Name: Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Leer een nauwkeurige methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen zoals de kleine bruine rijstcicade. Deze eenvoudige techniek maakt kwantitatief onderzoek naar virus-vectorinteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Key R&D Program of China (nr. 2022YFD1401700) en door de National Science Foundation of China (nr. 32090013 en nr. 32072385).

1. Insecten kweken
<ol><li>Verhoog de SBPHs die in dit experiment worden gebruikt in rijstzaailingen (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 rijstzaailingen in een incubator (65 mm x 200 mm) en groei bij 25 °C onder een 16 h lichte/8 h donkere fotoperiode.</li>
</ol>2. Dissectie van de SBPHs voor hemolymfeverzameling
<ol><li>Doe de SBPHs in een centrifugebuis en plaats ze 10-30 minuten in een ijsbad. OPMERKING: Plaats de SBPHs niet minder dan 10 minuten in het ijsbad, anders kunnen de insecten herleven.</li>
	<li>Plaats een bevroren SBPH op een glazen plaat (zie Materiaaltabel) onder een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel) met de buik naar boven gericht. Pas de focus aan op de zes poten van het insect.</li>
	<li>Bereid twee uiterst nauwkeurige pincetten (zie Materiaaltabel) met ultrafijne uiteinden. Gebruik een pincet om op het lichaam van het insect te drukken om het op zijn plaats te houden en gebruik het andere pincet om voorzichtig een van de poten van het insect te trekken. OPMERKING: Voor insecten met een harde schaal kan een oogheelkundig scalpel worden gebruikt voor het afsnijden van een van de benen.</li>
	<li>Druk zachtjes op de borst van het insect met een pincet om de hemolymfe door de wond naar buiten te laten stromen. OPMERKING: De hemolymfe presenteert zich als transparante druppels zonder zichtbare witte vlok. Gooi het lipide weg als er een witte vlok is, die vetlichaamsbesmetting vertegenwoordigt.</li>
</ol>3. Hemolymfe collectie met behulp van micropipettes
<ol><li>Maak een micropipette. Plaats een capillaire buis (zie materiaaltabel) met een volume van 1 μl in de pipetbol (zie materiaaltabel). Voor nauwkeurige metingen moet u ervoor zorgen dat de schaallijn zichtbaar is. OPMERKING: Een klein gaatje aan de bovenkant van de pipetbol is noodzakelijk.</li>
	<li>Houd bij het verzamelen van de hemolymfe de pipetbol van de micropipette vast en plaats de capillaire buis dicht bij de insectenwond. Verzamel de hemolymfe die uit de wond komt door eenvoudig de punt van het capillair aan de hemolymfe aan te raken.</li>
	<li>Blokkeer het kleine gaatje aan de bovenkant van de pipetbol iets met de vinger om het absorptieproces te stoppen wanneer de vloeistof in de capillaire buis de gewenste schaallijn bereikt. OPMERKING: Verzamel onophoudelijk en snel een monster van 1 μL hemolymfe om lipidebesmetting en buisverstopping te voorkomen.</li>
	<li>Druk op de pipetbol om de verzamelde hemolymfe af te voeren in 100 μL PBS-buffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4). OPMERKING: De capillaire buis wordt in de PBS-buffer ingebracht.</li>
	<li>Verander naar een nieuwe capillaire buis bij het verzamelen van nog eens 1 μL monster van hemolymfe.</li>
</ol>4. Coomassie Blauwe beits
<ol><li>Verzamel 3 hemolymfemonsters met hetzelfde volume (1 μL) van larven in het 3e stadium volgens de protocollen beschreven in stap 3 en voer de verzamelde hemolymfe af in de PBS-buffer om een totaal volume van 100 μL te maken.</li>
	<li>Voeg 25 μL 5x eiwitbelastingbuffer (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V Bromophenol Blue, 50% W/V glycerol, 5% W/V β-mercaptoethanol) toe aan 100 μL van de verdunde hemolymfemonsters en verwarm om de eiwitten te denatureren.</li>
