Name: Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Leer de bereiding van porfyrine-gemodificeerde polystyreen kralen als compensatiecontroles voor flowcytometrie. Deze methode biedt stabiele fluorescentie vergelijkbaar met TCPP-gekleurde cellen voor betrouwbare multikleuranalyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen David Rodriguez bedanken voor zijn hulp bij de figuurvoorbereiding en Precision Pathology Services (San Antonio, TX) voor het gebruik van zijn Navios EX-flowcytometer.

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
1. Bereiding van de TCPP-stamoplossing, 1,0 mg/ml
OPMERKING: Dit kan maandelijks worden voorbereid.
<ol><li>Weeg met behulp van een analytische balans, spatel en weegpapier 49,0-50,9 mg TCPP. Rond het gewicht af op 1/10 van een milligram. Zet de gemeten hoeveelheid TCPP opzij beschermd tegen licht. OPMERKING: Gebruik een statisch pistool als de gewichtsmeting onstabiel is.</li>
	<li>Bepaal de vereiste hoeveelheden gezuiverd water en isopropanol (IPA) uit tabel 1 op basis van de hoeveelheid TCPP gewogen in stap 1.1. Voeg het gezuiverde water en isopropanol toe aan een glazen bekerglas van 100 ml en dek af met parafilm om te beschermen tegen verdamping.</li>
	<li>Bepaal de vereiste hoeveelheid natriumbicarbonaat uit tabel 1 op basis van de hoeveelheid TCPP die in stap 1.1 is gewogen.</li>
	<li>Weeg met behulp van de analytische balans, spatel en weegpapier de vereiste hoeveelheid natriumbicarbonaat af, bepaald in stap 1.3. Rond het gewicht af op 1/10 van een milligram. OPMERKING: Gebruik een statisch pistool als de gewichtsmeting onstabiel is.</li>
	<li>Voeg het natriumbicarbonaat toe aan het bekerglas van 100 ml met gezuiverd water en isopropanol. Bedek de oplossing met parafilm ter bescherming tegen verdamping.</li>
	<li>Leg de oplossing uit stap 1.5 op een roerplaat en roer tot het is opgelost (ca. 10 min)</li>
	<li>Meet de pH om er zeker van te zijn dat de natriumbicarbonaathoudende oplossing uit stap 1.6 een pH tussen 9 en 10 heeft.</li>
	<li>Voeg langzaam de TCPP gewogen in stap 1.1 toe aan de oplossing uit stap 1.7 en blijf roeren tot het is opgelost (~30 min). Bescherm tegen licht tijdens deze stap.</li>
	<li>Bewaren in een glazen of polypropyleen container bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.</li>
</ol>2. Bereiding van 2-(N -morfolino)-ethaansulfonzuur (MES) en hemisodiumzoutbufferoplossing, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("MES-buffer")
OPMERKING: Dit moet op de dag van gebruik worden bereid en op kamertemperatuur worden bewaard.
<ol><li>Weeg 2,50 g MES hemisodiumzout af en voeg dit toe aan een plastic fles van 150 ml.</li>
	<li>Voeg 121 ml gezuiverd water toe en los op door handmatig schudden totdat er geen vaste stof zichtbaar is.</li>
	<li>Meet de pH van de MES-buffer om er zeker van te zijn dat deze tussen 6 en 6,2 ligt.</li>
	<li>Handhaven op kamertemperatuur voor gebruik op dezelfde dag.</li>
</ol>3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) poeder
<ol><li>Haal het EDC-poeder uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur staan tot gebruik in stap 5.</li>
</ol>4. Amine-gefunctionaliseerde polystyreenkralen combineren met TCPP-oplossing
<ol><li>Voeg 4,3 ml van de 0,1 M MES-bufferoplossing bereid in stap 2 toe aan een polypropyleenbuis van 15 ml.</li>
	<li>Vortex de amine-gefunctionaliseerde polystyreen kraal suspensie (10 μm, 2,5% w / v) voor 60 s op maximale snelheid.</li>
	<li>Voeg 288 μL van deze vers gevortexeerde kraalsuspensie toe aan de MES-buffer uit stap 4.1.</li>
