Name: Analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Verken de analyse van mitochondriale dichtheid en verdeling in levende skeletspiervezels van ratten met behulp van confocale microscopie en beeldverwerking. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale dynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de School of Medicine en het Institute for Obesity Research van Tecnologico de Monterrey. Figuur 3A is gemaakt met Scientific Image and Illustration software.

Confocale microscopische analyse van mitochondriën van rattenspieren

<ol><li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35(2014).</li>
<li>De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondria in health and disease.</a> Cell Calcium. 94, 102357(2021).</li>
<li>Chang, C. R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+mitochondrial+fission+through+modification+of+the+dynamin-related+protein+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).</li>
<li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305(2021).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging%3A+possible+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li>
<li>Díaz-Vegas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+increase+induced+by+RyR1+and+IP3R+channel+activation+after+membrane+depolarization+regulates+skeletal+muscle+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism.</a> Frontiers in Physiology. 9, 791(2018).</li>
<li>Boncompagni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+linked+to+calcium+stores+in+striated+muscle+by+developmentally+regulated+tethering+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).</li>
<li>Reggiani, C., Marcucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controversial+issue%3A+Can+mitochondria+modulate+cytosolic+calcium+and+contraction+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167(2022).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 26(2011).</li>
<li>Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li>
<li>Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700(2021).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li>
<li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li>
<li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li>
<li>Rivera-Alvarez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+session+of+physical+activity+restores+the+mitochondrial+organization+disrupted+by+obesity+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers.</a> Life Sciences. 256, 117965(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeconvolutionLab2%3A+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes%2C+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%2C+mitochondrial+homeostasis%2C+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).</li>
<li>Meinild, L. A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+increases+skeletal+muscle+mitochondrial+volume+density+by+enlargement+of+existing+mitochondria+and+not+de+novo+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis.</a> Acta Physiologica. 222 (1), (2018).</li>
<li>Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exercise and mitochondrial health.</a> Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).</li>
<li>Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+remodeling+in+exercise+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases.</a> Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+mitochondrial+ultrastructural+defects+in+mitochondria+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy.</a> Scientific Reports. 6, 30610(2016).</li>
<li>Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+is+a+distinguishing+feature+of+skeletal+muscle+fiber+types+and+regulates+organellar+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization.</a> Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).</li>
<li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation%2C+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+%5BCa2%2B%5D+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22In%3A+Pawley%2C+J.+%28eds%29+Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer, Boston, MA. (2006).</li>
<li>Otsu, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histogram%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+System+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histogram.</a> IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+mitochondria+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of mitochondria at the nanoscale.</a> Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.

Mitochondriën zijn organellen met een hoog remodelleringsvermogen. Hun inhoud, dichtheid en distributie kunnen snel worden gewijzigd door de activering van de mitochondriale fusie- en splijtingsmechanismen, bekend als mitochondriale dynamica1, en de balans tussen de mitochondriale omzetmechanismen: de mitochondriale biogenese en de gespecialiseerde mitochondriënafbraakroute, mitofagie21,22. Mitochondriale inhoud en morfologie kunnen variëren afhankelijk van het celtype en het ontwikkelingsstadium en kunnen worden gemodelleerd onder verschillende fysiologische en pathologische stimuli 17,22,23,24. Daarom is de studie van de mitochondriale morfologie al meer dan een halve eeuw relevant25. Met name de analyse van mitochondriën door middel van elektronenmicroscopie is de standaardtechniek die in meerdere onderzoeken istoegepast26.
Fluorescerende studies door confocale microscopie hebben de afgelopen jaren aan relevantie gewonnen vanwege hun vermogen voor beeldvorming van levende cellen van mitochondriën op verschillende vezeldiepten, wat zou kunnen helpen de rol van mitochondriën in skeletspieren beter te begrijpen in verschillende adaptieve en onaangepaste omstandigheden27. In deze studie wordt een methodologie beschreven voor de analyse van de dichtheid en verdeling van mitochondriën in levende skeletspiervezels door middel van confocale microscopie. Een van de grootste uitdagingen bij het werken met levende skeletspiervezels is het voorkomen van samentrekking van de isolatieprocessen tot aan de mitochondriale confocale opname. Om dit doel te bereiken, wordt een hoge Mg- en ATP Relax-oplossing17 gebruikt om de vezels gedurende ten minste 2 uur ontspannen te houden, wat voldoende tijd geeft om het vezelisolatieproces, de fluorofoorbelasting en de verwerving van het mitochondriale signaal door confocale microscopie uit te voeren. Een kritiek punt van het protocol is het mechanisch verkrijgen van de vezels, omdat dit een hoge precisie en vers weefsel vereist; Het is echter mogelijk om levensvatbare vezelbundels uit rattenspieren te verkrijgen met deze eerder gebruikte en gerapporteerde techniek28. Het verkrijgen van intacte vezels zorgt voor het behoud van het sarcolemma en de intracellulaire omgeving, waardoor de metabole en functionele overspraak tussen celstructuren behoudenblijft 28,29.
