Name: Directe synthese van EM-zichtbare gouden nanodeeltjes in cellen voor eiwitlokalisatieanalyse met goed bewaarde ultrastructuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer een nieuwe EM-labeltechniek voor eiwitdetectie met behoud van ultrastructuur. Deze methode synthetiseert gouden nanodeeltjes direct op individuele eiwitten voor precieze lokalisatie in E. coli en HeLa-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het hier beschreven protocol is afgeleid van het artikel gepubliceerd door Jiang et al. (2020). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de MOST (973-programma's nrs. 2011CB812502 en 2014CB849902) en door financiële steun van de gemeentelijke overheid van Beijing.

Alle benodigdheden die in dit experiment worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel. De stapsgewijze workflow van het huidige protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Celkweek op saffierschijven
<ol><li>Breng saffierschijven van 3 mm x 0,16 mm over naar een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml ethanol en soniceer gedurende 10 minuten in een ultrasone reiniger.</li>
	<li>Brand elke saffierschijf in een alcohollampvlam totdat er geen zichtbare afzettingen op het oppervlak zijn. OPMERKING: Via de bovenstaande methode kunnen saffierschijven vele malen worden gerecycled.</li>
	<li>Label één zijde van elke saffierschijf met een nummer met behulp van een oplosmiddelbestendige pen (figuur 1A). OPMERKING: De gebruikte markerpen moet van tevoren worden getest om te bepalen of deze bestand is tegen aceton en methanoloplosmiddelen om het verlies van markeringen te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de gelabelde saffierschijven op de bodem van een kweekschaal van 35 mm met de gelabelde zijde naar boven gericht.</li>
	<li>Steriliseer de celkweekschaal met saffierschijven onder UV-licht gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Draai de saffierschijven om met een pincet (de gelabelde kant naar beneden gericht) en steriliseer nog eens 30 minuten onder UV-licht. Nu is de kweekschaal met de saffierschijven klaar voor celkweek. OPMERKING: De saffierschijven kunnen ook worden gesteriliseerd door autoclaveren.</li>
	<li>Zaai de cellen op de hierboven bereide saffierschijven en groei tot 80% -90% confluentie in een celincubator bij 37 °C, 95% vochtigheid en 5% CO2 (figuur 1B). OPMERKING: Stabiele HeLa-cellijnen die MTn-tags tot expressie brengen, werden gegenereerd zoals beschreven in Jiang et al.26.</li>
</ol>2. Hogedrukbevriezing (HPF)
LET OP: Vloeibare stikstof wordt gebruikt in dit experiment. Gebruik bij het werken met vloeibare stikstof de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen om bevriezing en verstikking te voorkomen.
<ol><li>Bereid de hogedrukvriesmachine ten minste 2 uur voor het experiment voor volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Breng type A HPF aluminium dragers (uitsparing: 0,025 / 0,275 mm) over naar een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml ethanol en soniceer gedurende 10 minuten in een ultrasone reiniger.</li>
	<li>Droog de dragers in een petrischaaltje bedekt met kwalitatief filterpapier (gemiddelde snelheid).</li>
	<li>Week de voorgereinigde dragers in 1-hexadeceen. OPMERKING: BSA wordt niet aanbevolen als cryoprotectant in het huidige experiment, omdat het de daaropvolgende synthese van gouden nanodeeltjes zal verstoren.</li>
