kleurstofoplossing is.</li>
	<li>Voeg 300 μL hematoxyline-kleuringsoplossing toe (hematoxyline:waterverhouding van 1:10) en verf de kern gedurende 1-2 minuten opnieuw. Gooi de kleurstofoplossing weg en was de cellen twee tot vijf keer met PBS. Verwijder de glazen afdekplaten van de 24-putplaat en plaats ze op microscopische dia's (de kant met cellen naar beneden gericht) nadat u 10 μL tabletkit (zie materiaaltabel) op de dia hebt laten vallen.</li>
	<li>Na het sealen observeren en in beeld brengen van de LDs van de cellen onder de olielens van de optische microscoop (zie Tabel met materialen). Meet de diameter van de LDs met cellSens software en analyseer het aantal en de grootte van de LDs.</li>
</ol>3. Meting van de grootte en het aantal LDs
<ol><li>Beelden vastleggen: Schakel achtereenvolgens de computer en de microscoopschakelaar in, plaats de dia op het laadplatform, open de beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel) en sluit de computer aan om het beeld te bekijken.<ol><li>Zoek de afbeeldingen op laag vermogen en druppel een geschikte hoeveelheid cederolie op de beelddia. Stel de waarnemingsfactor in op 100x, stel automatische belichting in en leg de beelden vast door het juiste gezichtsveld aan te passen. Selecteer drie gekleurde celdia's voor elke groep voor beeldvorming.</li>
	</ol></li>
	<li>Diametermeting: selecteer willekeurig 60 LD's voor elke afbeelding om de diameters te meten. Na de meting van elke afbeelding slaat u de afbeeldingen op en voert u de meetresultaten uit in een tabel voor de daaropvolgende analyse van de gemiddelde grootte en verdelingsverhouding van LDs.</li>
	<li>Hoeveelheidsmeting: selecteer drie afbeeldingen voor elke gekleurde en gefotografeerde dia en selecteer willekeurig drie cellen voor hoeveelheidsmeting in elke afbeelding. Tel en analyseer het aantal LD's rond de cel en bereken het gemiddelde aantal LD's in de cel.</li>
</ol>4. Dynamische observatie van LD-fusie
<ol><li>Volg de celkweekstappen zoals vermeld in stap 1.1-1.3. Wanneer de cellen groeien tot 80%, gooi het medium weg en spoel ze af met PBS en verteer ze vervolgens met 750 μL trypsine gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens 750 μL van het medium toe, centrifugeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur op 200 x g en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Suspensie van de cellen in 1 ml kweekmedium, tel en pas de celconcentratie aan tot 5 x 105 cellen/ml in een schaal van 35 mm. Cultuur bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Wanneer de cellen zijn gegroeid tot 80%, verander het medium in DMEM + 150 μmol / L LA gedurende 24 uur en zet de cultuur voort in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de LDs te accumuleren.</li>
	<li>Verwijder na 24 uur het kweekmedium. Was de aanhangende cellen met PBS en incubeer ze met 10 μg/ml BODIPY 493/503 neutrale fluorescerende sonde (zie materiaaltabel) in het donker gedurende 30 minuten. Was na incubatie de cellen in de kweekschaal drie keer met PBS en voeg DMEM + 150 μmol/L LA toe. OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht tijdens en na de BODIPY-kleuring van 10 μg / ml; 1 mg/ml BODIPY werd verdund met PBS (1:100).</li>
	<li>Plaats de kweekschaal in de groef van de microscoop van het levende celstation (zie materiaaltabel) om de dynamische veranderingen van LDs te observeren. Schakel de kracht van het werkstation van de levende cel in volgens de startvolgorde en vermijd licht.<ol><li>Schakel de stroom, transmissielichtbron, microscoopvoedingsbron, fluorescerende lichtbron van kwiklamp, ccd-cameravoedingsbron (charge-coupled device), computerhostvoedingsbron, CO 2-klep en CO2-incubator in.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg gedestilleerd water toe aan de groef op het laadplatform en zorg ervoor dat het niet over de ventilatieopening gaat.</li>
	<li>Schakel de computer in en voer "NIS-Elements" uit. Zoek eerst de juiste beeldhoek op de 4x objectieflens en pas deze vervolgens achtereenvolgens aan de 40x objectieflens aan. Selecteer E100 voor het observeren van het monster in de microscoop en L100 voor het bekijken en fotograferen van het monster op de computer. OPMERKING: E100 en L100 zijn microscoopverstelknoppen op het werkstation van de levende cel (zie materiaaltabel), die respectievelijk het oculair en het computerscherm vertegenwoordigen.</li>
	<li>Ontwerp de parameters zoals fluorescentiekanaal (bijv. Ph-40x, fluoresceïne-isothiocyanaat [FITC], sluiter) en verwachte opnametijd voor het experiment. Stel de opnametijd in de tijd in, inclusief de opname-intervaltijd van 5 minuten tussen elke twee beelden en een totale opnametijd van 6 uur. OPMERKING: Langdurige opnamen moeten de focusstabilisatiefunctie van het Perfect Focus System (PFS) gebruiken. Pas hiervoor eerst het gezichtsveld en de scherpstellengte aan, klik vervolgens op PFS op het computerscherm en pas ten slotte de fijne scherpstelspiraal aan.</li>
	<li>Selecteer verschillende kanaalmodi, één kanaal of alle, selecteer een ander gezichtsveld, klik op voorbeeld, pas het gezichtsveld aan, stel deze parameters in en klik op start running om te beginnen met fotograferen. Maak eerst een testopname van 5 minuten; Het kan lang duren nadat de operatie normaal is.</li>
	<li>Nadat de opname is uitgevoerd, kiest u Bestand > Opslaan als > Opslagtype > avi-indeling om de gegevens naar een video in 'avi'-indeling te exporteren. Gebruik het afbeeldingsformaat '.nd2' om het gegevensprogramma op te slaan en de foto's te exporteren.</li>
	<li>Om het apparaat uit te schakelen, schakelt u het in omgekeerde volgorde uit.</li>
</ol>5. Statistieken en resultaatanalyse
<ol><li>Analyseer de gegevens met behulp van eenrichtings-ANOVA. Rapporteer de resultaten als het gemiddelde ± standaardfout.</li>
</ol>