In tegenstelling tot het werken met weefsels of vaste cellen, maakt het verkrijgen van fluorescerende beelden van levende cellen door confocale microscopie real-time monitoring van het effect van verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Het huidige protocol kan worden gebruikt om veranderingen in mitochondriale dichtheid en distributie in real-time te onderzoeken en verschillen tussen experimentele groepen te onderzoeken, zoals de hier gepresenteerde voorbeelden tussen Lean en Ob-afgeleide vezels (Figuur 3 en Figuur 4). Er moet altijd rekening mee worden gehouden dat beeldvorming van levende cellen inhoudt dat optimale werkomstandigheden met kleine celbeschadiging worden gestandaardiseerd. De werktijd, de kwaliteit van de gebruikte oplossingen, de acquisitieparameters en de belichting van lasers moeten nauwkeurig worden gecontroleerd. Daarom worden hieronder essentiële overwegingen genoemd.
Mitochondriën van spiervezels kunnen niet volledig longitudinaal worden geregistreerd door confocale microscopie vanwege de grootte van de vezel en de schade aan de vezel die kan worden veroorzaakt door lange laserblootstelling. Desalniettemin wordt met deze techniek een representatief monster van de vezel geregistreerd. Hoewel het mogelijk is om de volledige dikte van de skeletspiervezel van een rat vast te leggen door middel van confocale microscopie, impliceert dit een langere opnametijd en blootstelling aan de laserstraal. In het geval van controleratten zijn er geen problemen met deze opnames ondervonden. Vezels van pathologische aandoeningen kunnen echter vatbaarder zijn voor schade, zoals waargenomen in de vezels van Ob-ratten. Daarom verdient het de voorkeur om een stapel representatieve confocale beelden te verkrijgen die op verschillende Z-afstanden zijn verkregen. Wanneer slechts een deel van de vezeldikte wordt geregistreerd, wordt aanbevolen om de stapel op dezelfde diepte te nemen op alle geteste vezels, aangezien de mitochondriale verdeling en dichtheid kunnen variëren afhankelijk van de positie in de vezel. Acquisitie van het signaal op een diepte van meer dan 15 μm wordt aanbevolen om representatieve confocale beelden van IMF te verkrijgen, waarbij SSM-populaties die zich dicht bij de periferie bevinden, worden vermeden.
Bij de confocale acquisitie moet rekening worden gehouden met enkele belangrijke overwegingen. Ten eerste de selectie van de immersieobjectieflens, rekening houdend met de vergroting, hoge NA en het onderdompelingsmedium. Aangezien cellen in een hydrofiel incubatiemedium worden bewaard, moet de brekingsindex van het incubatie- en immersiemedium vergelijkbaar zijn om een goed signaal te verkrijgen en diep in het weefsel te scannen. Meestal bereikt met behulp van een objectieflens voor onderdompeling in water. Confocale beelden van figuur 3 en figuur 4 werden verkregen met een 20x, 0,7 NA, wateronderdompelingsobjectief. Dit objectief maakt het mogelijk om de vezel in al zijn diepte vast te leggen, maar scannen op 15, 18 en 21 μm werd besloten omdat representatieve confocale beelden van IMF kunnen worden verkregen met een signaal met een hoge fluorescentie-intensiteit en kleine vezelbeschadiging. Andere vergrotingen, zoals 40x en olie als immersiemedium, kunnen worden overwogen, maar moeten worden geëvalueerd.