	<li>Vortex de MES/kraaloplossing voor 15 s op maximale snelheid.</li>
	<li>Vortex de 1 mg/ml TCPP-oplossing bereid in stap 1 gedurende 60 s op maximale snelheid.</li>
	<li>Voeg 1,20 ml van deze vers gevortexeerde TCPP-stamoplossing toe aan de MES/kraalsuspensie uit stap 4.4.</li>
	<li>Vortex de MES/kraal/TCPP ophanging gedurende 15 s op maximale snelheid.</li>
	<li>Bedek de buis met folie terwijl de EDC-oplossing wordt bereid.</li>
</ol>5. Bereiding van N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl) stamoplossing
OPMERKING: De EDC-oplossing is bederfelijk en moet onmiddellijk na bereiding worden gebruikt.
<ol><li>Voeg 20,0 ml gezuiverd water toe aan een nieuwe conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Weeg 200 mg EDC HCl uit stap 3 af en voeg dit toe aan het water (stap 5.1).</li>
	<li>Draai de EDC HCL gedurende 15 s op maximale snelheid om een duidelijke oplossing te genereren.</li>
</ol>6. Bereiding van de EDC HCl/MES werkoplossing
OPMERKING: De EDC HCl/MES-oplossing is bederfelijk en moet onmiddellijk na bereiding worden gebruikt.
<ol><li>Voeg 54,0 ml MES-bufferoplossing (bereid in stap 2) toe aan een plastic fles van 150 ml.</li>
	<li>Voeg 6,0 ml van de EDC HCl-stamoplossing (bereid in stap 5) toe aan de MES-bufferoplossing en meng door 10 s te schudden.</li>
</ol>7. De kralen labelen met TCPP
<ol><li>Voeg 4,5 ml EDC-werkoplossing (vanaf stap 6) toe aan de polypropyleenbuis van 15 ml met de kralen en TCPP in MES-buffer (stap 4.7).</li>
	<li>Plaats de buis in een omgekeerde rotator bij 35 rpm gedurende 16 uur bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 1.000 × g.</li>
	<li>Zuig het supernatant op en resuspensie de kralen in 0,8 ml van Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).</li>
	<li>Breng de kraaloplossing over in een amberkleurige injectieflacon met polypropyleen met een pipet van 1 ml en bewaar bij 4 °C tot verder gebruik. OPMERKING: De kralen zijn op dit moment minstens 3 maanden stabiel.</li>
</ol>8. Kwaliteitscontrole (QC) van de TCPP-kralen door flowcytometrie
OPMERKING: De QC moet worden gecentreerd op de vraag of de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van de TCPP-kralen voldoende helder is voor het beoogde gebruik en de hoeveelheid deeltjes die door de procedure wordt gegenereerd. Zie de sectie representatieve resultaten voor meer informatie.
<ol><li>Label een polystyreenbuis van 5 ml als 'TCPP-negatieve kralen'. OPMERKING: De negatieve kralen verschillen van de amine-gefunctionaliseerde kralen die worden gebruikt voor etikettering. Zie de tabel met materialen.</li>
	<li>Label een andere buis als 'TCPP-positieve kralen'.</li>
	<li>Label een andere buis als 'Regenboogkralen'.</li>
	<li>Aliquot 300 μL ijskoude HBSS in de buizen gelabeld met "TCPP negatieve kralen" en "TCPP positieve kralen."</li>
	<li>Voeg 500 μL ijskoud HBSS toe aan de buis met het label 'Regenboogkralen'.</li>
	<li>Vortex de niet-gefunctionaliseerde polystyreen (ongelabelde) kraalsuspensie kort op maximale snelheid (2-3 s), en voeg 10 μL ervan toe aan de buis met het label "TCPP negatieve kralen."</li>
	<li>Vortex de TCPP-gelabelde kraalsuspensie (afgerond in stap 7.5) kort op maximale snelheid en voeg 3 μL ervan toe aan de "TCPP positive beads" -buis.</li>
	<li>Vortex de Rainbow bead suspension kort op maximale snelheid, en voeg twee druppels van het in de "Rainbow beads" buis.</li>
	<li>Houd alle buizen op ijs, afgedekt en beschermd tegen licht.</li>