Live celbeeldvorming van lipidedruppelgrootte en fusie met behulp van olie, rood, O en BODIPY

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
<li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+hypertrophy%3A+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816(2015).</li>
<li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis%3A+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li>
<li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis%3A+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li>
<li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+liver+disease%3A+from+basic+biology+to+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li>
<li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocellular+fat+stores%3A+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626(2020).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
<li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+%26%2334%3Bsupersized%26%2334%3B+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for phosphatidic acid in the formation of &#34;supersized&#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201(2011).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594(2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Afhankelijk van de pathologische toestanden ondergaan hepatische LDs enorme veranderingen in hun grootte en aantal. LDs zijn op grote schaal aanwezig in hepatocytencellen en spelen een sleutelrol bij de gezondheid en ziekte van de lever18. De hoeveelheid en grootte van LDs vormen de basis van het huidige onderzoek naar de biogenese van LDs19. De grootte en het aantal LD's voor cellen en weefsels weerspiegelen hun vermogen om energie op te slaan en vrij te geven. De dynamisc...

Accumulatie van lipidedruppels (LD) in hepatocyten is het typische kenmerk van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), die kan evolueren naar leverfibrose en hepatocellulair carcinoom. Het is gebleken dat de vroegste manifestatie van leververvetting steatose is, gekenmerkt door LD-accumulatie in het cytoplasma van de hepatocyt1. Leversteatose wordt steevast geassocieerd met een verhoogd aantal en/of uitgebreide grootte van LDs2. Van LDs wordt gedacht dat ze worden gegenereerd uit het endoplasmatisch reticulum (ER), bestaande uit triglyceride (TG) als kern, en zijn omgeven door eiwitten en fosfolipiden3. Als het subcellulaire organel dat verantwoordelijk is voor TG-opslag, vertonen LDs verschillende kenmerken met betrekking tot hun grootte, aantal, lipidensamenstelling, eiwitten en interactie met andere organellen, die allemaal van invloed zijn op celenergiehomeostase4. Het TG-niveau is positief gecorreleerd met de grootte van LDs en een hoger intracellulair TG-gehalte kan grotere LDs5 vormen. LDs nemen in omvang toe door de lokale synthese van TG, lipide-opname in het ER en de fusie van meerdere LDs6. Cellen (adipocyten, hepatocyten, enz.) die grote LD's bevatten, hebben een speciaal mechanisme om de lipidenopslag efficiënt te verhogen door LD-fusie. De dynamische veranderingen van LDs weerspiegelen de verschillende energiemetabolismetoestanden van de cel. Het is van cruciaal belang om methodologieën te ontwikkelen die de observatie en analyse van de verschillende lever-LDs in gezonde en abnormale cellen mogelijk maken.
De belangrijkste niet-fluorescerende kleurstoffen voor LDs zijn Sudan Black B en olierood O. Sudan Black B kleurt neutrale lipiden, fosfolipiden en steroïden7. Olierood O wordt voornamelijk gebruikt voor het kleuren van LDs van skeletspieren, cardiomyocyten, leverweefsel, vetcellen, enz.8., En wordt beschouwd als een standaardinstrument voor de kwantitatieve detectie van leversteatose bij muizen en mensen9. De dynamische verandering van LDs wordt voornamelijk uitgevoerd door fluorescentieverf. Nijlrood en BODIPY zijn beide veelgebruikte fluorescerende lipidekleurstoffen10,11. In vergelijking met Nijlrood heeft BODIPY een sterkere weefseldoorlaatbaarheid en bindt het beter met LDs12. BODIPY-gelabelde LDs kunnen worden gebruikt voor het kleuren van levende cellen en colokalisatie met andere organellen13.