Ten tweede wordt de pixelgrootte voor beeldvorming berekend volgens de stelling van Nyquist, die het mogelijk maakt een geschikte pixelgrootte te selecteren die over-sample (hogere laserblootstelling) en onder-sample (leidt tot minder resolutie) vermijdt30. De berekening is afhankelijk van de kenmerken van de geselecteerde objectieflens en de golflengte (~90 nm). Het kan worden aangepast met de zoom; Daarom biedt slechts één zoominstelling een optimale pixelgroottevan 30. Toch hangt de zoom in de praktijk ook af van het gebied van het te analyseren monster. Het vinden van balans maakt het dus mogelijk om te werken met een pixelgrootte die het dichtst bij het Nyquist-criterium ligt en die ook past bij het te analyseren gebied. Figuur 3 en Figuur 4 werden verkregen met een pixelgrootte van 150 en 190 nm, waardoor de volledige breedte van de vezel kon worden geanalyseerd, namelijk ~50-80 μm.
Ten derde moet een geschikte gaatjesdiameter worden gebruikt die voorkomt dat onscherp licht de detector bereikt. Doorgaans wordt 1 Airy beschouwd als de optimale pinhole-grootte, omdat het de detectie mogelijk maakt van ~80% van de fotonen die afkomstig zijn van het focusvlak30. Desalniettemin vereisen sommige gekleurde biologische monsters die lage fluorescentieniveaus vertonen een gaatjesverhoging30. Confocale beelden van figuur 3 en figuur 4 werden verkregen met een gaatjesmaat van 3 Airy vanwege een laag signaal dat werd vastgelegd met een lagere Airy. Het is belangrijk om te bedenken dat de toename van de signaalintensiteit als gevolg van het vergroten van de pinhole-grootte leidt tot een verlaging van de resolutie als gevolg van meer onscherp opgevangen licht. Om deze reden raden we aan om een gaatjesmaat te gebruiken die zo dicht mogelijk bij 1 luchtig ligt.
Wanneer ze adequaat zijn verkregen, kunnen confocale beelden worden verwerkt om kwantitatieve informatie over de mitochondriale dichtheid en distributie te verkrijgen. Hoe dan ook, de kritische verwerkingsbeeldstap van drempels moet vóór de analyse worden uitgevoerd om de kwantificering van het signaal te verbeteren. Tijdens deze cruciale stap wordt de fluorescentie-intensiteitswaarde gedefinieerd die de positieve pixels voor mitochondriën scheidt van die van de achtergrond. De drempel kan worden gedefinieerd door een Gaussiaanse fit van de piek die mitochondriën vertegenwoordigt wanneer het histogram van de afbeelding twee pieken weergeeft, één die overeenkomt met de achtergrond en de andere met de mitochondriën. Een bimodale verdeling wordt echter niet altijd in elk van de afbeeldingen bereikt, dus moeten andere drempelmethoden worden toegepast.
In dit protocol wordt de implementatie van Otsu's drempelwaarde beschreven, een niet-parametrische en niet-gecontroleerde methode die is ontworpen om de drempelwaarde te vinden wanneer de twee pieken niet gescheiden zijn, of wanneer er andere pieken aanwezig zijn31. Otsu kan eenvoudig worden toegepast met behulp van een open-source platform voor biologische beeldanalyse; Er kunnen echter ook andere drempelmethoden worden getest. Dezelfde drempelmethode moet worden toegepast op alle confocale beelden en moet voor elk confocaal beeld afzonderlijk worden berekend. Het toepassen van de drempel op een hele stapel leidt tot onjuiste resultaten. Zodra de binaire beelden zijn verkregen na het drempelproces, kan de analyse van de mitochondriale dichtheid en FFT eenvoudig worden uitgevoerd door de instructies te volgen die in dit protocol worden beschreven. Bij het uitvoeren van beide analyses moet er echter op worden gelet dat kernen en haarvaten niet worden opgenomen, omdat dit tot kwantificeringsfouten zou leiden. Wat de dichtheid betreft, volstaat het om de pixels, of het gebied dat wordt ingenomen door de kernen of haarvaten, af te trekken van de pixels of het totale te analyseren gebied. Bovendien moet bij het uitvoeren van de FFT-analyse worden geverifieerd dat het mitochondriënsignaal recht is. Omgekeerd, wanneer het mitochondriënsignaal wordt gekanteld, kan het profielen produceren die niet de mitochondriale longitudinale verdeling vertegenwoordigen, wat onjuiste FFT-spectrumgegevens oplevert. Daarnaast kan een voorbewerkingsstap worden toegepast om de ruis in de beelden te verminderen. Dit protocol beschrijft twee optionele voorbewerkingsstappen met behulp van een mediaanfilter en 2D-deconvolutie. De effecten van deze voorbewerkingsmethoden op het beeld en de mitochondriale dichtheid zijn weergegeven in aanvullende figuur S1. Het is belangrijk om te bedenken dat hoewel deze voorprocessen de beeldkwaliteit kunnen verbeteren, ze ook kunnen leiden tot het verlies van bepaalde beelddetails. Daarom moeten ze met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt en consequent worden toegepast op alle afbeeldingen die worden geanalyseerd.
