Name: Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerde methode voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator. Dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid voor adipocytendifferentiatiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Takahito Wada en Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Japan) bedanken voor hun experimentele hulp. Dit werk werd gefinancierd door de volgende beurzen aan Y.H.: onderzoeksbeurs van het University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, subsidienummer 19K17976; subsidie voor de Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) van de Japan Foundation for Applied Enzymology, subsidienummer 17F005; subsidie van de Stichting Farmacologisch Onderzoek; subsidie van de Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; subsidie van de MSD Life Science Foundation; subsidie van de Daiwa Securities Health Foundation; subsidie van de Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research subsidie van de Takeda Science Foundation; en subsidie van de SENSHIN Medical Research Foundation.

Alle dierproeven die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Tokio en uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de Universiteit van Tokio.
1. Bereiding van enzymoplossing en medium
<ol><li>Plaats beide zijden van inguinaal wit vetweefsel (rechter- en linkerkant, ongeveer 150 mg) van een 7-8 weken oude muis en 2,5 ml enzymoplossing in buis C van de dissociator.</li>
	<li>Reconstitueer Enzym D met 3 ml Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM)/F12 zonder foetaal runderserum (FBS) of antibiotica, Enzym R met 2,7 ml DMEM/F12 zonder FBS of antibiotica en Enzym A met 1 ml buffer A.</li>
	<li>Bereid 2,5 ml enzymoplossing door 100 μL enzym D, 50 μL enzym R, 12,5 μl enzym A en 2,35 ml DMEM/F12 zonder FBS of antibiotica toe te voegen aan buis C. Zet buis C met enzymoplossing op ijs.</li>
</ol>2. Isolatie van vetweefsel
<ol><li>Euthanaseer 7-8 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen (ongeveer 20 g) door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Op een schone bank, om inguinaal wit vetweefsel te isoleren, knipt u de huid met een stompe / scherpe schaar bij de buik en naar de onderste ledematen. Isoleer het vetweefsel van de binnenkant van de dijen met een scherpe/scherpe schaar. De ene kant van het liesweefsel wieghs ~75 mg.</li>
	<li>Plaats het geïsoleerde vetweefsel in buis C met enzymoplossing op ijs en houd de buis in de schone bank om de steriliteit te behouden.</li>
</ol>3. Gehakt en vertering van vetweefsel
<ol><li>Voeg op de schone bank 2,5 ml enzymoplossing toe aan buis C.</li>
	<li>Hak het vetweefsel in kleine stukjes door 50 keer met een scherpe/scherpe schaar te knippen. Snijd het vetweefsel in ~2 mm2 stukjes.</li>
	<li>Sluit de dop van buis C goed af, draai de buis ondersteboven en bevestig deze aan de huls van de weefseldissociator met de dop erop. Vergist het monster vervolgens gedurende ~40 minuten bij 37 °C. OPMERKING: Deze studie gebruikte gentleMACS Octo Dissociator met kachels (Miltenyi Biotec 130-096-427) en het vooraf geïnstalleerde programma "37C_mr_ATDK_1" werd gevolgd.</li>
</ol>4. Filtratie van celsuspensie
<ol><li>Voorwarm DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine tot 37 °C.</li>
	<li>Maak buis C los van de weefseldissociator en stop de spijsvertering door 5 ml DMEM / F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe te voegen en vier keer voorzichtig te pipetteren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 700 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C.</li>
	<li>Zuig het supernatant voorzichtig op zonder de celkorrel te verstoren.</li>
	<li>Resuspensie van de pellet door toevoeging van 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en vijf keer voorzichtig pipetteren.</li>
	<li>Filter de celsuspensie door een celzeef met een diameter van 70 μm die op een nieuwe buis van 50 ml wordt geplaatst.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten op 250 x g en resuspensie van de pellet in 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
</ol>5. Celbeplating
<ol><li>Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet door 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe te voegen en tien keer te pipetteren.</li>