	<li>Start de juiste dagelijkse opstartprocedures van de flowcytometer en voer een QC uit om de optimale vloeistoffen en laseruitlijning te verifiëren. OPMERKING: Voor dit deel van het protocol wordt aangenomen dat de operator is getraind in het gebruik van de beschikbare flowcytometer, inclusief de procedures voor het standaardiseren van de lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit, evenals de basisprincipes voor het berekenen van de juiste compensatiematrix.</li>
	<li>Voer de Rainbow-kralen en de TCPP-kralen uit zonder de spanningsinstellingen tussen de verschillende runs te wijzigen.<ol><li>Ren en verzamel 10.000 evenementen van de Regenboogkralen.</li>
		<li>Voer een spoeling uit met water en verzamel 10.000 gebeurtenissen van de TCPP-negatieve kralen.</li>
		<li>Voer een spoeling uit met water en verzamel 10.000 gebeurtenissen van de TCPP-positieve kralen.</li>
		<li>Voer een waterspoeling van 1 minuut uit. OPMERKING: Het is belangrijk om een spoeling met water uit te voeren na het uitvoeren van de TCPP-kralen. Als de TCPP niet uit de lijnen in de cytometer wordt gespoeld, bestaat de mogelijkheid dat resterende TCPP cellen in de volgende te verkrijgen buis kan labelen.</li>
		<li>Voer de juiste reinigings- en afsluitprotocollen uit die specifiek zijn voor de instructies van de fabrikant voor de cytometer. OPMERKING: Voor representatieve resultaten, zie figuur 1.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Kraal filtratie
OPMERKING: Als de QC van de kralen door flowcytometrie (stap 8) een hoog aandeel deeltjes (70% of hoger) vertoont, overweeg dan om de kraalsuspensie te filteren met behulp van het onderstaande protocol (figuur 2).
<ol><li>Voeg 3,20 ml ijskoude HBSS toe aan 0,8 ml van de TCPP-kraalsuspensie die in stap 7.5 is voltooid (waardoor een vijfvoudige verdunning ontstaat).</li>
	<li>Vortex de verdunde kraal suspensie op maximale snelheid gedurende 15 s.</li>
	<li>Verwijder de zuiger uit een wegwerpspuit van 5 ml.</li>
	<li>Breng de spuit aan met een glasvezelpuntfilter (5 μm, 13 mm diameter).</li>
	<li>Voeg 4 ml HBSS toe aan de spuit.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml van de vortexed verdunde kraalsuspensie toe (stap 9.2).</li>
	<li>Gebruik de zuiger om de suspensie met ongeveer 2 druppels/s door de spuit/filteropstelling te filteren.</li>
	<li>Was de kralen door 5 ml vers HBSS door het filter in de spuit te trekken met ongeveer 2 druppels/s.</li>
	<li>Duw de HBSS er weer uit in de afvalcontainer met ongeveer 2 druppels/s.</li>
	<li>Om de kralen uit het filter te verwijderen, zuigt u nog eens 5 ml vers HBSS door het filter in de spuit.</li>
	<li>Verwijder het filter voorzichtig uit de spuit.</li>
	<li>Werp de kraalsuspensie uit de spuit in een conische centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Plaats het filter terug op de spuit en herhaal stap 9.10-9.12 nog vier keer. Gooi vervolgens het filter en de spuit weg.</li>
	<li>Herhaal stap 9.2-9.13 totdat alle kralen uit stap 9.1 zijn gefilterd. Gebruik een verse spuit en filter elke keer.</li>
	<li>Centrifugeer de gefilterde kralensuspensies gedurende 10 minuten bij 1.000 × g bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zuig het supernatant van elke buis van 50 ml op en resuspensie de kralen voorzichtig en combineer ze in 0,5 ml vers HBSS.</li>
	<li>Breng de kralen met een p1.000 micropipette over in een nieuwe amberkleurige, glazen of polypropyleen injectieflacon en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Herhaal stap 8 om te bepalen of het aandeel TCPP-gerelateerde deeltjes in de gefilterde kraalsuspensie is afgenomen. Voor representatieve resultaten, zie figuur 3.</li>
</ol>

