Name: Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer een gestandaardiseerde RNAi-overervingsassay met ChIP in C. elegans om transgenerationele epigenetische mechanismen te onderzoeken. Deze methode helpt onderzoekers chromatine-modificaties en kleine RNA-routes te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de laboratoria in de C. elegans-gemeenschap bedanken die de gereedschappen hebben ontwikkeld en gedeeld en wiens werk in dit manuscript wordt geciteerd. Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) aan A.L.S. (PJT-175245). CL wordt ondersteund door een postdoctorale beurs van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (PGS-D).

Epigenetische overerving en ChIP bij Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Alle auteurs bevestigen dat ze geen conflicten hebben om bekend te maken.

In dit protocol wordt dsRNA geïntroduceerd door middel van voeding, wat een standaardmethode is geworden in C. elegans18. Voor RNAi-overervingstests biedt de voedingsbenadering een gemakkelijke methode om een grote P0-populatie te verkrijgen: 2,11,12,22,23,24,25. De timing en duur van de blootstelling aan RNAi beïnvloedt echter de werkzaamheid van transgene silencing26, en de concentratie van RNAi-bacteriën beïnvloedt de persistentie van erfelijke RNAi-uitschakeling1. Daarom zijn gestandaardiseerde RNAi-bacteriën en wormgroei belangrijk om een consistent niveau van GFP-uitschakeling en overervingsduur te verkrijgen. Hier worden embryo's op RNAi-platen geplaatst, zodat P0-dieren worden blootgesteld aan RNAi-bacteriën die uit het ei komen. Alternatieve benaderingen hebben gesynchroniseerde L1 24,27 ofL4 25 stadium dieren op RNAi-NGM-platen geplaatst. Bovendien, aangezien hongersnood en andere spanningen van invloed zijn op het behoud van RNAi-overerving13, moeten platen worden gecontroleerd om overbevolking en uitputting van de voedselvoorraad te voorkomen. Als alternatief voor het initiëren van RNAi door voeding, induceerden sommige van de pionier C. elegans RNAi-overervingsstudies RNAi door middel van gonadeninjectie, wat een grotere controle van de dsRNA-concentratie 1,28 biedt.
In dit protocol wordt elke generatie gepasseerd als een populatie met alkalische hypochlorietbehandeling, zoals eerder beschreven 16,22,23,24. Hypochlorietbehandeling zorgt ervoor dat de F1-generatie niet besmet raakt met RNAi-bacteriën uit de ouderlijke omgeving22 en voorkomt mogelijke ongewenste knelpunten in de populatie. Bulkpassing kan echter ook een beperking zijn, aangezien individuele dieren verschillende overervingspatronen kunnen hebben 1,29. Een alternatieve methode om elke generatie vast te stellen is het selecteren van individuele dieren 1,2,9,11,25. Deze aanpak maakt het mogelijk om fenotypes binnen afstammingslijnen te volgen en genetische kruisingen op te nemen. Afstammingsanalyse kan ook voordelig zijn voor fenotypes met een lage penetrantie12.