Ondanks de voordelen wordt confocale microscopie beperkt door een laterale resolutie (XY) van 180-250 nm wanneer de optimale omstandigheden voor acquisitie worden geïmplementeerd32. De mitochondriale diameter is ~200-700 nm, dicht bij de diffractielimiet van confocale microscopie; submitochondriale structuren kunnen dus niet adequaat worden gedetecteerd33 en kunnen niet worden geëvalueerd door dichtheids- en FFT-analyses die in dit protocol worden getoond. Andere superresolutietechnieken van microscopie, zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletie (STED) nanoscopie of gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), kunnen worden onderzocht om submitochondriale structuren op te lossen32. In dit protocol worden de confocale beelden van mitochondriën verkregen met behulp van de fluorofoor TMRE, die afhankelijk is van de mitochondriale membraanpotentiaal. Daarom kan de mitochondriale fluorescentie-intensiteit variëren afhankelijk van hun membraanpotentiaal. Voorafgaand aan de gegevensanalyse wordt een drempelproces uitgevoerd om dit probleem op te lossen. Alle pixels boven een gedefinieerde drempel worden als positief beschouwd voor het mitochondriale signaal, onafhankelijk van hun fluorescentiewaarde. Desalniettemin moet worden opgemerkt dat mitochondriën met een zeer laag membraanpotentiaal niet kunnen worden opgelost met deze techniek. Daarom worden aanvullende studies van de kwantificering van het mitochondriale eiwitgehalte aanbevolen. Een voordeel van het gebruik van TMRE is dat confocale beelden ook kunnen worden gebruikt voor mitochondriale membraanpotentiaalanalyse, maar dat er adequate controles met ontkoppelingsmiddelen moeten worden uitgevoerd, zoals carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP). Bovendien kunnen de instructies voor mitochondriale dichtheids- en distributieanalyse worden bereikt met behulp van groene fluorescerende indicatoren voor mitochondriën, die mitochondriën belasten ongeacht hun membraanpotentieel, maar de incubatiestrategie en confocale acquisitie-instellingen moeten worden gestandaardiseerd.
Aangezien de structuur van mitochondriën verband houdt met essentiële mitochondriale en cellulaire functies, kan het hier beschreven protocol waardevolle informatie opleveren over hun remodellering tijdens ziekte of door een bepaalde stressbelediging. Het zou kunnen bijdragen aan een beter begrip van de belangrijkste functies van skeletspieren die worden bestuurd door mitochondriën, zoals energieproductie, of waarin mitochondriën een belangrijke rol spelen bij de interactie met andere organellen, zoals contractie-metabolismekoppeling. Door de protocolinstructies te volgen, kan de mitochondriale dichtheid en distributie in levende skeletspieren worden geschat. De protocolstappen zijn onderverdeeld in drie hoofdfasen die gericht zijn op dissectie van skeletspierbundels, confocale microscopiescans en beeldanalyse, waarbij gedetailleerde instructies en belangrijke overwegingen zijn opgenomen. Het protocol kan met name verder worden geoptimaliseerd om aanvullende Z-stappen te verkennen voor volledige mitochondriale reconstructie binnen de vezel volgens de behoeften van de gebruiker. De confocale beeld- en analysestappen kunnen bijvoorbeeld worden getest om cellulaire structuren met een vergelijkbare verdeling te bestuderen, zoals TT in levende en vaste monsters.

Mitochondriën vormen zeer dynamische netwerken die voornamelijk worden gereguleerd door het evenwicht tussen de verlenging (fusie) en fragmentatie (splijting)1,2, die worden gemoduleerd door de expressie en activiteit van eiwitten zoals Mitofusine 1 en 2 (Mfn1 en Mfn2), en optische eiwitatrofie 1 (Opa1), die de fusie van het buitenste mitochondriale membraan en het binnenmembraan reguleren, respectievelijk 1,2. Dynamin-gerelateerd eiwit (Drp1) reguleert voornamelijk de mitochondriale splijting wanneer het wordt gefosforyleerd in de Ser6163.