De incidentie van leververvetting is significant hoger bij herkauwers dan bij monogastrische dieren14. Tijdens de overgangsperiode ervaren melkkoeien een toestand van negatieve energiebalans3. Grote hoeveelheden niet-veresterde vetzuren (palmitinezuur, oliezuur, linolzuur, enz.) worden gesynthetiseerd tot TG's in runderhepatocyten, wat leidt tot functionele afwijkingen in de lever en de kwaliteit van melkproducten en de productie-efficiëntie aanzienlijk vermindert15. De huidige studie heeft tot doel een protocol te bieden om de grootte en het aantal LD's te analyseren, evenals om de LD-fusiedynamiek te monitoren. We construeerden een model van LD-vorming door verschillende concentraties linolzuur (LA) toe te voegen in hepatocyten16 en observeerden de veranderingen in de grootte en het aantal LDs tijdens het proces door LDs te kleuren met olierode O. Bovendien werd het proces van de snelle fusie van LDs ook waargenomen door kleuring met BODIPY 493/503.

<table><tbody><tr><td>0.25% trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>reagens</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>reagens</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>invitrogen</td><td>2295015</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Cederolie</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>reagens</td></tr><tr><td>celtellingskamer</td><td></td><td></td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>celkweekschaal</td><td>Corning</td><td>353002</td><td>materiaal</td></tr><tr><td>cell sens software&nbsp;</td><td>Olympus IX73</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Gibco</td><td>2492319</td><td>reagens</td></tr><tr><td>hemotoxylin</td><td>DingGuo</td><td>AR0712</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Beeldweergave</td><td></td><td></td><td>beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Linolzuur</td><td>Solarbio</td><td>SL8520</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Live Cell Station</td><td>Nikon A1 HD25</td><td></td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>NIS-Elements&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Oil red O</td><td>Solarbio</td><td>G1260</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Optisch microscoop</td><td>Olympus IX73</td><td></td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>Penicilline &amp; Streptomycine 100&times;</td><td>NCM Biotech</td><td>CLOOC5</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>HyClone</td><td>SH30258.01</td><td>reagens</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>Sealing agent</td><td>Solarbio</td><td>S2150</td><td>reagens</td></tr></tbody></table>

evaluatie van lipidedruppelgrootte en fusie in boviene levercellen

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Lipidedruppeltjes (LDs) zijn organellen die een belangrijke rol spelen in het lipidenmetabolisme en neutrale lipidenopslag in cellen. Ze worden geassocieerd met een verscheidenheid aan metabole ziekten, zoals obesitas, leververvetting en diabetes. In levercellen zijn de grootte en het aantal LD's tekenen van leververvetting. Bovendien gaan de oxidatieve stressreactie, celautofagie en apoptose vaak gepaard met veranderingen in de grootte en het aantal LDs. Als gevolg hiervan vormen de afmetingen en hoeveelheid LD's de basis van het huidige onderzoek naar het mechanisme van LD-biogenese. Hier, in door vetzuren geïnduceerde runderlevercellen, beschrijven we hoe we olierode O kunnen gebruiken om LDs te kleuren en om de grootte en aantallen LDs te onderzoeken. De grootteverdeling van LDs wordt statistisch geanalyseerd. Het proces van kleine LDs die fuseren tot grote LDs wordt ook waargenomen door een live cell imaging systeem. Het huidige werk biedt een manier om de trend van grootteverandering van LDs onder verschillende fysiologische omstandigheden direct te observeren.