	<li>Gebruik een fijn pincet om een saffierschijf met cellen uit de kweekschaal te pakken; Raak het gelabelde oppervlak aan met kwalitatief filterpapier (gemiddelde snelheid) om het overtollige medium te verwijderen. OPMERKING: De thermische geleidbaarheid van water is zeer laag en te veel restwater zal het bevriezingseffect beïnvloeden. Houd zo min mogelijk water vast om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.</li>
	<li>Monteer de saffierschijf in de HPF-monsterhouder en sluit de schijf snel af met een 0,025 mm diepe aluminium drager met 1-hexadeceen (figuur 1C).</li>
	<li>Zuig overtollige oplossing aan met kwalitatief filtreerpapier (gemiddelde snelheid).</li>
	<li>Laad de monsterhouder voor het invriezen onder hoge druk (figuur 1D). OPMERKING: Het laadproces van het monster moet zo snel mogelijk zijn (binnen 1 minuut) om fysiologische veranderingen als gevolg van veranderingen in de temperatuur, vochtigheid, pH en zuurstofgehalte te minimaliseren.</li>
	<li>Laad de saffierschijfdragerassemblage onder vloeibare stikstof in een schuim cryobox en bewaar de assemblage in een cryovial in vloeibare stikstof voor gebruik. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De exemplaren in cryovialen kunnen jarenlang worden opgeslagen in een vloeibare stikstofdewar.</li>
</ol>3. Vriessubstitutiefixatie (FSF) en rehydratatie (figuur 1E)
<ol><li>Vul de automatische vriessubstitutiemachine (AFS) met vloeibare stikstof en koel de kamer tot −90 °C. LET OP: Vloeibare stikstof wordt gebruikt in dit experiment. Gebruik bij het werken met vloeibare stikstof de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen om bevriezing en verstikking te voorkomen.</li>
	<li>Bereid 2 ml 0,01% looizuur (g/v) in aceton (FSF-oplossing 1) in een ronde polypropyleencontainer van 20 mm (figuur 1E) in een zuurkast en vries deze in vloeibare stikstof in.</li>
	<li>Laad de monsters (de saffierschijfdragerassemblages) in de container met bevroren FSF-oplossing 1 onder LN2 met behulp van een voorgekoeld pincet.</li>
	<li>Breng de container over naar de voorgekoelde AFS-kamer voor FSF-verwerking bij −90 °C.</li>
	<li>Bewaar de monsters gedurende 1 uur bij −90 °C; Scheid vervolgens de saffierschijven van de dragers met een voorgekoeld pincet en zorg ervoor dat de gemarkeerde zijden van de saffierschijven naar beneden zijn gericht. OPMERKING: Het pincet moet voldoende voorgekoeld zijn om temperatuurveranderingen te voorkomen. De saffierschijven moeten gemakkelijk kunnen worden gescheiden.</li>
	<li>Nog 8-10 uur bij −90 °C bewaren; vervolgens binnen 3 uur opwarmen tot −60 °C.</li>
	<li>Vervang de FSF-oplossing 1 in de container door voorgekoeld aceton en incubeer gedurende 1 uur. Herhaal deze aceton wash 2x.</li>
	<li>Verwarm tot −30 °C binnen 3 uur. Bereid gedurende deze periode 2 ml 0,01% uranylacetaat in aceton (FSF-oplossing 2, verdund van 10% uranylacetaat in methanol) voor en koel deze voor in een centrifugebuis van 2 ml. LET OP: Uranylacetaat, gebruikt in het huidige experiment, is radioactief en zeer giftig; het moet worden behandeld volgens de juiste veiligheidsprocedures en worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval.</li>
	<li>Vervang de aceton door FSF-oplossing 2 en incubeer gedurende 3 uur bij −30 °C.</li>
	<li>Vervang de FSF-oplossing 2 in de container door voorgekoeld aceton en incubeer gedurende 30 minuten bij −30 °C. Herhaal deze aceton wash 2x.</li>