Porfyrine-gemodificeerde korrels in flowcytometrie

<ol><li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+diagnostic+and+therapeutic+roles+of+porphyrins+and+phthalocyanines+in+photodynamic+therapy%2C+imaging+and+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics.</a> Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).</li>
<li>Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+as+diagnostic+and+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent.</a> Molecules. 24 (14), 2669(2019).</li>
<li>Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+the+treatment+and+diagnosis+of+cancer-A+review+of+the+current+clinical+status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 686303(2021).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin-related+photosensitizers+for+cancer+imaging+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications.</a> Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Reiners, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+pharmaceuticals%3A+Mechanisms+and+detection%29%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection).</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).</li>
<li>Didamson, O. C., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+photodynamic+diagnosis+and+therapy+for+esophageal+cancer%3A+Potential+role+of+functionalized+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine.</a> Pharmaceutics. 13 (11), 1943(2021).</li>
<li>Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Aminolevulinic+acid-induced+protoporphyrin+IX+fluorescence+imaging+for+tumor+detection%3A+Recent+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478(2022).</li>
<li>Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+bladder+cancer+diagnosis+-+The+role+of+autofluorescence+and+photodynamic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).</li>
<li>Iwaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+photodynamic+diagnosis+with+5-aminolevulinic+acid+for+the+detection+of+minimal+residual+disease+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma.</a> The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).</li>
<li>Patriquin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+lung+cancer+with+meso+tetra+%284-carboxyphenyl%29+porphyrin-labeled+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+introduction+to+porphyrin+compounds+used+in+tumor+imaging+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).</li>
<li>Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+correlation+between+porphyrin+accumulation+in+cancer+cells+and+functional+positions+for+application+as+a+drug+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier.</a> Scientific Reports. 11 (1), 2046(2021).</li>
<li>Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+for+the+enhancement+of+porphyrin+skeleton-based+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).</li>
<li>Kou, J., Dou, D., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+photosensitizers+in+photodynamic+therapy+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications.</a> Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).</li>
<li>Wezgowiec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-assisted+delivery+of+photofrin+to+human+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).</li>
<li>Palasuberniam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+kinase+inhibitors+enhance+aminolevulinic+acid-mediated+protoporphyrin+IX+fluorescence+and+PDT+response+in+triple+negative+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines.</a> Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002(2021).</li>
<li>Kim, B., Bohandy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopy+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Johns+Hopkins+APL+Technical+Digest%22%5BJournal%5D)">Spectroscopy of porphyrins.</a> Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).</li>
<li>Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excitation+wavelength+dependent+fluorescence+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins.</a> Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry+compensation+standards%3A+internally+stained+fluorescent+microspheres+with+matched+emission+spectra+and+long-term+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability.</a> Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).</li>
<li>Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+spectral+cytometry+toolbox%3A+Coupling+fluorescent+proteins+and+antibodies+to+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres.</a> Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).</li>
<li>Byrd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polystyrene+microspheres+enable+10-color+compensation+for+immunophenotyping+of+primary+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes.</a> Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).</li>
<li>Kabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+accumulation+in+mitochondria+is+mediated+by+2-oxoglutarate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).</li>
<li>Bederka, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+analysis+by+flow+cytometry%3B+An+effective+platform+to+analyze+the+lung+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment.</a> PLoS One. 17 (8), e0272069(2022).</li>
<li>Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2">https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2</a> (2005).</li>
<li>Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152">https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152</a> (1992).</li>
<li>Grayson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-controlled+sputum+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62785(2021).</li>
<li>Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium-based+macromolecules+as+potential+catalysts+in+homogeneous+and+heterogeneous+phases+for+the+utilization+of+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide.</a> ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).</li>
<li>Yadav, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+preparation+and+applications+of+organo-functionalized+porous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials.</a> Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).</li>
<li>Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en">https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en</a> (2023).</li>
<li>Shimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+affinity+beads+for+identifying+drug+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-performance affinity beads for identifying drug receptors.</a> Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).</li>
<li>Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+esters+of+N-hydroxysuccinimide+in+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+coupling+reagents%2C+more+than+a+letter+soup%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization%2C+calibration%2C+and+control+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Standardization, calibration, and control in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).</li>
<li>Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+porphyrin+chemistry+in+tumor+imaging+and+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy.</a> Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).</li>
<li>Beharry, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+photodynamic+therapy%3A+New+probes+for+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment.</a> Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).</li>
<li>El-Far, M., Pimstone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+28+porphyrins+and+their+abilities+to+localize+in+mammary+mouse+carcinoma%3A+Uroporphyrin+I+superior+to+hematoporphyrin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn medewerkers van bioAffinity Technologies.