In skeletspieren is het goed vastgesteld dat het mitochondriale netwerk is gerangschikt in structureel goed gedefinieerde subpopulaties op basis van hun nabijheid tot verschillende celregio's (myofibrillen, sarcolemma en kernen)4,5. De mitochondriën die zich direct onder het sarcolemma bevinden, worden subsarcolemmale mitochondriën (SSM) genoemd, die tussen de contractiele filamenten worden intermyofibrillaire mitochondriën (IMF) genoemd en de mitochondriale subpopulatie rond de kernen wordt perinucleair mitochondriënnetwerk (PMN) genoemd. Bovendien is gesuggereerd dat deze mitochondriale subpopulaties regiospecifieke functies hebben en metabolisch gespecialiseerd zijn 4,5.
Het behoud van de homeostase van cellulaire energie, die metabole en contractiele functie mogelijk maakt, hangt in grote mate af van de interactie en communicatie op specifieke plaatsen via het mitochondriale netwerk (bijv. IMF- en SSM-interactie)4,6. Naast netwerkinteracties van mitochondriën kan het mitochondrion ook interageren met andere organellen, waardoor structurele en functionele complexen worden gevormd. In dit verband is aangetoond dat IMF kan worden gelokaliseerd naast het sarcoplasmatisch reticulum (SR) en in de nabijheid van de Ca2+ release units (CRU), gevormd door de transversale tubuli (TT)7. Dit feit is relevant vanwege de rol van mitochondrialeCa 2+ opname bij het reguleren van ATP-synthese en apoptose. Onlangs is ook een mogelijke rol bij het reguleren van cytosolischeCa 2+-transiënten gesuggereerd8.
TT zijn invaginaties van sarcolemma die een periodieke verdeling hebben langs de lengteas van cardiomyocyten en skeletspiervezels 9,10, vergelijkbaar met de IMF-verdeling 5. Veranderingen in de verdeling van TT hebben belangrijke fysiologische implicaties, gezien hun rol in de contractiele functie. Deze veranderingen zijn echter voornamelijk geëvalueerd in cardiomyocyten. Met behulp van Fast Fourier Transform (FFT)-analyse kunnen periodieke signalen van het afstandsdomein worden omgezet in het frequentiedomein, wat resulteert in een FFT-spectrum dat de frequentie en de regelmaat van het signaal 11,12,13 aangeeft. Hoewel er aanwijzingen zijn dat de organisatie van het mitochondriale netwerk in skeletspiervezels essentieel is voor aanpassing aan verschillende metabole omstandigheden, zoals tijdens regeneratie na spierblessure14,15, worden de meeste analyses kwalitatief uitgevoerd.
Bovendien, gezien het feit dat mitochondriale disfunctie in verband is gebracht met verschillende skeletspiergerelateerde (bijv. atrofie in onbruik)2 en niet-spierziekten, met name stofwisselingsziekten, en het daarmee gepaard gaande verlies van spiermassa (d.w.z. atrofie)16, is de kwantitatieve evaluatie van het mitochondriale netwerk en de verdeling in skeletspieren relevant. Onlangs is een significant verschil in de longitudinale verdeling van mitochondriën van gastrocnemius-spiervezels tussen een zwaarlijvige groep (Ob; Zucker fa /fa rats), en een lean groep (Lean; Zucker +/+ ratten) werd geïdentificeerd via FFT17. Deze studie toonde het nut van de FFT aan bij het analyseren van de mitochondriale verdeling. Daarom presenteert dit protocol een methodologie om mitochondriën in levende skeletspiervezels te bestuderen op basis van beelden verkregen door fluorescentie confocale microscopie. De mitochondriale dichtheid wordt gekwantificeerd door achtergronddrempels, en de analyse van de longitudinale mitochondriale verdeling door FFT-analyse wordt ook beschreven. In figuur 1 wordt een werkstroomschema weergegeven.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5&rsquo;-trifosfaat dinatriumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglazen dekglas</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop software Leica Application Suite&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Creatinefosfokinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Asparaginezuur kaliumzout hemihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&acute;N&acute;-tetraazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objectief&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Apfelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Glutaminzuur mononatriumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Health</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micro schaar</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Open-source platform voor biologische-beeldanalyse Fiji&nbsp;</td><td>Openbaar, onderhouden door Eliceiri/LOCI groep, Jug groep en Tomancak lab.Fiji</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatine dinatriumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>PSF Generator (PSF_Generator.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opnamekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrodamine, ethylester</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Het mitochondrion is een organel dat kan worden uitgerekt, gefragmenteerd en gerenoveerd volgens de metabolische vereisten van de cellen. Door de hermodellering van het mitochondriale netwerk kunnen gezonde mitochondriën voldoen aan de cellulaire eisen; Het verlies van deze capaciteit is echter in verband gebracht met de ontwikkeling of progressie van verschillende pathologieën. In skeletspieren worden veranderingen in de mitochondriale dichtheid en distributie waargenomen bij fysiologische en pathologische aandoeningen zoals inspanning, veroudering en obesitas. Daarom kan de studie van het mitochondriale netwerk een beter begrip geven van mechanismen die verband houden met die aandoeningen.