	<li>Verwarm van −30 °C tot 4 °C binnen 2 uur.</li>
	<li>Vervang de aceton door 2 ml 0,2 M HEPES-buffer met 1 mM CaCl 2 en 1 mM MgCl2 bij pH 5,5.</li>
	<li>Vervang de buffer eenmaal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 °C gedurende een nacht. OPMERKING: Het protocol kan hier een nacht worden gepauzeerd of ten minste 6 uur worden voortgezet totdat de monsters opnieuw zijn ingevroren in stap 5.</li>
</ol>4. ANSM-gebaseerde AuNP-synthese voor zoogdiercellen (figuur 1F)
<ol><li>Was met PBS-A buffer 3x gedurende 5 min elke keer.</li>
	<li>Breng de saffierschijven over in een kweekschaal van 35 mm met 1 ml PBS-A-buffer bij kamertemperatuur. OPMERKING: Houd altijd de gemarkeerde zijden van de saffierschijven naar beneden gericht en vermijd overlapping van de saffierschijven en wrijven van de cellen.</li>
	<li>Bereid de reducerende oplossing door 4,28 μL 2-mercaptoethanol toe te voegen aan een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml PBS-A-buffer en goed te mengen in een zuurkast. LET OP: 2-Mercaptoethanol is giftig en heeft een penetrante geur; Het moet worden behandeld volgens de juiste veiligheidsprocedures.</li>
	<li>Vervang de PBS-A-buffer in de kweekschaal door 1 ml reducerende oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid de gouden voorloper voor gebruik.<ol><li>Voeg 80 μL 10 mM HAuCl4 in ddH 2 O toe aan een centrifugebuis van2ml met 1 ml reducerende oplossing en onmiddellijk vortex. OPMERKING: De oplossing kan troebel worden.</li>
		<li>Voeg 80 μL 500 mM D-penicillamine in ddH2O toe aan de bovenstaande oplossing en onmiddellijk vortex. OPMERKING: De oplossing kan weer duidelijk worden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vervang de oplossing in de kweekschaal door de in stap 4.5 bereide 1 ml goudprecursoroplossing en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C. OPMERKING: Eén milliliter van de goudvoorloper is voldoende om te reageren met ongeveer 1 × 106 cellen (samenvloeiend op een schaal van 35 mm). Grotere volumes van de precursor zijn nodig wanneer de AuNP's aanzienlijk kleiner worden.</li>
	<li>Weeg 0,0038 g NaBH 4 af in een centrifugebuis van 1,5 ml, voeg 1 ml ijskoude ddH2O en vortex toe om vlak voor gebruik vers 100 mM NaBH4 te maken.</li>
	<li>Voeg 20-100 μL 100 mM NaBH 4 toe aan de oplossing uit stap4.6 , schud onmiddellijk om goed te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Bereid 100 mM NaBH4 vers voor onmiddellijk gebruik. Na het toevoegen van de NaBH4 zal de kleur van de oplossing geleidelijk rood worden en vervolgens verdiepen. Als er geen kleurverandering wordt waargenomen, geeft dit grotendeels aan dat het experiment is mislukt.</li>
	<li>Vervang de oplossing door 2 ml PBS-A-buffer om de reactie te stoppen. OPMERKING: Het stoppen van de reactie binnen 30 minuten is van cruciaal belang, omdat een langdurige reactie de AuNPs geleidelijk zal afbreken.</li>
</ol>5. Bevriezing onder hoge druk en bevriezingssubstitutiefixatie (figuur 1C-F)
OPMERKING: De monsters zijn weer HPF en FSF en de procedure is bijna hetzelfde als die eerder beschreven in sectie 2 en sectie 3, met een paar wijzigingen.
<ol><li>Bereid 1% osmiumtetroxide en 0,1% uranylacetaat in aceton (FSF-oplossing 3, verdund uit 4% osmiumtetroxide in aceton en 10% uranylacetaat in methanol). LET OP: Osmiumtetroxide en uranylacetaat zijn zeer giftige chemicaliën; Ze moeten volgens de juiste veiligheidsprocedures worden behandeld en als gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd.</li>
