Name: Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Ontdek een driedimensionale elektronenmicroscopietechniek voor het visualiseren van mitochondriale ultrastructuur in pancreaskankercellen. Deze methode verbetert beeldkwaliteit en analyseflexibiliteit zonder dure apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China subsidies (82274364, 81673607 en 81774011); evenals het Public Welfare Research Project van Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). We waarderen de geweldige hulp, technische ondersteuning en experimentele ondersteuning van het Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.

1. Materiaalvoorbereiding
<ol><li>Kweek 2 x 106 Panc02-cellen in 12 ml DMEM-medium (10% foetaal runderserum en 100 U / ml penicilline-streptomycine) en houd gedurende 48 uur op 37 °C en 95% vochtigheid in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 95% lucht.</li>
	<li>Verzamel Panc02-cellen, centrifugeer gedurende 2 minuten op 28 x g en gooi het supernatant vervolgens weg. Zorg ervoor dat het monster de juiste grootte heeft (1 x 107 cellen), omdat anders de volgende fixatie- en uitdrogingsstappen niet goed werken.</li>
	<li>Voeg 1 ml 2,5% glutaaraldehyde toe als fixeermiddel om de verse Panc02-cellen in de 1,5 ml microcentrifugebuizen 's nachts bij 4 °C te fixeren. OPMERKING: De monsters moeten gedurende 5 minuten bij 1.006 x g worden gecentrifugeerd in elk van de volgende stappen (stappen 1.3-1.11).</li>
	<li>Zuig het fixeermiddel op en spoel de monsters tweemaal met 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en spoel vervolgens tweemaal met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk.</li>
	<li>Voeg 50 μL van een oplossing toe die 1% osmiumtetroxide (OsO 4) en 1,5% kaliumferrocyanide bevat in een verhouding van 1:1 bij4 °C gedurende 1 uur. Spoel vervolgens twee keer met 0,1 M PBS gedurende 10 minuten elke keer en spoel met ddH2O gedurende nog eens 10 minuten.</li>
	<li>Voeg 1 ml 1% thiocarbohydrazide (TCH) toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot 1 uur en spoel vervolgens vier keer gedurende 10 minuten af met ddH2O.</li>
	<li>Voeg 50 μL 1% OsO4 toe, fixeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel vervolgens vier keer gedurende 10 minuten met ddH2O.</li>
	<li>Voeg 's nachts 1 ml 2% uranylacetaat bij 4 °C toe en spoel vervolgens vier keer gedurende 10 minuten af met ddH2O.</li>
	<li>Voeg 1 ml Walton-oplossing (0,066 g loodnitraat opgelost in 10 ml 0,03 mol/l asparaginezuur-stockoplossing) toe bij 60 °C voor nog eens 1 uur incubatie.</li>
	<li>Spoel met ddH2O vier keer gedurende 10 minuten elke keer, en droog vervolgens uit in een gegradeerde alcoholreeks gedurende 10 minuten elke keer: 50% alcohol, 70% alcohol, 80% alcohol en 90% alcohol 1x, en 100% alcohol 2x. Droog vervolgens twee keer uit in 100% aceton gedurende 10 minuten elke keer. Gebruik 1 ml van elke oplossing voor de uitdroging.</li>
	<li>Meng 200 μL aceton met Pon 812 epoxyhars in een verhouding van 3:1, 1:1 en 1:3. Week het monster in hars bij kamertemperatuur gedurende respectievelijk 2 uur, 4 uur en 4 uur en neem vervolgens de 100% Pon 812 epoxyhars om 's nachts te impregneren. OPMERKING: Bij het uitvoeren van de kleurings- en harsinbeddingsstappen is het belangrijk om in een zuurkast te werken, omdat dit giftige stoffen zijn. Bovendien moeten laboratoriumjassen en oplosmiddelbestendige handschoenen worden gedragen tijdens het experiment.</li>
	<li>Plaats de monsters in een insluitvorm en plaats ze vervolgens gedurende 48 uur in een oven bij 60 °C om te polymeriseren. Gebruik een vlakke inbedding29 om het uiterlijk van hars rond het monster te verminderen. Dit vereenvoudigt de monsterinstallatie en vermindert de impact van het opladen van artefacten op de daaropvolgende beeldsegmentatie. OPMERKING: Om vervolgens een horizontaal snijoppervlak te genereren, kan een kleine hoeveelheid hars in het malgat worden toegevoegd, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat het niet te vol raakt.</li>
	<li>Bereid siliciumwafers door ze eerst te wassen en vervolgens gedurende 30 minuten te hydrofieliseren met een geconcentreerde H 2 SO4/H 2 O2-oplossing. Verzamel serieel gesneden reepjes met een dikte van 70 nm op de gehydrofileerde siliciumwafers met behulp van een ultramicrotoom en droog ze gedurende 10 minuten in een oven van 60 °C. OPMERKING: Leg het plakje langzaam vast terwijl het plakje naar het oppervlak van de wafers drijft om verlies of vervorming van de plak te voorkomen.</li>
</ol>2. Beeldacquisitie en driedimensionale reconstructie
<ol><li>Voordat u een siliconen wafer op het podium monteert, wast u de secties drie keer met gedestilleerd water en droogt u ze aan de lucht. Knip een geleidende koolstoftape met de grootte van 1 cm x 0,5 cm en plak deze tussen de siliciumwafer en de SEM-monsterfase om de monsteropstelling te voltooien (figuur 2E).</li>