Hier wordt een protocol beschreven voor mitochondriën beeldvorming van levende skeletspiervezels van ratten. Vezels worden handmatig ontleed in een ontspannende oplossing en geïncubeerd met een fluorescerende beeldvormingsindicator van mitochondriën (tetramethylrhodamine-ethylester, TMRE). Het mitochondriënsignaal wordt geregistreerd door confocale microscopie met behulp van de XYZ-scanmodus om confocale beelden van het intermyofibrillaire mitochondriale (IMF) netwerk te verkrijgen. Daarna worden de confocale beelden verwerkt door middel van drempels en binarisatie. Het gebinariseerde confocale beeld is verantwoordelijk voor de positieve pixels voor mitochondriën, die vervolgens worden geteld om de mitochondriale dichtheid te verkrijgen. Het mitochondriale netwerk in skeletspieren wordt gekenmerkt door een hoge dichtheid van de IMF-populatie, die een periodieke longitudinale verdeling heeft die vergelijkbaar is met die van T-tubuli (TT). De Fast Fourier Transform (FFT) is een standaard analysetechniek die wordt uitgevoerd om de verdeling van TT te evalueren en die het mogelijk maakt om de distributiefrequentie en het niveau van hun organisatie te vinden. In dit protocol wordt de implementatie van het FFT-algoritme beschreven voor de analyse van de longitudinale mitochondriale verdeling in skeletspieren.

Volgens het huidige protocol kan de analyse van de dichtheid en verdeling van mitochondriën worden bereikt in levende skeletspieren. Het protocol is verdeeld in drie hoofdfasen: dissectie van skeletspierbundels, confocale microscopiescans en beeldanalyse. Het workflowoverzicht is weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een hele gastrocnemiusspier van een rat in een petrischaaltje, die de laterale kop markeert waaruit de vezels worden verkregen, terwijl figuur 2B de vezelbundels in Relax-oplossing toont. Door confocale microscopie kunnen de mitochondriën worden geregistreerd langs de diepte van levende skeletspiervezels met behulp van de fluorescerende indicator TMRE. TMRE is een lipofiele kationische fluorofoor die selectief wordt geaccumuleerd in mitochondriën volgens de mitochondriale membraanpotentiaal20.
Een optimaal confocaal beeld van IMF kan worden verkregen door een Z-afstand van meer dan 15 μm diepte in de vezel te selecteren (Figuur 3A). Figuur 3B toont representatieve XY-confocale beelden van mitochondriën geladen met TMRE, verkregen langs de Z-afstand van gastrocnemius-spiervezels (15 tot 21 μm). De confocale beelden werden verwerkt door drempels om ze om te zetten in binaire beelden om mitochondriale analyse mogelijk te maken. Figuur 3B (linkerpaneel) toont een vezel van een getrainde Magere rat. Het vertegenwoordigt een verwacht confocaal record van mitochondriën van skeletspiervezels, omdat het een consistent patroon langs de vezel heeft. Daarentegen selecteerden we een vezel van een Ob-rat (Figuur 3B, rechterpaneel) die substantiële veranderingen in mitochondriale inhoud en distributie vertoont. Figuur 3C toont de kwantificering van het vezelgebied dat wordt ingenomen door de mitochondriën, uitgedrukt als mitochondriale dichtheid, verkregen uit elk gebinariseerd beeld (weergegeven in paneel B). Zoals verwacht vertoonde de Ob-vezel een lagere mitochondriale dichtheid. Het werd consistent gekwantificeerd langs de geanalyseerde Z-afstand, die ook wordt waargenomen in figuur 3D wanneer de mitochondriale dichtheid wordt berekend per stapel die wordt geconformeerd door de drie confocale beelden die zijn verkregen op 15, 18 en 21 μm.