	<li>Laad de monsters (de saffierschijfdragerassemblages) in de container met bevroren FSF-oplossing 3 onder LN2 met behulp van een voorgekoeld pincet.</li>
	<li>Breng de container over naar de voorgekoelde AFS-kamer voor FSF-verwerking bij −90 °C en voer het FSF-programma als volgt uit: 8-10 uur bewaren bij −90 °C; vervolgens binnen 3 uur verwarmen tot −60 °C; gedurende 3 uur bij −60 °C bewaren; vervolgens binnen 3 uur verwarmen tot −30 °C; gedurende 3 uur bij −30 °C bewaren; vervolgens binnen 2 uur verwarmen tot 4 °C.</li>
	<li>Wanneer de temperatuur 4 °C bereikt, brengt u de monsters over naar de zuurkast en houdt u deze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Was met aceton 3x gedurende telkens 15 min.</li>
	<li>Behoud in aceton bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur.</li>
</ol>6. Harsinfiltratie, inbedding en polymerisatie
<ol><li>Bereid het epoxyharsmengsel voor gebruik volgens de instructies van de fabrikant. LET OP: De epoxyhars die in het huidige experiment wordt gebruikt, is giftig voorafgaand aan polymerisatie; Het moet worden behandeld volgens de juiste veiligheidsprocedures. Niet-gepolymeriseerde hars moet worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval of worden gepolymeriseerd voordat ze worden verwijderd.</li>
	<li>Breng de saffierschijven over in insluitcapsules met platte bodem en infiltreer gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur met hars. OPMERKING: Houd de gemarkeerde zijkanten van de saffierschijven naar beneden gericht.</li>
	<li>Polymeriseer het monster bij 60 °C in een oven gedurende ten minste 18 uur. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd na polymerisatie. Gepolymeriseerde monsterblokken kunnen jarenlang in een droge container worden bewaard.</li>
</ol>7. Ultradunne doorsnede
<ol><li>Snijd de gepolymeriseerde monsterblokken voorzichtig af met een scheermes om de saffierschijven bloot te leggen.</li>
	<li>Dompel de blokpunten met saffierschijven enkele seconden in vloeibare stikstof en ontdooi bij kamertemperatuur. Herhaal de vries-dooiactie meerdere keren om de schijven van de blokken los te maken. OPMERKING: Vermijd langdurig invriezen, omdat dit de monsterblokken kan kraken. Maak de saffierschijven voorzichtig los met een mes, vermijd overmatige kracht, die de monsters kan beschadigen.</li>
	<li>Snijd het blokvlak bij tot een trapeziumvorm voor ultradunne doorsnede (figuur 1G).</li>
	<li>Verkrijg 70-100 nm ultradunne secties met een ultramicrotoom (figuur 1H).</li>
	<li>Kies de secties op zeshoekige koperen roosters met 200 mazen. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd na sectie. De secties op gordels kunnen jarenlang in een droge container worden bewaard. Indien gewenst kunnen de secties op roosters worden gekleurd met 2% uranylaceton om een beter membraancontrast te verkrijgen. Loodkleuring moet worden vermeden omdat het de signalen van nanogouddeeltjes maskeert.</li>
</ol>8. TEM-beeldvorming (figuur 1I)
<ol><li>Onderzoek de ultradunne secties op koperen roosters met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop. Doorgaans is een vergrotingsbereik van 11 kX tot 30 kX geschikt voor het visualiseren van AuNP's in cellen, en een geschikte onscherptewaarde is nodig om ervoor te zorgen dat 2-3 nm AuNP's zichtbaar zijn.</li>
</ol>