	<li>Plaats de celsuspensie op een met collageen beklede schaal van 10 cm en plaats de gerechten gedurende 1-2 uur in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO2). OPMERKING: Collageen gecoate gerechten zijn niet absoluut vereist. Op basis van ervaring helpen met collageen bedekte gerechten echter de hechting van preadipocyten en verhogen zo de overleving van de cellen.</li>
	<li>Zuig het medium aan en was de cellen tweemaal met 3 ml PBS per wasbeurt.</li>
	<li>Voeg 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe en breng de gerechten terug naar de celkweekincubator (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>6. Doorgeven van preadipocyten
<ol><li>Zuig de volgende dag het medium op (de cellen zullen hechten en dus kan het medium worden aangezogen), was de cellen twee keer met 3 ml PBS per wasbeurt en voeg 10 ml DMEM / F12 toe met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken (meestal 4 dagen na SVF-isolatie), splitst u de cellen in vier met collageen bedekte gerechten van 10 cm.<ol><li>Zuig specifiek het medium op, was de cellen met PBS (kamertemperatuur [RT]), voeg 1 ml voorverwarmd 0,05% trypsine toe en incubeer gedurende 5 minuten in de celkweekincubator.</li>
		<li>Voeg 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe om de trypsine-activiteit te doven. Na het pipetteren, centrifugeer op 440 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Zuig het supernatant op, resuspendineer de cellen door 40 ml DMEM / F12 toe te voegen met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en plaats de cellen in vier met collageen bedekte schalen van 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Passeer de cellen opnieuw wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken.</li>
</ol>7. Bereiding van retrovirus dat SV40 groot T-antigeen tot expressie brengt voor vereeuwiging van preadipocyten (optioneel)
<ol><li>Ten minste 3 dagen voor de vereeuwiging, plaat Platinum-E (Plat-E) verpakkingscellen29 bij een dichtheid van 3,0 x 105 cellen / ml in 2 ml DMEM met 10% FBS zonder antibiotica. Gebruik een hemacytometer om de cellen te tellen.</li>
	<li>De volgende dag, transfect 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (voeg gen plasmide #1780 toe) met behulp van Lipofectamine 2000, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Zuig na 24 uur het medium aan en voeg 2 ml DMEM toe met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Oogst de volgende dag het retrovirale supernatant. Het retrovirus kan onmiddellijk worden gebruikt voor vereeuwiging of worden bewaard bij -80 °C.</li>
</ol>8. Onsterfelijkheid van preadipocyten met SV40 groot T-antigeen (optioneel)
<ol><li>Passage en breid de preadipocyten tweemaal uit na SVF-isolatie.</li>
	<li>Plaats de cellen in 6-putplaten met een dichtheid van 0,5-1,0 x 104 cellen / ml in 2 ml DMEM / F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Gebruik een hemacytometer om de cellen te tellen.</li>
	<li>Bereid de volgende dag 250 μL vers of ontdooid retrovirus dat SV40 groot T-antigeen tot expressie brengt per put van de 6-putplaten. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 440 x g en plaats het supernatant in een nieuwe buis.</li>
	<li>Voeg 750 μL DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en 1 μL polybreen per 250 μL retroviraal supernatant toe om het werkende virus te maken.</li>
	<li>Zuig het medium aan en voeg 1.000 μL van het werkende retrovirus toe aan elke put die preadipocyten bevat.</li>
	<li>Voeg 4 uur later 1 ml DMEM/F12 toe met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Scheid de volgende dag de geïnfecteerde preadipocyten in een schaal van 10 cm en selecteer de geïnfecteerde cellen met DMEM / F12 met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 500 μg / ml neomycine. Om de antibioticaselectie te controleren, bereidt u een schaal met niet-geïnfecteerde cellen met neomycine.</li>
	<li>Ga door met het passeren van de geïnfecteerde cellen met neomycine totdat alle niet-geïnfecteerde cellen in de monitorschaal dood zijn.</li>
</ol>9. Adipocytendifferentiatie