	<li>Stel de FE-SEM-versnellingsspanningsparameter in op 2 kV met een werkafstand van 4 mm (figuur 3B en tabel 1). OPMERKING: Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en de ruis in het beeld te verminderen, moet u waar mogelijk bij lage vergrotingen observeren. Naarmate het veelvoud toeneemt, neemt het scanbereik van de SEM af, wat leidt tot een toename van de ladingaccumulatie op de afbeeldingen.</li>
	<li>Klik op het H/L-pictogram in de bovenste menubalk. Oriënteer eerst bij lage vergroting het eerste gedeelte van de doelsegmentstroken en klik vervolgens nogmaals op de H / L-optie (afbeelding 3A) om over te schakelen naar de modus met hoge vergroting; Verzamel een geschikte afbeelding voor de structuur van belang door de helderheid, het contrast en de vergroting van de afbeelding aan te passen.</li>
	<li>Selecteer Projectweergave > Open Data en importeer de te analyseren afbeeldingsbestanden in de software.</li>
	<li>Lijn de afbeeldingen uit door te klikken op Segmenten uitlijnen > bewerken (afbeelding 4B) en pas de waarde van het intensiteitsbereik in de menubalk linksonder aan door de afbeeldingstransparantie te wijzigen. Gebruik hier een semi-automatische uitlijningsstrategie; Met name door middel van automatische uitlijning kunt u de foto's laten overlappen met een vorige afbeelding en vervolgens handmatige fijnafstelling uitvoeren. OPMERKING: In dit werk werd tijdens het uitlijningsproces de vorige afbeelding als referentie gebruikt en werden de verplaatsings- en roteerbewerkingen gebruikt om de doelstructuur van de twee afbeeldingen maximaal te overlappen. Als u op Huidig segmentpaar uitlijnen klikt, kunt u de afbeeldingen automatisch uitlijnen, maar er kunnen misplaatsingen optreden.</li>
	<li>Selecteer de module Subvolume extraheren en knip de uitgelijnde gegevenssets zodat ze passen bij de grootte van het overlappende gedeelte van de hele stapel.</li>
	<li>Selecteer onder de subsectie Segmentatie (afbeelding 4C) de optie Resample > Segmentation > Save. Kies de drempel van de toverstaf en de grootte van het penseel om het juiste bereik te selecteren. Gebruik ook hier een semi-automatische segmentatiemethode door eerst de Toverstaf te gebruiken om automatisch een geschikt groot gebied te selecteren en vervolgens het penseel te gebruiken om de details nauwkeurig te beschrijven. OPMERKING: De toverstaf kan worden toegepast op segmentafbeeldingen op basis van de duidelijke verschillen in de pixelintensiteit tussen de structuur van belang en de omliggende structuren door de maskeringswaarde te wijzigen en de tekenlimietlijn te gebruiken. Het is niet in staat om de oplaadartefacten te onderscheiden die tijdens de beeldacquisitie worden gegenereerd. Daarom kan dit leiden tot onjuiste segmentatie voor de doelregio's. Het penseel kan worden gebruikt om handmatig te segmenteren om de biologische structuren nauwkeurig te reconstrueren.</li>
	<li>Klik onder Segmentatie > selectie op het pictogram + om het geselecteerde gebied toe te voegen (Afbeelding 4C).</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande stap (2.8) om dezelfde doelstructuur in verschillende afbeeldingen te selecteren totdat de selectie is voltooid voor het reconstrueren van de microstructuren van belang. OPMERKING: Tijdens de mitochondriale remodelleringsprocessen moet de selectie van het doelobject worden uitgevoerd uit de afbeelding in het midden van een groep opeenvolgende afbeeldingen. Als het gewenste gebied is geselecteerd uit de eerste of laatste afbeelding, kan het reconstructieresultaat geen volledige 3D-visualisatie weergeven.</li>
	<li>Nadat u de regionale segmentatie hebt voltooid, genereert u het afbeeldingsbestand volgens de beste resultaten voor de grootte van het object en de afbeeldingsresolutie. Klik op Crop Editor en voer vervolgens het nummer 6 in het vak Virtual Slider (Figuur 4C) in.</li>
	<li>Klik in het vervolgkeuzemenu aan de linkerkant met de rechtermuisknop op het grijze gebied onder de subsectie Project en selecteer Oppervlak genereren > Maken > Toepassen. Gebruik in het gegenereerde bestand de Surface View-module om de oppervlaktestructuur en 3D-weergave te maken.</li>
</ol>3. Kwantificering
<ol><li>Klik op Kleine vlekjes verwijderen > aanbrengen (Figuur 4D). Klik onder de subsectie Project met de rechtermuisknop op het grijze gebied en selecteer Labelanalyse > Toepassen (Afbeelding 4D).</li>
	<li>Pas de naam van de kolom aan en kies een metingsgroep. Selecteer Volume3d en Length3d in het vak Native Measurements. </li>
	<li>Klik op de knop Toepassen in de linkerbenedenhoek van het scherm. Kopieer de gegevens en grafiek in de statistische software, zoals GraphPad.</li>
</ol>