Fluorescerende eiwitexpressie is een krachtige en gemakkelijke uitlezing van RNAi-geïnduceerde uitschakeling 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Zoals beschreven in dit protocol, kan GFP-expressie handmatig worden gescoord als AAN of UIT 11,12,15,16,25. Handmatig scoren kan verder worden verfijnd door kwalitatieve intensiteitsniveaus 3,4,14 toe te kennen. Als alternatief kan geautomatiseerde intensiteitsscore van microscopiebeelden 11,12,14,25,27 of flowcytometriefluorescentiemeting van levende dieren2 een kwantitatieve uitlezing met hoge doorvoer opleveren. Aangezien de expressie van de verslaggever echter beperkt is tot de kiembaan, is een voorbehoud bij geautomatiseerde benaderingen dat ze ook onderscheid moeten maken tussen dieren met gedempte GFP-expressie versus dieren zonder kiembaan, vooral als de studie mutanten bevat met een abnormale kiembaanontwikkeling. Als alternatief voor GFP-fluorescentie kan reverse transcriptie (RT)-qPCR worden gebruikt om RNAi-target pre-mRNA- en mRNA-niveaus 2,16,23,24 te kwantificeren. Deze aanpak zorgt voor een directere uitlezing van silencing, die zich richt op RNA, en is vooral nuttig voor andere RNAi-targets waar silencing geen zichtbaar fenotype oplevert. Een beperking van het gebruik van kunstmatige GFP-reporters is dat exogene en endogene sequenties differentieel worden gereguleerd in transgenerationeelRNAi 11. Studies met endogene doelwitten, zoals het temperatuurgevoelige embryonale letale alleloma-1(zu405)1,11,16,25, moeten daarom worden beschouwd als een aanvullende benadering van fluorescerende transgene reporters.
De analyse van ChIP in de context van RNAi-overervingstesten vereist een vergelijking tussen behandelingen en replicaten. Ten eerste, om rekening te houden met verschillen in uitgangsmateriaal tussen monsters, wordt het ChIP-signaal genormaliseerd naar het ingangssignaal op dezelfde locus als het 'percentage input'. Het parallel verwerken van een histon H3 ChIP zal helpen bepalen of eventuele histonmodificatieveranderingen overeenkomen met veranderingen in nucleosoomdichtheid. Omdat ChIP een proces is dat uit meerdere stappen bestaat, kan de efficiëntie bovendien variëren tussen monsters. De selectie van geschikte positieve en negatieve controleloci is nuttig om de signaal-ruisverhouding tussen monsters en experimenten te evalueren en te vergelijken. Om vergelijkingen tussen monsters te vergemakkelijken, worden de ChIP-DNA qPCR-drempelcycluswaarden op het RNAi-doelwit bovendien vaak genormaliseerd naar een controlelocus 3,11,15,23,30,31. Om de effecten van de RNAi-behandeling te evalueren, wordt ook de verhouding van het ChIP-signaal in behandelings-RNAi versus controle- of geen RNAi-omstandigheden vergeleken. Een beperking van de huidige aanpak is dat ChIP wordt uitgevoerd met hele dieren, terwijl de respons op RNAi-behandeling uniek kan zijn voor de kiembaan. Een manier om dit voorbehoud te overwinnen is om ChIP uit te voeren met behulp van geïsoleerde kiembaankernen. Aanvullende technische overwegingen voor het optimaliseren van ChIP zijn elders ook uitgebreid besproken32,33.
Over het algemeen biedt dit RNAi-overervings- en ChIP-protocol een gedetailleerde en gemakkelijk aan te passen basis die kan worden geïntegreerd met andere technieken om transgenerationele epigenetische regulatie verder te onderzoeken. Zo kunnen bijvoorbeeld high throughput sequencing-bibliotheken worden geconstrueerd uit het ChIP-DNA (ChIP-seq) voor een gedetailleerder beeld van het chromatinelandschap, zowel proximaal van het RNAi-doelwit als op genoombrede schaal.