<ol><li>Plaats de cellen. Voor 12-well platen, plaat de cellen met een dichtheid van 4,0 x 104 cellen / ml in 1 ml DMEM / F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Wanneer de preadipocyten confluent worden (48-72 h na plating), zuig het medium op en vervang het door differentiatiemedium (zie tabel 1 voor samenstelling).</li>
	<li>Vervang op dag 2 van de differentiatie (d.w.z. 48 uur na het induceren van differentiatie) het medium door het onderhoudsmedium (zie tabel 1 voor de samenstelling). Vervang daarna het onderhoudsmedium om de 2 dagen. Terminale differentiatie wordt bereikt op dag 7 van differentiatie.</li>
	<li>Olie rood o kleuring<ol><li>Voor olierode o-kleuring, zuig het medium op en spoel de cellen met 1 ml PBS per put. Bevestig de cellen door 1 ml 4% formaldehyde per put toe te voegen en incuber de cellen gedurende 15 minuten bij RT.</li>
		<li>Verdun tijdens de incubatie de 0,5% olie rode o stockoplossing (in isopropylalcohol) tot 0,3% met ddH2O en filtreer de werkoplossing met een filtreerpapier.</li>
		<li>Verwijder na de 15 minuten incubatie de formaldehyde, spoel de cellen met 60% isopropylalcohol, voeg 1 ml gefilterde olie rode o-werkoplossing toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT.</li>
		<li>Was na de incubatie de cellen met stromend water. Observeer vervolgens met lipiden beladen adipocyten onder een omgekeerde microscoop (vergroting: 20x objectief en 10x oculair).</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA-expressie analyse OPMERKING: Zie tabel 2 voor de lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt.<ol><li>Zuig het medium aan en voeg 1 ml/putje trizol toe aan de put.</li>
		<li>Incubeer gedurende 15 minuten bij RT, maak de cellen los door pipetteren en verzamel de monsters in buizen van 1,5 ml. De monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C tot RNA-extractie.</li>
		<li>Ontdooi het bevroren monster tot RT, voeg 200 μL chloroform toe aan het monster en schud krachtig gedurende 15 s.</li>
		<li>Incubeer het monster gedurende 3 minuten bij RT en draai vervolgens gedurende 15 minuten bij 20.000 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de waterige fase (boven, kleurloos) en breng over op nieuwe buizen. Breng nooit de eiwitfase (midden, wit) of de fenol/chloroformfase (onder, roze) over.</li>
		<li>Voeg langzaam een gelijk volume van 70% EtOH toe en meng voorzichtig. Niet vortexen.</li>
		<li>Laad het monster (tot 700 μL) in een RNA-spinkolom in een verzamelbuis. Zorg ervoor dat u eventuele neerslag opneemt.</li>
		<li>Draai op 9.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en gooi de doorstroming dan weg.</li>
		<li>Voeg 700 μL buffer RW1 toe, draai bij 9.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis en voeg 500 μL buffer RPE toe.</li>
		<li>Draai op 9.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en gooi de doorstroming dan weg.</li>
		<li>Voeg 500 μL buffer RPE toe, draai gedurende 2 minuten bij 4 °C op 9.000 x g en gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis en draai (kolommen zonder buffer) gedurende 1-2 minuten bij 4 °C op 9.000 x g .</li>
		<li>Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml en voeg 30 μL RNase-vrij water rechtstreeks toe aan het kolommembraan.</li>
		<li>Incubeer het monster bij RT gedurende 1-2 min. Draai vervolgens op 9.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C om het RNA te elueren.</li>
		<li>Controleer de RNA-concentratie met behulp van een fluorspectrometer. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de concentratie hier uit te lijnen.</li>
		<li>Voer omgekeerde transcriptie uit met behulp van ~ 200 ng RNA-sjabloon. Gebruik een commerciële kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR-RT) kit en volg het protocol van de fabrikant. Verdun na de reactie het cDNA 20 keer tot 200 μL.</li>
		<li>Voeg 2,0 μL cDNA, 3,0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL 100 μM qPCR forward primer, 0,018 μL 100 μM qPCR reverse primer en 0,96 μL ddH2O toe aan elke put van een 384-well plaat.</li>
		<li>Voer een qPCR uit (houd de fase 20 °C 2 minuten en 95 °C gedurende 2 minuten vast; PCR-fase: 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 min; smeltcurvefase: 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 minuut en 95 °C gedurende 15 s). Gebruik de standaardcurvemethode voor kwantificering.</li>
	</ol></li>
</ol>