	<li>Laad 20 μL van de gekookte monsters op een 10% SDS-PAGE eiwitgel (zie tabel met materialen) om de eiwitten te scheiden.</li>
	<li>Kleur de gel in een Coomassie Blue-oplossing (meng 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 met 250 ml isopropanol, 100 ml ijsazijn en 650 ml ddH2O en filter eventuele deeltjes uit met filterpapier) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en ontkleur de gel vervolgens gedurende 1 uur met ontkleuringsoplossing (100 ml azijnzuur, 400 ml methanol, 500 ml ddH2O).</li>
</ol>5. Bepaling van de eiwitconcentratie
<ol><li>Verdun 10 mg/ml runderserumalbumine (BSA) tot 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml en 0,3125 mg/ml met PBS-buffer met behulp van de tweevoudige verdunningsmethode.</li>
	<li>Zuig 5 μL PBS-buffer en elke concentratie BSA-oplossingen in stap 5.1 aan, voeg 1 ml 1x Bradford-kleurstofreagens toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik PBS-buffer in Bradford-kleurstofreagens als controle en nul bij OD = 595 nm. Meet de absorptiewaarden van elk van de resterende eiwitconcentraties en maak een standaardcurve.</li>
	<li>Voeg 1 μL hemolymfe van larvale, vrouwelijke of mannelijke SBPHs toe aan 100 μL PBS-buffer en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 100 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C om de hemocyten te verwijderen.</li>
	<li>Zuig 90 μL supernatant op een nieuwe centrifugebuis en meet de absorptiewaarden van het supernatant volgens de instructies in stap 5.2.</li>
	<li>Bereken de eiwitconcentraties van de hemolymfemonsters volgens de regressievergelijking van de standaardcurve. Neem drie biologische replicaties met drie technische replica's op in de experimenten.</li>
</ol>6. Microscopische detecties
<ol><li>Gebruik micropipetten om hemolymfe te verzamelen van 10-15 SBPHs in verschillende ontwikkelingsstadia. Voeg de verzamelde hemolymfe toe aan een buis met 20 μL 4% paraformaldehyde-oplossing (zie materiaaltabel). Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de hemolymfe te fixeren.</li>
	<li>Pipetteer 20 μL vaste hemocyten op het midden van een met silaan bekleed glaasje (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Droog de druppel op in een schuifdroogrek. OPMERKING: Vermijd overmatig drogen.</li>
	<li>Bedek het monster met goudantifade-reagens 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (zie materiaaltabel) en inspecteer de dia onder een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel).</li>
</ol>7. Celkwantificering
<ol><li>Verzamel 1 μL hemolymfe uit de SBPHs met een micropipette en los het op in 20 μL PBS-buffer.</li>
	<li>Verdun de hemolymfemonsters vijfvoudig met PBS-buffer.</li>
	<li>Pipetteer 20 μL hemolymfeoplossing in het midden van de celtelkamer (zie materiaaltabel). Bedek de druppel met een coverslip (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Tel de cellen in de vijf vierkanten op de celtelkamer (aanvullende figuur 1), onder een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel). Neem drie biologische replicaties met drie technische replica's op in elk van de experimenten. Cellen/μL = totaal aantal van vijf middelste kwadraten × 5 × verdunningsfactor × 104</li>
</ol>8. Statistische analyses
<ol><li>Voer statistische analyses uit met de bijbehorende software (zie Materiaaltabel). Maak een nieuw bestand en selecteer de kolom, importeer de gegevens en genereer een spreidingsplot met een balk.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde en de SD voor elke groep gegevens met behulp van kolomstatistieken en gebruik een eenrichtings-ANOVA-tool om de significantie van de verschillen tussen de groepen te evalueren. Bepaal het gemiddelde en de SD van drie biologische replicaties met drie onafhankelijke experimenten.</li>
</ol>