Ondanks de vele toepassingen van porfyrines bij kankerdiagnose en -therapieën2, is er beperkte literatuur over hun potentiële gebruik als flowcytometrisch reagens voor de identificatie van kankerachtige versus niet-kankerachtige celpopulaties in primaire menselijke weefsels24,25,26. Ons onderzoek naar de flowcytometrische analyse van humaan sputum24,27<...

Porfyrines zijn al vele jaren van belang op biomedisch gebied vanwege hun fluorescentie en tumorgerichte eigenschappen 1,2,3. Therapeutische toepassingen zoals fotodynamische therapie (PDT) en sonodynamische therapie (SDT) omvatten de systemische toediening van een porfyrine aan een kankerpatiënt, de accumulatie van het geneesmiddel in de tumor en de gelokaliseerde blootstelling van de tumor aan een laserlicht van een specifieke golflengte of echografie. De blootstelling aan laserlicht of echografie leidt tot het genereren van reactieve zuurstofsoorten door de porfyrine en de daaropvolgende celdood 4,5. Bij fotodynamische diagnose (PDD) wordt porfyrinefluorescentie gebruikt om kankercellen te onderscheiden van normale cellen6. In deze context wordt protoporfyrine IX, een natuurlijke fluorescerende porfyrine die zich ophoopt in tumoren bij de systemische of lokale injectie van zijn voorloper, 5-aminolevulinezuur (5-ALA), gebruikt om gastro-intestinale stromale tumoren, blaaskanker en hersenkankerte identificeren 7,8. Meer recent werd 5-ALA-behandeling onderzocht als een benadering om minimale restziekte bij multipel myeloom te detecteren9. Ons laboratorium heeft de tetraarylporfyrine TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyfenyl)-21,23 H-porfine) gebruikt vanwege zijn vermogen om longkankercellen en kankergeassocieerde cellen selectief te kleuren in menselijke sputummonsters, wat een eigenschap is die is geëxploiteerd in slide-gebaseerde en flowcytometrische diagnostische testen10.
Sommige porfyrines zijn bifunctioneel in die zin dat ze kunnen worden gebruikt als therapeutische en diagnostische middelen 2,11. In biomedisch onderzoek worden dergelijke bifunctionele porfyrines gebruikt om te evalueren hoe hun vermogen om kankercellen selectief te richten en te doden een functie is van hun structuur en hoe het wordt beïnvloed door de aanwezigheid van andere verbindingen 12,13,14,15,16. Zowel de cellulaire opname van porfyrines als hun cytotoxiciteit kunnen op een flowcytometrisch platform op een high-throughput manier worden gemeten. De absorptie- en emissiespectra van fluorescerende porfyrines zijn complex, maar de meeste flowcytometrische platforms zijn uitgerust om ze correct te identificeren. Het absorptiespectrum van fluorescerende porfyrines wordt gekenmerkt door een sterke absorptieband in het bereik van 380-500 nm, bekend als de Soret-band. Twee tot vier zwakkere absorptiebanden worden over het algemeen waargenomen in het bereik van 500-750 nm (Q-banden)17. Een blauwe 488 nm laser, aanwezig in de meeste flowcytometers, of een violette laser (405 nm) kan licht van de juiste golflengte genereren om porfyrines te prikkelen. De emissiespectra van porfyrines vertonen meestal pieken in het bereik van 600-800 nm18, wat