Semi-geautomatiseerde isolatie van wit vetweefsel van muizen

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li>
<li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology%3A+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+obesity%3A+from+discovery+to+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li>
<li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI%3A+The+Taiwan+biobank+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20%2C000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332(2010).</li>
<li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li>
<li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2%2C+a+lipid-activated+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li>
<li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li>
<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+co-localizes+with+PPAR%CE%B3+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044(2020).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729(2022).</li>
<li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR%CE%B3+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li>
<li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+a+simple%2C+reproducible%2C+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li>
<li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Surgery+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li>
<li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft een concurrerend financieel belang met betrekking tot dit werk.

Hier beschreven we een protocol voor isolatie van de SVF uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro uit te voeren. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering verminderde de experimentele variatie, verminderde het risico op besmetting en verhoogde reproduceerbaarheid. Hoewel deze procedure een cruciale stap is binnen het gepresenteerde protocol, is het proces sterk geautomatiseerd en is optimalisatie niet nodig. Afhankelijk van de leeftijd van de...

Vetweefselbiologie trekt steeds meer aandacht vanwege de groeiende prevalentie van obesitas en diabetes type 2 wereldwijd1. Adipocyten slaan overtollige energie op in de vorm van lipidedruppeltjes, die vrijkomen bij uithongering. Bovendien handhaaft vetweefsel systemische energiehomeostase door te dienen als een endocrien orgaan en te communiceren met andere weefsels 2,3. Intrigerend is dat zowel overtollig vetweefsel (obesitas) als vetverlies (lipodystrofie) verband houden met insulineresistentie en diabetes1. Adipocyten zijn onderverdeeld in drie soorten: wit, bruin en beige1. Witte adipocyten slaan voornamelijk overtollige energie op als lipiden, terwijl bruine en beige adipocyten energie in de vorm van warmte afvoeren via mitochondriaal ontkoppelingseiwit-1 (Ucp1)1,4. Met name beige adipocyten (ook wel "induceerbare" bruine adipocyten genoemd) verschijnen in wit vetweefsel als reactie op koude of sympathische stimulatie en vertonen genexpressiepatronen die overlappen met maar verschillen van die van "klassieke" bruine adipocyten5. Onlangs zijn bruine en beige adipocyten verwacht als potentiële doelwitten van anti-obesitas en anti-diabetes behandelingen gericht op "het verbeteren van de energiedissipatie" in plaats van "het onderdrukken van de energie-inname"4. Ondersteunend wordt gemeld dat het risico-allel van de FTO-obesitasvariant rs1421085 bij mensen, dat de sterkste associatie vertoont met een hogere body mass index (BMI) onder veel voorkomende varianten6,7 en verschillende gen-omgevingsinteracties vertoont 8,9, de beige adipocytendifferentiatie en -functie negatief reguleert10. Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) staat bekend als een master transcriptionele regulator van adipogenesis en is noodzakelijk en voldoende voor adipocytendifferentiatie11. Transcriptionele regulatoren, zoals PRD1-BF1-RIZ1 homoloog domein met 16 (PRDM16), vroege b-celfactor 2 (EBF2) en nucleaire factor I-A (NFIA), zijn cruciaal voor bruine en beige adipocytendifferentiatie en functie 12,13,14,15,16,17,18. Aan de andere kant vereist witte adipocytengenprogrammering transcriptionele regulatoren, zoals transducine-achtig versterkereiwit 3 (TLE3) en zinkvingereiwit 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro modelsystemen maken het mogelijk om moleculaire studies uit te voeren die gericht zijn op het verbeteren van het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de functies en disfuncties van adipocyten. Hoewel openbaar beschikbare en vereeuwigde preadipocytencellijnen zoals 3T3-L1 en 3T3-F442A 22,23,24 bestaan, zou de cultuur van primaire preadipocyten en differentiatie in adipocyten een geschikter model zijn voor het bestuderen van in vivo adipogenese. Isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel is een bekende methode voor het verkrijgen van primaire preadipocyten25,26. Collagenasevertering van vetweefsel, die vaak wordt uitgevoerd met behulp van een bacteriële shaker met een buizenrek, kan echter resulteren in experimentele variatie en is gevoelig voor besmetting27,28. Hier beschrijven we een alternatief protocol dat een zachte magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) weefseldissociator gebruikt voor collagenasevertering om gemakkelijker isolatie van de SVF te bereiken.