3D-techniek om mitochondriale cristae in alvleesklierkankercellen te visualiseren

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

De hier gepresenteerde methode is een nuttige stapsgewijze handleiding voor het toepassen van de 3D-reconstructietechniek, waarbij elektronenmicroscopie en beeldverwerkingstechnologie worden toegepast op het stapelen en segmenteren van 2D-tomografische beelden die zijn gegenereerd uit seriële ultradunne secties. Dit protocol benadrukt een beperking van 2D-beelden die kunnen worden aangepakt door 3D-visualisatie van de organel-ultrastructuur, wat de voordelen heeft van een sterke reproduceerbaarheid van de structuren op e...

Mitochondriën zijn een van de belangrijkste organellen in de cel. Ze dienen als de centrale hub van cellulaire bio-energetica en metabolisme 1,2 en spelen een cruciale rol bij kanker3. Alvleesklierkanker (PC) is een van de moeilijkste kankers4 om te behandelen vanwege de snelle verspreiding en het hoge sterftecijfer. Mitochondriale disfunctie, die voornamelijk wordt veroorzaakt door veranderingen in de mitochondriale morfologie 3,5,6,7, is in verband gebracht met de ziektemechanismen die ten grondslag liggen aan PC8. Mitochondriën zijn ook zeer dynamisch, wat wordt weerspiegeld door de frequente en dynamische veranderingen in hun netwerkconnectiviteit en cristae-structuur9. De hervorm van de cristae-structuur kan rechtstreeks van invloed zijn op de mitochondriale functie en cellulaire toestand 10,11, die aanzienlijk worden veranderd tijdens tumorcelgroei, metastase en tumormicro-omgevingsveranderingen 12,13.
In de afgelopen jaren hebben wetenschappers dit organel bestudeerd met behulp van EM-observatie14,15,16,17; onderzoekers hebben bijvoorbeeld de mitochondriale dynamiek geanalyseerd met behulp van 3D-reconstructietechnieken 6,7,18,19. Het algemene concept en de methode voor de 3D-reconstructie van elektronenmicroscopiebeelden werden al in 1968 formeel vastgesteld20 en omvatten het combineren van elektronenmicroscopie, elektronendiffractie en computerbeeldverwerking om de T4-faagstaart te reconstrueren. Tot nu toe heeft de 3D-beeldvormingstechnologie voor elektronenmicroscopie aanzienlijke vooruitgang geboekt in termen van beeldresolutie 21, mate van automatisering 22 en verwerkingsvolume23 en is het op steeds grotere schaal gebruikt in biologisch onderzoek, van weefselniveau tot organel ultrastructuurniveau op nanometerschaal24. In de afgelopen jaren is elektronenmicroscopie 3D-beeldvorming ook een veelbelovende technologie geworden voor een breed scala aan toepassingen25,26,27.
De groeiende aandacht voor mitochondriale cristae illustreert vooral de essentiële vereisten voor ultrastructurele volumebeeldvorming. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is gebruikt om monsters te visualiseren die zijn verzameld op een koperen rooster (400 mesh)28, waarbij de elektronenbundel door de sectie gaat. Vanwege het beperkte bereik van het koperen rooster is het echter onmogelijk om continue segmenten van hetzelfde monster volledig in beeld te brengen29. Dit bemoeilijkt de studie van doelstructuren tijdens TEM-beeldvorming. Bovendien vertrouwt TEM op tijdrovende en foutgevoelige handmatige taken, waaronder het snijden en verzamelen van meerdere plakjes en deze sequentieel in beeld brengen21, zodat het niet is aangepast voor ultrastructurele reconstructies van monsters met een groot volume23. Op dit moment wordt de reconstructie met hoge resolutie van grootvolume-beeldvorming bereikt door het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, zoals de TEM-camera-array (TEMCA)30 of twee TEMCA-systemen van de tweede generatie (TEMCA2)31, die geautomatiseerde high-throughput imaging in korte tijd mogelijk maken. Dit type beeldvorming heeft echter niet het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en universeel is vanwege de vereiste voor aangepaste apparatuur.