Directe synthese van gouden nanodeeltjes voor analyse van eiwitlokalisatie

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Masters, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+the+electron+microscope+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Encylopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">History of the electron microscope in cell biology.</a> Encylopedia of Life Sciences. , (2009).</li>
<li>Griffiths, G., Hoppeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunocytochemistry%3A+Correlation+of+immunogold+labeling+to+absolute+number+of+membrane+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).</li>
<li>Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+into+and+out+of+the+Golgi+complex+studied+by+transfecting+cells+with+cDNAs+encoding+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase.</a> Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).</li>
<li>Grabenbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+and+electron+tomography+of+GFP+through+photooxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation.</a> Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).</li>
<li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296 (5567), 503-507 (2002).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biology. 9 (4), e1001041(2011).</li>
<li>Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+ascorbate+peroxidase+as+a+genetically+encoded+reporter+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Mavlyutov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APEX2-enhanced+electron+microscopy+distinguishes+sigma-1+receptor+localization+in+the+nucleoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum.</a> Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).</li>
<li>Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ferritin-based+label+for+cellular+electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A ferritin-based label for cellular electron cryotomography.</a> Structure. 19 (2), 147-154 (2011).</li>
<li>Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streptavidin-metallothionein+chimera+that+allows+specific+labeling+of+biological+materials+with+many+different+heavy+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).</li>
<li>Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocluster+formation+using+metallothionein%3A+Mass+spectrometry+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy.</a> Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).</li>
<li>Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatenated+metallothionein+as+a+clonable+gold+label+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).</li>
<li>Morphew, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+as+a+clonable+tag+for+protein+localization+by+electron+microscopy+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells.</a> Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).</li>
<li>Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+metallothionein+tag+enabling+efficient+protein+detection+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).</li>
<li>Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+as+a+clonable+high-density+marker+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).</li>
<li>Fukunaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+a+fusion+protein+of+postsynaptic+density-95+and+metallothionein+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).</li>
<li>Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+proteins+in+intact+cells+with+a+clonable+tag+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).</li>
<li>Risco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sensitive%2C+high-resolution+detection+of+protein+molecules+in+eukaryotic+cells+using+metal-tagging+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy.</a> Structure. 20 (5), 759-766 (2012).</li>
<li>Ding, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+role+for+the+host+Vps4+AAA%2B+ATPase+ESCRT+protein+in+the+formation+of+tomato+bushy+stunt+virus+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087(2014).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tags+for+direct+synthesis+of+EM-visible+gold+nanoparticles+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells.</a> Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).</li>
<li>Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+thiol-derivatised+gold+nanoparticles+in+a+two-phase+liquid-liquid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system.</a> Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).</li>
</ol>

De auteur verklaart geen belangenconflicten te hebben.

De studie presenteert hier een robuuste kloonbare EM-etiketteringstechnologie voor de visualisatie van eiwitmoleculen met één molecuul in de cellulaire omgeving met ultrastructurele resolutie. De AuNP's die direct worden gesynthetiseerd op genetisch gecodeerde cysteïnerijke tags zorgen voor een ondubbelzinnige en nauwkeurige lokalisatie van de doeleiwitten. Hogedrukvries- en vriessubstitutietechniek behoudt uitstekend de ultrastructuur van biologische monsters. Alles bij elkaar biedt de hier gepresenteerde kloonbare elek...