De kleuring van cel-LDs is weergegeven in figuur 1. De rode stippen weerspiegelen cel-LD's en de blauwe stippen weerspiegelen de kernen. Het is te zien dat de grootte en het aantal LDs in elke foto anders zijn onder de behandeling van LA.
Met de toename van de LA-dosering vertoonden de gemiddelde diameter en het aantal LD's een aanzienlijk stijgende trend, afhankelijk van de LA-concentratie (figuur 2). Zoals te zien is in <strong clas...

Het huidige protocol beschrijft hoe olierode O kan worden gebruikt om lipidedruppels (LD's) te verven, de grootte en het aantal LD's in een door vetzuren geïnduceerd vethepatocytenmodel te berekenen en BODIPY 493/503 te gebruiken om het proces van kleine LDs te observeren die fuseren tot grote LDs door middel van live cell imaging.

Evaluatie van lipidedruppelgrootte en fusie in boviene levercellen

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Ons onderzoek richt zich op het aantal lipidedruppels en de grootte geïnduceerd door linolzuur in levercellen. Daarnaast willen we inzicht geven in het mechanisme van de leververvetting. Recente ontwikkelingen op dit gebied van onderzoek, suggereert dat choline, CCT alfa, gevestigde geïnduceerde autofagie, lipide druppelgrootte in runderlevercellen kan reguleren.Bovendien hebben waarnemingen van levende celwerkstations aangetoond dat fosfolipiden een aanzienlijk effect hebben op lipidedruppelfusie. Momenteel worden genhulp, fluorescentiepincet, vloeistofchromatografie, omics-analyse, enkele chromatografie, flowcytometrie en andere technologieën gebruikt om het uitgebreide onderzoek op dit gebied te groeperen. De experimentele methode heeft enkele beperkingen.Het fenomeen van beperkte velden kan bijvoorbeeld alleen worden waargenomen voor lipidedruppelvelden en onder een bepaalde afvalvlucht. Oil Red O-kleuring is handiger, goedkoper en wordt op grotere schaal gebruikt om de schijnbare grootte van lipidedruppels te meten dan fluorescentiekleuring met lipidedruppels. Het is eenvoudig te bedienen en vereist minder apparatuur.Bovendien nemen we deze fenomenale lipidefusie direct waar v

evaluation-of-lipid-droplet-size-and-fusion-in-bovine-hepatic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.

Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Dit protocol voorziet een nieuwe methode van lipide druppel isolatie en zuivering van muis levers, met behulp van een gevestigde endoplasmatisch reticulum isolatie kit.

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het induceren van lever vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen met het vetzuur zout natriumoleaat en gebruiken we methoden voor de detectie en kwantificering van lipide accumulatie, inclusief coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO'S) microscopie, cytofluorimetrische analyse, olie rood O kleuring, en qPCR.

Het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen

Hierin demonstreren we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503 fluorescentie-gebaseerd protocol voor lipidedruppelkarakterisering in leverweefsel. Door het gebruik van orthogonale projecties en 3D-reconstructies maakt de fluorofoor een succesvolle discriminatie tussen microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen voor de beoordeling van leversteatose.

Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling

Dit artikel beschrijft het gebruik van door oliezuur geïnduceerde HepG2-cellen als model voor metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte.

In vitro modellering van vetafzetting bij metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte

Dit protocol maakt reproduceerbare visualisatie van lipidendruppels en organeldynamiek tijdens mitose mogelijk met behulp van gesynchroniseerde hepatomacellen.

Een fluorescentie-gebaseerde methode om de dynamica van lipidendruppels en organelen tijdens mitose in hepatomacellen te visualiseren

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 ×...

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Ontdek hoe je lipidedruppelgrootte en fusie in boviene levercellen evalueert met Oil Red O kleuring en live cell imaging. Deze methode biedt inzicht in vetleverontwikkeling en lipidenmetabolisme.

Evaluatie van lipidedruppelgrootte en fusie in boviene levercellen

Meer video's verkennen