resulteert in zeer weinig spectrale overlap met fluoresceïne-isothiocyanaat of fycoerythrin (PE) fluoroforen, maar aanzienlijke overlap met andere vaak gebruikte fluoroforen, zoals allophycocyanine (APC), evenals tandemfluoroforen, zoals PE-Cy5 en anderen. Daarom zijn bij het gebruik van porfyrines in meerkleurige flowcytometrietests enkelvoudige fluorofoorcontroles essentieel om de spillover van fluorescentie in andere kanalen dan die welke is aangewezen om de fluorescentie van de porfyrine te meten, adequaat te corrigeren.
Idealiter zouden de enkelvoudige fluorofoorcontroles die worden gebruikt om de spillovermatrix voor een panel van fluoroforen te berekenen (ook wel "compensatiecontroles" genoemd) uit hetzelfde celtype of dezelfde celtypen bestaan als het monster. Het gebruik van de steekproef voor dit doel is echter niet optimaal als er om te beginnen zeer weinig steekproef is of als de doelpopulatie binnen de steekproef erg klein is (bijvoorbeeld als men wil kijken naar minimale restziekte of kankercellen in de vroege stadia van de ziekte). Een nuttig alternatief voor cellen zijn kralen gekoppeld aan dezelfde fluorofoor die wordt gebruikt om het monster te analyseren. Veel van dergelijke kralen zijn in de handel verkrijgbaar; Deze kralen zijn ofwel voorgelabeld met de gewenste fluorofoor (voorgelabelde fluorofoor-specifieke kralen)19,20, of er kan een fluorescerend gelabeld antilichaam aan worden bevestigd (antilichaamvangkralen)20,21. Hoewel commerciële compensatieparels beschikbaar zijn voor veel fluoroforen, zijn dergelijke kralen niet beschikbaar voor porfyrines, ondanks hun toenemende gebruik in fundamenteel en klinisch onderzoek.
Naast het behoud van monsters en positieve versus negatieve populaties van de juiste grootte, zijn de andere voordelen van het gebruik van kralen als compensatiecontroles het gemak van voorbereiding, lage achtergrondfluorescentie en uitstekende stabiliteit in de loop van de tijd22. Het potentiële nadeel van het gebruik van kralen als compensatiecontrole is dat het emissiespectrum van het fluorescerende antilichaam dat op kralen wordt gevangen, kan verschillen van dat van hetzelfde antilichaam dat wordt gebruikt om de cellen te labelen. Dit kan van specifiek belang zijn bij het gebruik van een spectrale flowcytometer20. Daarom moet de ontwikkeling van kralen als compensatiecontrole worden uitgevoerd op de flowcytometer die zal worden gebruikt voor de test waarvoor de kralen zijn ontwikkeld. Bovendien moet de ontwikkeling van de kralen een vergelijking omvatten met cellen die zijn gelabeld met hetzelfde fluorescerende kleuringsreagens.
Hier beschrijven we de bereiding van TCPP-amine-gefunctionaliseerde polystyreencompensatieparels, waarvan de mediane fluorescentie-intensiteit in het detectiekanaal vergelijkbaar was met die van TCPP-gelabelde cellen in sputum, en hun gebruik als compensatiecontroles voor flowcytometrie. De autofluorescentie van equivalente, niet-gefunctionaliseerde kralen was voldoende laag voor hun gebruik als negatieve fluorescentiecompensatiecontroles. Bovendien vertoonden deze kralen stabiliteit in opslag gedurende bijna 1 jaar.