In het postgenomische tijdperk heeft de ontwikkeling van groen fluorescerend eiwit (GFP) als een single-molecule reporter voor lichtmicroscopie een revolutie teweeggebracht op het gebied van modern life science onderzoek 1,2. Al tientallen jaren is elektronenmicroscopie (EM) een krachtig hulpmiddel voor het intuïtief observeren van de cellulaire ultrastructuur met nanoschaalresolutie3; De precieze identificatie en lokalisatie van eiwitmoleculen blijft echter een uitdaging.
De meest gebruikte EM-etiketteringstechniek is de immuno-elektronenmicroscopie (IEM) etiketteringstechniek, die is gebaseerd op de antigeen-antilichaamreactie. Hoewel er veel technieken zijn ontwikkeld op het gebied van IEM-etikettering, waaronder pre-embedding IEM en post-embedding IEM (op harssecties of gehydrateerde cryosecties), lijdt het nog steeds aan een lage etiketteringsefficiëntie (<10%)4,5, wat verband houdt met de monstervoorbereiding en de antilichaamkwaliteit. Om deze beperkingen te overwinnen, heeft het ontwikkelen van genetisch gecodeerde tags een groot toepassingspotentieel.
Twee hoofdtypen EM-tags zijn de afgelopen jaren grondig onderzocht. Eén type is de DAB-kleuringsmethode, die tags zoals APEX2 gebruikt om 3,3'-diaminobenzidine (DAB) te oxideren tot osmiofiele polymeren voor EM-visualisatie 6,7,8,9,10,11,12. Het maakt het labelen van eiwitten met een hoge abundantie in subcellulaire regio's mogelijk, maar is niet geschikt voor het tellen van één molecuul. Het andere type maakt gebruik van metaalbindende eiwitten, zoals ferritine 13 en metallothioneïne (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, om elektronendichte metaalafzettingen te genereren in situ voor EM visualisatie. Alleen de laatste heeft echt potentieel voor visualisatie en tellen van één molecuul. De moleculaire grootte van ferritine is te groot (~ 450 kD) om als een veelbelovende tag te worden gebruikt, terwijl de kleine omvang (~ 5 kD) van MT en zijn vermogen om verschillende ionen te binden door zijn 20 cysteïnes veel aandacht hebben getrokken. Verschillende laboratoria hebben geprobeerd gezuiverde MT-fusie-eiwitten of MT-expressiecellen te labelen door rechtstreeks met Au + te broeden. Deze pogingen hebben aanvankelijk bewezen dat MT-tags goudionen kunnen binden om signalen met een hoog contrast te vormen, maar geen enkele heeft echt de effectieve identificatie van individuele eiwitten in cellen bereikt en ze zijn niet breed toepasbaar 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
De ANSM-gebaseerde AuNP-synthesetechniek, waarbij AuNP's van 2-6 nm-formaat rechtstreeks op cysteïnerijke tags (bijv. MT, de MT-varianten MTn en MTα, AFP) worden gesynthetiseerd als elektrondichte labels voor EM-visualisatie, is de eerste betrouwbare en toepasbare benadering voor eiwitetikettering en detectie van één molecuul in cellen24,25,26. Het maakt de specifieke synthese van AuNP's op geïsoleerde tagfusie-eiwitten mogelijk en heeft een ongekende etiketteringsefficiëntie bereikt in niet-gefixeerde of chemisch gefixeerde prokaryote (E. coli) en eukaryote (S. pombe) cellen. Het implementeren van hetzelfde protocol in meer geavanceerde systemen zoals zoogdiercellen of zelfs weefsels brengt echter extra uitdagingen met zich mee, zoals de complexere intracellulaire redoxhomeostase en de meer fragiele cellulaire structuur.
Deze studie presenteert een kloonbare EM-etiketteringstechnologie, die de nieuwe ANSM-gebaseerde AuNP-synthesetechniek combineert voor het labelen van genetisch gecodeerde cysteïnerijke tags (MT) met de HPF / FSF-rehydratie-HPF / FSF-monstervoorbereidingsmethode, maakt de ondubbelzinnige identificatie van gelabelde eiwitten in het ER-membraan, ER-lumen en mitochondriale matrix in HeLa-cellen mogelijk. De huidige methode combineert de kenmerken van hoge etiketteringsefficiëntie, een hoge signaal-ruisverhouding, single-molecule labeling en sterke universaliteit, en deze methode heeft brede toepassingsperspectieven in life science-onderzoek.