Epigenetische overerving maakt de overdracht van genregulerende informatie over generaties mogelijk en kan daarom de omgeving of ervaringen van ouders in staat stellen hun nageslacht te beïnvloeden. Bij C. elegans kan kiembaangenuitschakeling geïnitieerd door exogeen dubbelstrengs RNA (dsRNA) gedurende meerdere generaties worden overgeërfd in nakomelingen die niet zijn blootgesteld aan de oorspronkelijke trigger 1,2,3,4. Dit proces, RNA-interferentie (RNAi) overerving genoemd, is een van de vele verwante epigenetische uitschakelingsfenomenen in C. elegans, waaronder piRNA-geïnitieerde multigenerationele uitschakeling 2,5, paramutatie/RNAe (RNA-geïnduceerde epigenetische uitschakeling)6,7,8, en multicopy array-geïnitieerde uitschakeling9, die overlappende maar verschillende vereisten hebben voor kleine RNA- en chromatineregulatiemachines . In exogeen RNAi van C. elegans wordt dsRNA verwerkt tot kleine interfererende RNA's (siRNA's) die in een complex met primaire Argonaute-eiwitten werken om hun doel-mRNA te herkennen. Deze targeting leidt tot de amplificatie van secundaire siRNA's die associëren met secundaire Argonauten om doel-mRNA het zwijgen op te leggen via zowel cytoplasmatische als nucleaire uitschakelingsroutes. Voor kiembaan-tot expressie gebrachte RNAi-doelen richten de nucleaire secundaire Argonaute HRDE-1 en aanvullende nucleaire RNAi-factoren zich op ontluikende transcripten, wat resulteert in transcriptionele repressie en rekrutering van histonmethyltransferasen om onderdrukkende chromatinemarkeringen af te zetten, waaronder H3K9me310. Histon H3K9me3 bevordert de totstandbrenging van erfelijke uitschakeling van kiembaan-tot expressie gebrachte groen fluorescerende proteïne (GFP) transgenen door RNAi-overerving11,12.
Het doel van dit protocol is om een transgen te gebruiken dat een GFP-histonfusie-eiwit in de kiembaan tot expressie brengt als reporter voor RNAi-overerving en om veranderingen in histonmodificaties op de locus van het reportertransgen te testen met behulp van chromatine-immunoprecipitatie en kwantitatieve polymerasekettingreactie (ChIP-qPCR). Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde, op platen gebaseerde RNAi-voedingsbenadering om reporter silencing te initiëren. Het biedt ook een gedetailleerde tijdlijn voor het passeren van dieren tussen generaties door in utero embryo's van drachtige volwassenen te isoleren door middel van alkalische hypochlorietbehandeling ('bleken'). Methoden en representatieve gegevens voor het monitoren van de frequentie van GFP-uitschakeling in een subgroep van de populatie door middel van fluorescentiemicroscopie en voor histon H3K9me3 ChIP-qPCR worden ook beschreven. Op reporters gebaseerde RNAi-overervingstests bieden een zeer handelbaar systeem om de rol van genetische en omgevingsfactoren in epigenetische regulatie functioneel te ontleden 13,14, en genetische screenings met behulp van dergelijke reporters hebben zowel genen geïdentificeerd die nodig zijn voor 2,3,15 als genen die 16,17 de duur van transgenerationele epigenetische overerving negatief reguleren.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Maak een oplossing van 100 mg/mL in ultrapuur water. Filter-steriliseer en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>Concentratie is batch-afhankelijk (0,9 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Concentratie is batch-afhankelijk (0,7 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Bleach (6% Sodium hypochlorite)</td><td>Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans stam met GFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>SX1263</td><td>Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). Een geschenk van E. Miska lab, University of Cambridge.</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Maak een oplossing van 25 mg/mL in ultrapuur water. Filter-steriliseer en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli stam HT115(DE3)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli stam OP50-1</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie Stereoscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>Maak een 1,25 M oplossing en bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobe Geprinte Slides, 10 putjes</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (Octylfenol ethoxylaat)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Maak een 10% (v/v) oplossing in ultrapuur water en bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-&beta;-D-thiogalactoside)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Maak een 0,2 g/mL oplossing in ultrapuur water. Filter-steriliseer en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Platen aangevuld met 100 &micro;g/mL Ampicilline</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Standaard lab recept.</td></tr><tr><td>Levamisol (Tetramisol hydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Maak een 200 mM oplossing in ultrapuur water. Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>LiCl (8 M)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Magnetische Separator (1,5 mL buizen)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Separator (0,2 mL buizen)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopdekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>Technologist Choice</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>Voor ChIP buffers.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Maak een 10 M oplossing en bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>NGM Platen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 &micro;g/mL cholesterol, 25 mM Kalium fosfaat pH 6,0, 1 mM MgSO4, 50 &micro;g/mL streptomycine.</td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG (1 mg/mL)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid - Control RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plasmid #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid - GFP-targetting RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plasmid #1649)</td><td>Opmerking, alternatieve L4440-afgeleide plasmiden die op GFP targetten kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Primerpaar [-3,3 kb stroomafwaarts van gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Primerpaar [+1,3 kb stroomafwaarts van gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Primerpaar [clec-18]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>Primerpaar [gfp exon 1]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>Primerpaar [gfp exon 4]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>Primerpaar [hrp-2]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Detectie Systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNAi-NGM platen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 &micro;g/mL cholesterol, 25 mM Kalium fosfaat buffer pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 &micro;g/mL carbenciline en 5 mM IPTG.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>