Hemolymfe verzamelen van kleine geleedpotigen

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Hemolymfe is het medium van de bloedsomloop in geleedpotigen en arbovirussen kunnen alleen andere geleedpotige weefsels binnendringen als ze de vijandige hemolymfe-omgeving kunnen overleven. Het verzamelen van een hoogwaardig monster van hemolymfe is de eerste stap in het bestuderen van de vector-virusinteracties die optreden in de hemolymfe. Er is gemeld dat hemolymfe van insecten kan worden verkregen op verschillende plaatsen op het lichaam van het insect, waaronder een wond op het voorbeen, een kleine incisie in het h...

Zowel dierlijke als plantaardige virussen kunnen worden overgedragen door geleedpotigen, en deze virussen vormen een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid en veroorzaken enorme economische verliezen in de landbouw 1,2,3. Belangrijk is dat de geleedpotige hemolymfe, die dient als de bloedsomloop en een vitaal element van het immuunsysteem in geleedpotigen, een belangrijke rol speelt bij het reguleren van arbovirale transmissie. Virussen verkregen via de geleedpotige darmen worden pas naar andere weefsels getransporteerd nadat ze met succes zijn ontsnapt aan de ongunstige hemolymfeomgeving 4,5,6,7. De levenscyclus van virussen in de geleedpotige hemolymfe omvat virusoverleving in het vloeibare plasma, binnenkomst in de hemocyt en transport naar andere weefsels, en verschillende virus-vectorinteractiemechanismen treden op in de hemolymfe 8,9,10,11,12. De verticale transmissie van RSV door de SBPH is bijvoorbeeld afhankelijk van een moleculaire interactie tussen het SBPH-vitellogenine-eiwit en het RSV-capside-eiwit (rijststreepvirus)13,14. Sommige virussen kunnen ontsnappen aan de immuunrespons van de hemolymfe door specifieke vectorfactoren te binden15,16,17,18. Daarom is het onderzoeken van vector-virusinteracties in de hemolymfe van geleedpotigen belangrijk voor het ontwikkelen van een beter begrip van arbovirusoverdracht.
De hemolymfe van sommige kleine insecten, zoals planthoppers, leafhoppers en sommige muggen, is moeilijk te verzamelen vanwege hun grootte. Om dit probleem aan te pakken, zijn verschillende methoden ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen, waaronder het rechtstreeks inbrengen van een spuitnaald in het insectenlichaam om een microvolume van de hemolymfe te extraheren, het verzamelen van exsudaat van de wondplaats met een pincet met een fijne punt en directe centrifugatie. Deze methoden hebben het mogelijk gemaakt om relatieve genexpressieniveaus en virale titers binnen de hemolymfe 19,20,21 te meten. Een effectieve methode voor het kwantificeren van het hemolymfevolume, die nodig is voor het tellen van hemocyten, eiwitkwantificering en enzymactiviteitsanalyse, is momenteel echter niet beschikbaar voor deze kleine insecten.
De SBPH (kleine bruine planthopper) is een soort kleine insectenvector met een lichaamslengte van ongeveer 2-4 mm. De SBPH is in staat om een verscheidenheid aan plantenvirussen over te brengen, waaronder RSV, maïs ruw dwergvirus en rijstzwart gestreept dwergvirus22,23,24. De interactie tussen de SBPH en RSV is het afgelopen decennium diepgaand bestudeerd. Om het werken met SBPHs te vergemakkelijken, hebben we een nieuwe en eenvoudige methode ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen. Deze methode, die is gebaseerd op het principe van capillaire krachten, maakt gebruik van een capillair met een schaalmarkering om de hemolymfe van het insect op een nauwkeurige en kwantificeerbare manier te verkrijgen. Dit stelt ons in staat om een specifiek volume hemolymfe van kleine insecten efficiënt te verzamelen en de hemolymfe-omgeving van kleine vectoren in meer detail te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE proteïnegeel</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Eiwitscheiding en detectie</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Voor fixatie van de cellen of weefsels&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford kleurreagens</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Eiwitconcentratie detectie</td></tr><tr><td>Capillair</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Voor het verzamelen van hemolymf</td></tr><tr><td>Celtellingskamer</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Tellen van hemocyten</td></tr><tr><td>Glasplaatje</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Voor het houden van insecten</td></tr><tr><td>Glasplaatje bekleed met silaan</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Voor het houden van microscoopmonsters</td></tr><tr><td>Gouden antifade reagens met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Kernkleuring</td></tr><tr><td>Microscoopdekglas</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Voor microscopisch onderzoek</td></tr><tr><td>Pipetbulb</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Voor het verzamelen van hemolymf</td></tr><tr><td>Prism 8.0 software</td><td>GraphPad Software</td><td>/</td><td>Statistische analyses</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Voor insectendissectie</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Voor insectendissectie</td></tr><tr><td>Zeiss geïnverteerde microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Observatie van hemocyten</td></tr></tbody></table>

een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Van geleedpotigen is bekend dat ze een verscheidenheid aan virussen van medisch en agrarisch belang overbrengen via hun hemolymfe, wat essentieel is voor virusoverdracht. Hemolymfeverzameling is de basistechnologie voor het bestuderen van virus-vectorinteracties. Hier beschrijven we een nieuwe en eenvoudige methode voor de kwantitatieve verzameling van hemolymfe van kleine geleedpotigen met behulp van Laodelphax striatellus (de kleine bruine planthopper, SBPH) als een onderzoeksmodel, omdat deze geleedpotige de belangrijkste vector is van het rijststreepvirus (RSV). In dit protocol begint het proces door voorzichtig een been van de bevroren geleedpotige af te knijpen met een pincet met een fijne punt en de hemolymfe uit de wond te drukken. Vervolgens wordt een eenvoudige micropipette bestaande uit een capillair en een pipetbol gebruikt om de transudatieve hemolymfe uit de wond te verzamelen volgens het principe van capillaire krachten. Ten slotte kan de verzamelde hemolymfe worden opgelost in een specifieke buffer voor verder onderzoek. Deze nieuwe methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen is een nuttig en efficiënt hulpmiddel voor verder onderzoek naar arbovirussen en vector-virus interacties.