<table><tbody><tr><td>0.025 mm/0.275 mm Aluminium drager</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., of Engineering Office of M. Wohlwend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M HEPES buffer</td><td></td><td></td><td>Los HEPES (0.2 M) in 980 mL van ddH2O, voeg dan 10 mL van 100 mM MgCl2 en 10 mL van 100 mM CaCl2 (eindconcentratie 1 mM) toe, stel pH in op 5.5</td></tr><tr><td>1.5 mL MaxyClear snaplock microtube</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL polypropyleen schroefdop microtubes</td><td>Biologix</td><td>81-0204</td><td></td></tr><tr><td>200 mesh zeshoekige koperrooster</td><td>Tedpella inc</td><td>G200HEX</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Amresco</td><td>0482-250ML</td><td></td></tr><tr><td>35 mm celkweekschotels</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polypropyleen centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>430928</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Beijing Tong Guang Fine Chemicals Company</td><td>31025</td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerde vriessubstitutiemachine</td><td>Leica</td><td>AFS2</td><td></td></tr><tr><td>Aangepaste 3.05 mm x 0.66 mm specimenhouders voor HPF</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-penicillamine</td><td>TCI</td><td>P0147</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle medium</td><td>GBICO</td><td>C11965500BT</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>GBICO</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Vlakbodem inbeddingscapsule</td><td>Tedpella inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schuim cryobox</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 hars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>HAuCl4</td><td>Sigma</td><td>4022-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>HPF machine</td><td>Wohlwend&nbsp;</td><td>HPF compact01</td><td></td></tr><tr><td>Methonal&nbsp;</td><td>Beijing Tong Guang Fine Chemicals Company</td><td>12397</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma</td><td>480886-25G</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>PBS-A buffer</td><td></td><td></td><td>Los NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) op in 1 L van ddH2O, stel pH in op 7.4</td></tr><tr><td>Kwalitatieve filterpapier (middelsnelheid)</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>FFT08</td><td></td></tr><tr><td>Saffier schijven</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., of Engineering Office of M. Wohlwend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oplosmiddelresistente pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62053-B</td><td></td></tr><tr><td>SPI-Pon 812 hars</td><td>SPI Inc</td><td>02659-AB</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie elektronenmicroscopie</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 spirit</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GBICO</td><td>C25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramictotome</td><td>Leica</td><td>FC7</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetaat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

directe synthese van em-zichtbare gouden nanodeeltjes in cellen voor eiwitlokalisatieanalyse met goed bewaarde ultrastructuur

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

Het analyseren van de precieze lokalisatie van eiwitmoleculen in cellen met ultrastructurele resolutie is van groot belang voor de studie van verschillende fysiologische of pathologische processen in alle levende organismen. Daarom is de ontwikkeling van kloonbare tags die kunnen worden gebruikt als elektronenmicroscopie-sondes van grote waarde, net zoals fluorescerende eiwitten een cruciale rol hebben gespeeld op het gebied van optische beeldvorming. Het autonucleatieonderdrukkingsmechanisme (ANSM) werd onlangs ontdekt, dat de specifieke synthese van gouden nanodeeltjes (AuNP's) op cysteïnerijke tags mogelijk maakt, zoals metallothioneïne (MT) en antivrieseiwit (AFP).
Op basis van de ANSM werd een elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie ontwikkeld, die de specifieke detectie van gelabelde eiwitten in prokaryote en eukaryote cellen mogelijk maakt met een ongekende etiketteringsefficiëntie. Deze studie illustreert een protocol voor de detectie van MTn (een gemanipuleerde MT-variant zonder aldehyde-reactieve residuen) fusie-eiwitten in zoogdiercellen met goed bewaarde ultrastructuur. In dit protocol werden hogedrukbevriezing en vriessubstitutiefixatie uitgevoerd met behulp van niet-aldehydefixatieven (zoals looizuur, uranylacetaat) om de near-native ultrastructuur te behouden en schade aan de tagactiviteit veroorzaakt door aldehyde-crosslinking te voorkomen.
Een eenvoudige rehydratatie in één stap werd gebruikt voorafgaand aan de op ansm gebaseerde AuNP-synthese. De resultaten toonden aan dat de gelabelde eiwitten zich richtten op verschillende organellen, waaronder de membranen en het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER), en mitochondriale matrices werden gedetecteerd met hoge efficiëntie en specificiteit. Dit onderzoek biedt biologen een robuust protocol om een enorm scala aan biologische vragen op het niveau van één molecuul in cellulaire ultrastructurele contexten aan te pakken.

De op ANSM gebaseerde AuNP-synthesetechniek is een uiterst nuttig hulpmiddel voor het labelen en detecteren van MT-gelabelde eiwitten met TEM26. Om de robuustheid ervan in zoogdiercellen te valideren, werden drie stabiele cellijnen gegenereerd die EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn of Mito-acGFP-MTn in Hela-cellen tot expressie brengen. KDEL is een canonieke C-terminale endoplasmatisch reticulum (ER) retentie/retrieval sequentie, die het fusie-eiwit EGFP-MTn-KDEL in het ER-lumen of de perinucleaire ruim...