analyse van transgenerationele epigenetische overerving in c. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (chip)

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Transgenerationele epigenetische overerving (TEI) maakt de overdracht van informatie door de kiembaan mogelijk zonder de genoomsequentie te veranderen, door factoren zoals niet-coderende RNA's en chromatinemodificaties. Het fenomeen van RNA-interferentie (RNAi) overerving in de nematode Caenorhabditis elegans is een effectief model om TEI te onderzoeken dat profiteert van de korte levenscyclus, zelfvoortplanting en transparantie van dit modelorganisme. Bij RNAi-overerving leidt blootstelling van dieren aan RNAi tot gen-uitschakeling en veranderde chromatinesignaturen op de doellocus die meerdere generaties aanhouden in afwezigheid van de initiële trigger. Dit protocol beschrijft de analyse van RNAi-overerving in C. elegans met behulp van een kiembaan-expressie nucleair groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter. Reporter silencing wordt geïnitieerd door de dieren bacteriën te voeren die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen dat gericht is op GFP. Bij elke generatie worden dieren gepasseerd om een gesynchroniseerde ontwikkeling te behouden, en de uitschakeling van reportergenen wordt bepaald door microscopie. Bij geselecteerde generaties worden populaties verzameld en verwerkt voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) om histonmodificatieverrijking op de GFP-reporterlocus te meten. Dit protocol voor het bestuderen van RNAi-overerving kan eenvoudig worden aangepast en gecombineerd met andere analyses om TEI-factoren in kleine RNA- en chromatineroutes verder te onderzoeken.