Micropipette model en hemolymfe collectie We hebben een eenvoudige micropipette ontwikkeld waarvan de werking gebaseerd is op de capillaire krachten van de capillaire buis. De micropipette bestaat uit een capillaire buis en een pipetbol (figuur 1A). Capillaire buizen zijn verkrijgbaar in verschillende volumegroottes, variërend van 1 μL tot 20 μL, en de capillaire buisvolumes worden geselecteerd op basis van de vereisten. Capillaire buizen met kleinere volumes worden niet ...

We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.

Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Ons onderzoek richt zich op arbovirussen, insecten en plantinteracties. Het verkrijgen van hemolymfemonsters van kleine geleedpotigen vormt een technische uitdaging voor onderzoek naar door insecten overgedragen ziekten. Dit protocol toont een nauwkeurige en kwantificeerbare techniek om dit probleem tegen te gaan.Recente onderzoeksontwikkelingen in de overdracht van arbovirussen hebben ontdekt dat virussen verschillende belangrijke vectorfactoren kunnen manipuleren om de gastheerbarrière te doorbreken. Dit protocol is een eenvoudige, kosteneffectieve en waardevolle techniek die een nauwkeurige kwantificering van de hemolymfe mogelijk maakt. Deze methode biedt ook waardevolle technologie voor het starten van de interacties tussen virussen en vectoren.Ons komende onderzoek zal zich richten op het begrijpen van de moleculaire mechanismen van virusoverdracht door vectorinsecten, terwijl we nieuwe operationele technieken verkennen en verbeteren.

a-precise-quantifiable-method-for-collecting-hemolymph-from-small

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Amerikaanse degenkrab, Limulus polyphemus, is misschien wel de meest handige bron voor grote hoeveelheden bloed van een ongewervelde. Het bloed is eenvoudig in samenstelling, met slechts een cel-type in de algemene circulatie, de granulaire Amebocyte, en slechts drie overvloedige eiwitten in het plasma, hemocyanine, de C-reactieve proteïnen en α2-macroglobuline. Bloed wordt verzameld vanuit het hart en het bloed cellen en plasma worden gescheiden door centrifugeren.

Bloedafname van de Amerikaanse Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Geconserveerde insuline signaalwegen te vinden in de...

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster</em

Een vereenvoudigde toch nauwkeurige methode voor het verzamelen en vlekken mug hemocytes wordt beschreven. Onze methode combineert de eenvoud van perfusie met de nauwkeurigheid van hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren. Deze methode maakt studies vereist kennis van de soorten hemocytes en hun overvloed.

Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti</em

Insect hemocyten voeren tal van belangrijke functies, zowel immune als niet-immune, in alle stadia van insecten ontwikkeling. Onze huidige kennis van hemocyte soorten en functie komt van studies over insecten genetische modellen. Hier presenteren we een methode voor het extraheren, het kwantificeren en visualiseren hemocyten van wilde rupsen.

Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

De Drosophila hemolymph dient als zowel bloed als interstitiële vloeistof en circuleert door het hele lichaam tijdens de larve- en volwassen stadia. Deze video beschrijft een protocol om larvale hemolymph te verzamelen om de circulerende cellen te kwantificeren.

Cuticula disruptie: een methode om hemolymph te verzamelen van Drosophila larven

This video demonstrates the hemocyte disturbance assay, evaluating hemocyte re-adhesion in Drosophila larvae's hematopoietic pockets. Mechanical disturbance releases resident hemocytes, elevating circulating hemocyte counts. Post-recovery, re-adherence of resident hemocytes is confirmed, illustrating reversibility.

A Hemocyte Disturbance Assay to Assess Hemocyte Re-Adhesion to Hematopoietic Pockets

Drosophila bloedcellen, of hemocyten, circuleren tussen residente locaties en circulatie.  In de larve lokaliseren residente (sessile) hemocyten zich in inductief micro-omgevingen, de hematopoietische zakken, terwijl circulerende hemocyten vrij bewegen in de hemolymf. Het doel van dit protocol is de gestandaardiseerde isolatie en kwantificering van deze twee, gedragsmatig verschillende maar onderling uitwisselbare, hemocytpopulaties.

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Analyse van Tick hemolymph vertegenwoordigt een belangrijke bron van informatie over hoe sommige ziekteverwekkers ziekte veroorzaken en hoe teken immunologisch reageren op deze infectie. De huidige studie toont aan hoe inoculeren schimmel propagulen en het verzamelen van hemolymph van Rhipicephalus Microplus engorged vrouwtjes.

Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies

Dit protocol beschrijft een in vivo test van fagocytose die wordt gebruikt om het vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te beoordelen en te kwantificeren..

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

Leer een nauwkeurige methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen zoals de kleine bruine rijstcicade. Deze eenvoudige techniek maakt kwantitatief onderzoek naar virus-vectorinteracties mogelijk.

Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Meer video's verkennen