In vergelijking met TEM verbetert de methode voor het automatisch genereren van duizenden seriële volumetrische beelden voor grote gebieden op basis van SEM 32,33 de efficiëntie en betrouwbaarheid van seriële beeldvorming en levert hogere z-resoluties34. Bijvoorbeeld, seriële block-face scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) en gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) hebben het beide mogelijk gemaakt om de 3D-reconstructie van ultrastructuur te bereiken met hoge snelheid, efficiëntie en resolutie35,36. Het is echter onvermijdelijk dat het blokoppervlak mechanisch wordt afgeschoren door het diamantmes van de SBF-SEM of door te frezen met de gefocusseerde ionenbundel van FIB-SEM33,37. Vanwege de destructiviteit van de twee methoden voor de monsters, is het niet mogelijk om dezelfde doelstructuur opnieuw te reconstrueren voor verdere analyse38,39,40. Bovendien hebben weinig studies geprobeerd om de 3D-organel-ultrastructuur van kankercellen te reconstrueren met behulp van EM om pathologische veranderingen te observeren12. Om deze redenen, om de pathologische mechanismen van kankercellen, zoals alvleesklierkankercellen, verder op te helderen, stellen we een nieuwe technologie voor voor de 3D-reconstructie van seriële sectiebeelden met behulp van een ultramicrotoom en een veldemissiescanning elektronenmicroscoop (FE-SEM) om de mitochondriale ultrastructuur op cristae-niveau te analyseren; Met deze technologie kunnen gegevens met een hoge resolutie worden verkregen met behulp van een efficiënte en toegankelijke methode. De seriële ultradunne secties gemaakt met behulp van een ultramicrotoom kunnen semi-permanent worden opgeslagen in een rasterbehuizing en meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, zelfs na enkele jaren41. FE-SEM wordt zeer gewaardeerd als een hulpmiddel in verschillende onderzoeksgebieden vanwege het vermogen om beeldvorming met hoge resolutie, hoge vergroting en veelzijdigheid te bieden42. In een poging om de fijne structuur van organellen in 3D weer te geven, kan de techniek voor het produceren van seriële 2D-beeldstapels met nuttige resolutie met behulp van terugverstrooide elektronen geproduceerd door FE-SEM 43,44 ook worden gebruikt om hoge doorvoer en multi-scale beeldvorming van doelgebieden of hun bijbehorende structuren te bereiken zonder speciale apparatuur 45. Het genereren van ladingartefacten heeft direct invloed op de kwaliteit van de verkregen afbeeldingen, dus het is vooral belangrijk om de verblijftijd kort te houden.
De huidige studie gaat dus dieper in op de experimentele procedures die in deze SEM-techniek worden gebruikt om de 3D-structuur van mitochondriale cristae46 te reconstrueren. In het bijzonder tonen we het proces dat is ontwikkeld om de semi-automatische segmentatie van mitochondriale regio's te bereiken en de 3D-reconstructie te digitaliseren met behulp van Amira-software, waarbij ook slice-monsters worden gemaakt met behulp van de conventionele OTO-monstervoorbereidingsmethode44,47, de sectieverzameling wordt voltooid met behulp van ultramicrotoomsegmentering en sequentiële 2D-gegevens worden verkregen door FE-SEM.