<table><tbody><tr><td>100 mm dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>inhoud: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A en Buffer A</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &micro;m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Collagen coated dishes, 100 mm</td><td>BD</td><td>#356450</td><td></td></tr><tr><td>Collagen coated dishes, 60 mm</td><td>BD</td><td>#354401</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I Coat Microplate 6 well</td><td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Forceps</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, blunt/sharp</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, sharp/sharp</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACSOcto Dissociator with Heaters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Injection U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Isobutylmethylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin Sulfate</td><td>Fujifilm</td><td>146-08871&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>Add gene</td><td>#1780</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td><td>cell biolab</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

De in vitro studie van witte, bruine en beige adipocytendifferentiatie maakt het mogelijk om celautonome functies van adipocyten en hun mechanismen te onderzoeken. Vereeuwigde witte preadipocytencellijnen zijn openbaar beschikbaar en worden veel gebruikt. De opkomst van beige adipocyten in wit vetweefsel als reactie op externe signalen is echter moeilijk volledig samen te vatten met behulp van openbaar beschikbare witte adipocytencellijnen. Isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel wordt vaak uitgevoerd om primaire preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie uit te voeren. Het hakken en collagenaseverteren van vetweefsel met de hand kan echter resulteren in experimentele variatie en is gevoelig voor besmetting. Hier presenteren we een aangepast semi-geautomatiseerd protocol dat een weefseldissociator gebruikt voor collagenasevertering om een eenvoudigere isolatie van de SVF te bereiken, met als doel experimentele variatie te verminderen, verontreiniging te verminderen en de reproduceerbaarheid te vergroten. De verkregen preadipocyten en gedifferentieerde adipocyten kunnen worden gebruikt voor functionele en mechanistische analyses.

Dit protocol levert volledig gedifferentieerde, lipide-beladen adipocyten 7 dagen na het induceren van adipocytendifferentiatie. De mate van adipocytendifferentiatie kan worden geëvalueerd door de olierode o-kleuring van triglyceriden en lipiden (figuur 1A), of mRNA-expressieanalyse met behulp van qPCR-RT van adipocytengenen, zoals de hoofdregulator van adipogenese Pparg en zijn doelwit Fabp4 (figuur 1B). Om beige adipocytendifferentiatie i...

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

We zijn geïnteresseerd in bruine en beige subtypen van adipocyten die energie afvoeren in de vorm van warmte, terwijl witte adipocyten over het algemeen energie opslaan als Ons doel is om een nieuwe behandeling voor obesitas en diabetes te ontwikkelen op basis van bevordering van energieverbruik, in plaats van onderdrukking van energie-inname. We hebben een transcriptiefactor, NFI, geïdentificeerd als een kritische regulator van bruine adipocytendifferentiatie door een genoombrede open chromatineanalyse. NFI en de master transcriptionele regulator van adipogenese, PPAR-gamma, co-lokaliseren als de bruin-vet-specifieke versterkers.In het proces van het isoleren van stromale vasculaire fractie uit vetweefsel van muizen, kan handmatig gehakt en collagenasevertering van vetweefsel leiden tot experimentele variabiliteit en contaminatie. Onze methode maakt gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering, die SVF-isolatie vergemakkelijkt, experimentele variabiliteit en contaminatie vermindert en de reproduceerbaarheid verbetert. Experimenten met individueel gedifferentieerde adipocyten zijn onmisbaar voor onderzoek in ons vakgebied.Ons protocol zou eenvoudige en reproduceerbare SVF-isolatie bieden voor daaropvolgende adipocytendifferentiatie en zou het onderzoek in onze gemeenschap versnellen. Momenteel onderzoeken we de rol van NFI van het metabolisme van het hele lichaam, zoals lichaamsgewicht en glucose, met behulp van winst en verlies van functiemuismodellen. We zullen in de nabije toekomst ook andere farmacologische activering van NFI voor elke stroomafwaartse route onderzoeken.

semi-automated-isolation-stromal-vascular-fraction-from-murine-white

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

Vetweefsel (AT) is een site van intense immuun cel activatie en interactie. Vrijwel alle cellen van het immuunsysteem aanwezig zijn in AT en hun verhoudingen worden veranderd door obesitas. Goede isolatie, kwantificering en karakterisering van AT immuuncelpopulaties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van hun rol in immunometabolic ziekte.

Isolatie van Vetweefsel immuuncellen

Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.

Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Hier beschrijven we de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, waardoor de perivasculaire vetweefselfunctie en de relatie met vasculaire cellen kunnen worden bestudeerd.

Isolatie, kweek en adipogene inductie van van stromale vasculaire fractie afgeleide preadipocyten uit periiaorta-vetweefsel van muizen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer een semi-geautomatiseerde methode voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator. Dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid voor adipocytendifferentiatiestudies.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator (Video) | JoVE Journal

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Meer video's verkennen