Het huidige protocol beschrijft een kloonbare elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie voor het detecteren van metallothioneïne-gelabelde eiwitten in cellen met behulp van een nieuwe op autonucleatieonderdrukkingsmechanisme gebaseerde gouden nanodeeltjessynthesetechniek.

Directe synthese van EM-zichtbare gouden nanodeeltjes in cellen voor eiwitlokalisatieanalyse met goed bewaarde ultrastructuur

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various ...

Eiwitdetectie en -lokalisatie zijn essentieel in biologisch onderzoek. Ons protocol beschrijft een nieuwe EM-etiketteringstechnologie met behulp van genetisch gecodeerde tags die visualisatie van één molecuul in situ mogelijk maakt met goed bewaarde ultrastructuur. Het is cruciaal om overfixatie te voorkomen.De etiketteringsmethode is gebaseerd op de activiteit van cysteïnes in de tags, die zeer gevoelig zijn voor aldehyde-crosslinking. Ons protocol vermijdt het gebruik van aldehydefixatieven en behoudt de tagactiviteit en ultrastructuur. tegelijkertijd.EM-etikettering is altijd een uitdaging geweest, lijdend aan slechte morfologie of inefficiënte etikettering. Onze protocollen synthetiseren in situ nanodeeltjes rechtstreeks op individuele eiwitten om een duidelijke en nauwkeurige lokalisatie van de doeleiwitten te bieden, met een hoge signaal-ruisverhouding, hoge efficiëntie en specificiteit. We hebben tot nu toe uitstekende etikettering bereikt in geïsoleerde eiwitten, E.coli-cellen, gistcellen en HeLa-cellen.We zullen de methode voor toepassing op weefselmonsters onderzoeken en optimaliseren. Het combineren van de heersende cryo-FIB- en cryo-EM-technologieën zal ons in staat stellen om belangrijke biologische vragen aan te pakken.

direct-synthesis-em-visible-gold-nanoparticles-cells-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

Gist, Saccharomyces cerevisiae, heeft een sleutelrol modelorganisme om genen die de biogenese en functies van het endosomale systeem te identificeren en te bestuderen geweest. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de specifieke kenmerken van de endosomale compartimenten voor ultrastructurele studies.

Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

De postembedding immunogold-methode is een van de meest effectieve manieren om hoogwaardige analyses van de subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen te leveren. Hier beschrijven we een protocol om glutamaatreceptoren bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Beschrijven we een methode voor de synthese van biocompatibel 10-nm gouden nanodeeltjes, matiemaatschappij door poly-ethyleen-glycol coating op het oppervlak. Deze deeltjes kunnen worden gebruikt in vitro en in vivo voor het leveren van therapeutics nanoschaal cellulaire en extracellulaire ruimten die zijn moeilijk toegankelijk met conventionele nanoparticle maten.

Synthese van matiemaatschappij 10-nm polymeer beklede gouddeeltjes voor endotheel Targeting en Drug Delivery

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Een betrouwbare en gemakkelijk reproduceerbare methode voor de voorbereiding van functionalizable, nabij-infrarood uitzendende fotoluminescente goudnanoclusters en hun directe detectie in HeLa-cellen door stromingscytometrie en confocale laserscanningmicroscopie wordt beschreven.

Synthese van near-infrared emitting gold nanoclusters voor biologische toepassingen

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

Leer een nieuwe EM-labeltechniek voor eiwitdetectie met behoud van ultrastructuur. Deze methode synthetiseert gouden nanodeeltjes direct op individuele eiwitten voor precieze lokalisatie in E. coli en HeLa-cellen.

Directe synthese van EM-zichtbare gouden nanodeeltjes in cellen voor eiwitlokalisatieanalyse met goed bewaarde ultrastructuur

Meer video's verkennen