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>Asparaginezuur</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's aangepast Eagles medium</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Veld emissie rasterelektronenmicroscoop</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>Loodnitraat</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-211724</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxide</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>European Collection of Authenticated Cell Cultures</td><td>98102213</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 epoxyhars</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanide</td><td>Macklin</td><td>P816416</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Merck</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotoom</td><td>LEICA</td><td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td>Uraanylacetaat</td><td>RHAWN</td><td>R032929</td><td></td></tr></tbody></table>

een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Het begrijpen van de dynamische kenmerken van de ultrastructuur van het celorganel, die niet alleen rijk is aan onbekende informatie, maar ook geavanceerd vanuit een driedimensionaal (3D) perspectief, is van cruciaal belang voor mechanistische studies. Elektronenmicroscopie (EM) biedt een goede beelddiepte en maakt de reconstructie van beeldstapels met hoge resolutie mogelijk om de ultrastructurele morfologie van cellulaire organellen te onderzoeken, zelfs op nanometerschaal; daarom wint 3D-reconstructie aan belang vanwege de onvergelijkbare voordelen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) biedt een high-throughput beeldacquisitietechnologie die het mogelijk maakt om grote structuren in 3D te reconstrueren vanuit hetzelfde interessegebied in opeenvolgende segmenten. Daarom wordt de toepassing van SEM in grootschalige 3D-reconstructie om de echte 3D-ultrastructuur van organellen te herstellen steeds gebruikelijker. In dit protocol stellen we een combinatie van seriële ultradunne sectie en 3D-reconstructietechnieken voor om mitochondriale cristae in pancreaskankercellen te bestuderen. De details van hoe deze technieken worden uitgevoerd, worden in dit protocol stapsgewijs beschreven, inclusief de osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) -methode, de seriële ultradunne sectiebeeldvorming en de visualisatieweergave.

Tijdens de celkweek (figuur 1A) verdeelden we de alvleesklierkankercellen eerst in een controlegroep gekweekt met volledig kweekmedium, een (1S,3R)-RSL348 (RSL3, een ferroptose-activator, 100 nM) groep, en een RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, een ferroptoseremmer, 100 nM) groep. Door de bovenstaande experimentele stappen verkreeg de scanning elektronenmicroscoop 38 (aanvullende figuur 1), 43 (aanvullende figuur 2) en 44 (aanv...

Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.

Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Dit project heeft tot doel het antikankereffect van geneesmiddelen te beoordelen door de structuur op subcellulair nanoschaalniveau te veranderen en het verband te leggen tussen organelmorfologie en het pathologische mechanisme van kanker. Deze technologie combineert traditionele elektronenmicroscopietechnologie met driedimensionale reconstructietechnologie zonder speciale apparatuur. In vergelijking met andere technieken kan het de beeldvormingsefficiëntie en de reconstructieflexibiliteit verbeteren, en de real-life reconstructie van doelstructuren op elk moment.Het is dus zeer eenvoudig en universeel. Deze technologie van driedimensionale reconstructie van de continue ultradunne dia's kan herhaaldelijk de echte stereochemische stof herstellen zonder specifieke dure apparatuur. Het kan worden gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van alle organellen op elk moment.Het realiseert de eenvoudige werking van observatie.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Nieuwe computer-ondersteunde methoden van grootschalige inkoop en de analyse van immunohistochemisch gekleurde alvleesklier exemplaren zijn beschreven: (1) Virtual Snijd verovering van de hele afdeling, (2) massa-analyse van grootschalige data, (3) Reconstructie van 2D Virtual Slices , (4) 3D eilandje in kaart brengen, en (5) Wiskundige analyse.

Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

Source: Hamid, H. S., et al. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates the method for visualizing nerve-specific mitochondria using three-dimensional imaging. It outlines the process of acquiring sequential scans of pre-labeled intraepidermal nerve fibers and generating 3D surface images to isolate and display mitochondria in relation to nerve structures.

Visualization of Mitochondria within Intraepidermal Nerve Fibers

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Hier, wordt een methode beschreven voor de bereiding van 3-dimensionale (3D) sferoïde co cultuur van pancreatic kankercellen en fibroblasten, gevolgd door meting van metabolische functies met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Voorbereiding en metabole kwantitatieve analyse van 3-dimensionale sferoïde co culturen van Pancreatic kankercellen en fibroblasten

In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.

Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Hier beschrijven we de mitochondriale gebeurtenislokalisator (MEL), een ImageJ-plug-in die nuttig is bij het kwantificeren van de 3-dimensionale veranderingen in mitochondriale splijting en fusieactiviteit in de loop van de tijd. We beschrijven ook een beeldverwerkingspijplijn die nuttig is voor het opschonen van microfoto's voorafgaand aan analyse in ImageJ.

Inzicht in de veranderingen in mitochondriale morfologie door middel van dynamische en driedimensionale fluorescentiemicrofoto's

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

Ontdek een driedimensionale elektronenmicroscopietechniek voor het visualiseren van mitochondriale ultrastructuur in pancreaskankercellen. Deze methode verbetert beeldkwaliteit en analyseflexibiliteit zonder dure apparatuur.

Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

Meer video's verkennen