<table><tbody><tr><td>Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene</td><td>Research Products International&nbsp;&nbsp;</td><td>ZC1028-500</td><td></td></tr><tr><td>Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 &mu;m diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td><td>Spherotech</td><td>APX-100-10</td><td>Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td></tr><tr><td>Conical tubes, 50 mL, Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>met passende rotor</td></tr><tr><td>Disposable polystyrene bottle met dop, 150 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-140</td><td></td></tr><tr><td>EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), &ge;98%</td><td>Sigma</td><td>03450-1G</td><td>CAS Nr:&nbsp; 25952-53-8</td></tr><tr><td>FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas coverslips, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-BP</td><td></td></tr><tr><td>Glasvezel spuitfilters (Finneran, 5 &micro;m, 13 mm diameter)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1190M60</td><td></td></tr><tr><td>Glas microscoopglazen, 275 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, ACS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423830010</td><td></td></tr><tr><td>Mechanische pipet, 1 kanaal, 100-1000 uL met tips</td><td>Eppendorf</td><td>3123000918</td><td></td></tr><tr><td>MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt</td><td>Sigma</td><td>M0164</td><td>CAS Nr:&nbsp; 117961-21-4</td></tr><tr><td>Navios EX flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX-40 microscoop met DP73 camera en 40X objectief met cellSens software</td><td>Olympus</td><td></td><td>of soortgelijk</td></tr><tr><td>Pasteur pipetten, glas, 5.75"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>pH meter (UB 10 Ultra Basic)</td><td>Denver Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet controller (Drummond)</td><td>Pipete.com</td><td>DP101</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof spuit, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955452</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Particles (niet-functioneel), SPHERO,&nbsp; 2.5% w/v, 8.0-12.9 &micro;m</td><td>Spherotech</td><td>PP-100-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes, 15mL, conisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene tubes, ronde bodem&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9207381</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, wegwerpbaar - 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, wegwerpbaar - 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>CAS Nr:&nbsp; 144-55-8</td></tr><tr><td>TCPP (meso-tetra(4-carboxyfenyl)porfirine)&nbsp; Frontier Scientific&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-393-68</td><td>CAS Nr:&nbsp; 14609-54-2</td></tr><tr><td>Tecan Spark Plate Reader (of soortgelijk)</td><td>Tecan Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube revolver/rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr></tbody></table>

porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Flowcytometrie kan snel diverse celpopulaties karakteriseren en kwantificeren op basis van fluorescentiemetingen. De cellen worden eerst gekleurd met een of meer fluorescerende reagentia, elk gefunctionaliseerd met een ander fluorescerend molecuul (fluorofoor) dat selectief aan cellen bindt op basis van hun fenotypische kenmerken, zoals antigeenexpressie van het celoppervlak. De intensiteit van fluorescentie van elk reagens gebonden aan cellen kan worden gemeten op de flowcytometer met behulp van kanalen die een bepaald golflengtebereik detecteren. Wanneer meerdere fluoroforen worden gebruikt, loopt het licht van individuele fluoroforen vaak over in ongewenste detectiekanalen, wat een correctie van de fluorescentie-intensiteitsgegevens vereist in een proces dat compensatie wordt genoemd. 
Compensatiecontroledeeltjes, meestal polymeerparels gebonden aan een enkele fluorofoor, zijn nodig voor elke fluorofoor die wordt gebruikt in een celetiketteringsexperiment. Gegevens van compensatiedeeltjes van de flowcytometer worden gebruikt om een correctie toe te passen op de fluorescentie-intensiteitsmetingen. Dit protocol beschrijft de bereiding en zuivering van polystyreencompensatieparels covalent gefunctionaliseerd met het fluorescerende reagens meso-tetra(4-carboxyfenyl) porfine (TCPP) en hun toepassing in flowcytometriecompensatie. In dit werk werden amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels behandeld met TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride) bij pH 6 en bij kamertemperatuur gedurende 16 uur met roeren. De TCPP-kralen werden geïsoleerd door centrifugeren en geresuspendeerd in een pH 7-buffer voor opslag. TCPP-gerelateerde deeltjes werden waargenomen als bijproduct. Het aantal van deze deeltjes kan worden verminderd met behulp van een optioneel filtratieprotocol. De resulterende TCPP-kralen werden met succes gebruikt op een flowcytometer voor compensatie in experimenten met menselijke sputumcellen gelabeld met meerdere fluoroforen. De TCPP-kralen bleken stabiel na 300 dagen bewaren in een koelkast.