Dieren die drager waren van het tot kiembaan tot expressie gebrachte GFP-histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 reporter (Figuur 2A) werden blootgesteld aan GFP-RNAi of controle-RNAi door te voeren, en werden gepasseerd zoals beschreven in het protocol en figuur 1. Het nucleaire GFP-signaal in de kiembaan werd handmatig gescoord met behulp van een fluorescentie-ontleedmicroscoop voor een steekproef van de populatie bij elke generatie. Het uitschakelen van het transgen was volledig penetrant bij de gescoorde P0- en F1-dieren die werden behandeld met GFP-RNAi (figuur 2B). In de F2-generatie was het aandeel van de bevolking dat overerving van GFP-uitschakeling vertoonde ongeveer 50%. Bij de F5-generatie vertoonde de meerderheid van de populatie geen overerving van uitschakeling, en bij de F10-generatie werd geen overerving gedetecteerd, aangezien alle dieren GFP tot expressie brachten.
Om de verandering in histon H3K9me3-verrijking te bepalen die overeenkomt met RNAi-geïnduceerde uitschakeling, werd ChIP-qPCR uitgevoerd op dieren van de F1-generatie na behandeling met GFP-RNAi of controle-RNAi. Zoals verwacht vertoonde de met GFP RNAi behandelde populatie hogere histon H3K9me3-spiegels op het GFP-doel en in het stroomafwaartse gebied van 1,3 kb in vergelijking met met RNAi behandelde controledieren (Figuur 2C). De specificiteit van het histon H3K9me3 ChIP wordt ondersteund door de verrijking op een positieve controlelocus (clec-18) waarvan bekend is dat deze verrijkt is in dit merkteken, maar niet op een nabijgelegen negatieve controlelocus (hrp-2). Histon H3-verrijking en near-background verrijking in de IgG-controle-immunoprecipitaties werden ook gedetecteerd op alle qPCR-loci, zoals verwacht. Wanneer ChIP-verrijking bij de verslaggever wordt genormaliseerd naar de clec-18-positieve controlelocus, wordt een hogere histon H3K9me3-verrijking op GFP-RNAi getoond, terwijl histon H3-verrijking vergelijkbaar is tussen de controle- en GFP-RNAi-behandelingen (Figuur 2D). Aangezien GFP-RNAi naar verwachting geen invloed zal hebben op histon H3K9me3 of de totale histon H3-bezetting op de clec-18-locus, vermindert deze normalisatie technische variatie, zoals verschillen in ChIP-efficiëntie tussen de GFP-RNAi- en controle-RNAi-monsters . De vouwverandering van histon H3K9me3 en histon H3 niveaus tussen RNAi-behandelingen toont GFP-reporter-specifieke histon H3K9me3-verrijking, onafhankelijk van histonbezetting, na GFP RNAi-geïnduceerde uitschakeling (Figuur 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Figuur 2: GFP RNAi-geïnduceerde uitschakeling komt overeen met verhoogde H3K9me3-verrijking op het RNAi-doelwit. (A) Diagram van de tot kiembaan tot expressie gebrachte GFP RNAi-reporter mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] met qPCR-ampliconregio's gelabeld. (B) GFP-expressie gescoord over generaties na RNAi-behandelingen bij 21 °C. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van twee biologische replicaten. (C) ChIP-qPCR van H3K9me3, histon H3 en IgG-controle bij F1-jongvolwassenen van twee biologische replicaten. clec-18 en hrp-2 zijn respectievelijk de positieve en negatieve controleloci voor H3K9me3-verrijking. (D) H3K9me3 en histon H3-verrijking bij de GFP RNAi-reporter genormaliseerd naar de clec-18 positieve controlelocus. (E) Verandering in H3K9me3- en histon-H3-verrijking tussen GFP-RNAi- en controle-RNAi-behandelde dieren, met normalisatie naar clec-18. De stippellijn staat voor een vouwverandering van 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Onderzoek in ons lab onderzoekt hoe chromatine-geassocieerde eiwitten, histonmodificaties en kleine RNA-pathway-factoren samenwerken in de context van ontwikkeling en transgenerationele epigenetische overerving. De RNA-overervingstest, met behulp van een GFP-reporter, is een zeer krachtig hulpmiddel geworden. Dit protocol beschrijft hoe de bereiding, het scoren en het passeren van wormen en de bereiding van ChIP-monsters kunnen worden gestandaardiseerd, wat kan helpen om reproduceerbare resultaten te genereren.Een van de experimentele uitdagingen bij het bestuderen van transgenen die tot kiembaan tot expressie komen, is het isoleren van de effecten in de kiembaan van het dier. We gebruiken momenteel hele dieren voor ChIP, maar in de toekomst willen we tests ontwikkelen om chromatine te onderzoeken, met name in de kiembaan. Ons laboratorium is geïnteresseerd in histonmethylering en eiwitten die deze kenmerken herkennen.In de toekomst willen we de wisselwerking tussen deze chromatinelezers en kleine RNA-routes onderzoeken in de context van RNAi-overerving bij transgenen en de regulatie van endogene sequenties.

analysis-transgenerational-epigenetic-inheritance-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Dit artikel beschrijft een techniek voor de visualisatie van de vroege gebeurtenissen van embryogenese in de...

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer een gestandaardiseerde RNAi-overervingsassay met ChIP in C. elegans om transgenerationele epigenetische mechanismen te onderzoeken. Deze methode helpt onderzoekers chromatine-modificaties en kleine RNA-routes te analyseren.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) (Video) | JoVE Journal

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Meer video's verkennen