Dit protocol voor de TCPP-etikettering van kralen is relatief snel en efficiënt. Figuur 1 toont een representatieve uitkomst van het TCPP-kraaletiketteringsproces zoals bepaald door flowcytometrie. Figuur 1A toont het gestandaardiseerde profiel van regenboogkralen, zoals gedetecteerd in het juiste kanaal voor het detecteren van TCPP. Deze kralen dienen als QC voor de standaardisatie van de laserspanningen voor de detectie van TCPP door de flowcytometer. <strong ...

Het protocol beschrijft hoe op porfyrine gebaseerde compensatieparels voor flowcytometrie worden bereid door de reactie van amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels met de porfyrine TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC. Een filtratieprocedure wordt gebruikt om de deeltjesbijproducten te verminderen.

Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

We ontwikkelden polystyreenparels gemodificeerd met de porfyrine TCPP als compensatiecontroles en meerkleurige flowcytometrie. De kralen die in dit protocol worden gebruikt, hebben een fluorescentie-intensiteit die vergelijkbaar is met TCPP-kleurcellen en gaan nog steeds door de flowcytometer. Dat is gelukt en we werken momenteel aan betere methoden om het fijnstofbijproduct te verwijderen.Porfyrine-gemodificeerde compensatieparels hadden de voorkeur boven TCPP-gekleurde cellen als compensatiecontroles. Deze snelheden waren maandenlang stabiel zonder significant verlies van fluorescentie. Van porfyrines is bekend dat ze kankercellen selectief kleuren.Het onderzoek combineert de selectiviteit van porfyrines met kwantitatieve flowcytometrie als een krachtig platform voor high-throughput analyse van menselijke monsters.

porphyrin-modified-beads-for-use-as-compensation-controls-flow

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.

Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

We hebben een protocol geoptimaliseerd voor het isoleren en zuiveren van Murine cardiale pericytes voor fundamenteel onderzoek en onderzoek naar hun biologie en therapeutisch potentieel.

Isolatie en zuivering van Murine cardiale Pericytes

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.

Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.

Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen

Hier wordt een methode beschreven die kan worden gebruikt om vijf of meer fluorescerende parameters af te beelden door middel van immunofluorescerende microscopie. Er wordt een analysepijplijn geschetst voor het extraheren van afzonderlijke cellen uit deze beelden en het uitvoeren van analyse van één cel door middel van flowcytometrie-achtige gatingstrategieën, die celsubsets in weefselsecties kunnen identificeren.

Histologiebeelden met hoge parameters genereren en analyseren met histoflowcytometrie

Meerkleurige flowcytometrie voor bloedplaatjes kan nieuwe subtypes van bloedplaatjes identificeren binnen klassieke subpopulaties van bloedplaatjes, zoals rust-, aggregatoire, procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes. Dit maakt het mogelijk om verschillende subpopulatiepatronen te vergelijken die worden geïnduceerd door verschillende bloedplaatjestagonisten. Hier wordt een procedure voor het opstellen van een meerkleurig flowcytometriepaneel in detail beschreven.

Analyse van subpopulaties van bloedplaatjes door middel van meerkleurige flowcytometrie

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Leer de bereiding van porfyrine-gemodificeerde polystyreen kralen als compensatiecontroles voor flowcytometrie. Deze methode biedt stabiele fluorescentie vergelijkbaar met TCPP-gekleurde cellen voor betrouwbare multikleuranalyses.

Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Meer video's verkennen