Net als bij de mitochondriale dichtheidsanalyse, maakt het confocale scannen van een fluorescerende indicator voor beeldvorming van levende cellen, zoals TMRE, het mogelijk om de longitudinale organisatie van mitochondriën in levende skeletspieren te bestuderen. IMF presenteert een periodieke organisatie in de I-band in de buurt van TT7, die door FFT kan worden geanalyseerd om de frequentie van het mitochondriale signaal en het organisatieniveau17 te kwantificeren. Figuur 4 toont de verschillen in de organisatie van IMF gevonden in gastrocnemius afgeleid van Lean en Ob ratten en hoe FFT het mogelijk maakt om de veranderingen in de verdeling van het mitochondriale signaal te vinden. Figuur 4A,B toont longitudinale ROI's die zijn geselecteerd in een centrale en laterale positie in de vezel voor FFT-analyse. Voordat FFT wordt uitgevoerd, wordt de drempelwaarde voor achtergrondaftrekking berekend. Vervolgens wordt het beeld gebinariseerd; Deze procedures elimineren de variaties in fluorescentie-intensiteitsniveaus van het mitochondriale signaal. Het binaire beeld geeft het plotprofiel van de fluorescentieverdeling die nodig is om de FFT uit te voeren.
Figuur 4C,D toont de geselecteerde ROI's in panelen A en B met hun plotprofielen (bovenste panelen). Aan de hand van de plotprofielen kunnen verschillen in de fluorescentieverdeling tussen de vezels afkomstig van Lean en Ob-ratten worden waargenomen, evenals de variaties tussen ROI's binnen dezelfde vezel. Voor elk perceelsprofiel wordt hun respectieve FFT-spectrum gepresenteerd (onderste panelen). De piek van het maximale FFT-spectrum geeft de FFT-frequentie (X-as) van de mitochondriale signaalverdeling langs de lengteas aan. Het kan worden omgezet in een afstandswaarde van bijna 2 μm in de laterale en centrale ROI's van de Lean rat. Met name de FFT-grootte van de piek is een index van de regelmaat van het mitochondriale signaal, en veranderingen in deze amplitude onthullen veranderingen in de mitochondriale verdeling.
Figuur 4E,F toont de verschillen in het FFT-spectrum tussen Lean en Ob-afgeleide vezels waarbij respectievelijk laterale en centrale ROI's werden geanalyseerd. In laterale ROI's (Figuur 4E) was de frequentie van mitochondriale longitudinale verdeling vergelijkbaar in de magere en Ob-afgeleide vezels; niettemin was de amplitude van de maximale FFT-piek in de Ob-afgeleide vezels hoger, wat in overeenstemming is met de hogere regelmaat van het signaal dat wordt waargenomen in de afbeelding in figuur 4B. Desalniettemin wordt de centrale ROI (Figuur 4F) van de Ob waargenomen als een voorbeeld van een kritische vermindering van de FFT-piek in vergelijking met Lean wanneer een belangrijke verandering van de mitochondriale verdeling aanwezig is.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schema voor mitochondriale analyse in skeletspieren door confocale microscopie. Dit schema vat de belangrijkste stappen van het protocol samen in drie afzonderlijke fasen. De eerste fase, dissectie van gastrocnemius-spiervezelbundels, is onderverdeeld in drie opeenvolgende stappen, gastrocnemius-spierisolatie, gevolgd door spiermechanische dissectie in bundels om uiteindelijk een visuele selectie te maken van de levensvatbare. De tweede fase bestaat uit het verkrijgen van beeldvorming van levende cellen door confocale microscopie, die bestaat uit incubatie met de fluorofoor (TMRE) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de vezels in de kamer te plaatsen. Daarna worden de juiste instellingen in de microscoop gemaakt om de confocale beelden te verkrijgen. Tijdens de derde fase worden confocale beeldverwerking en data-analyse uitgevoerd. Te beginnen met beeldverwerking, waarbij een drempelwaarde nodig is om binaire beelden te genereren op basis waarvan mitochondriale dichtheidsberekeningen en mitochondriale distributie door FFT worden gedaan. Afkortingen: TMRE = tetramethylrhodamine ethylester; FFT = Snelle Fouriertransformatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Figuur 2: Dissectie van skeletspierbundels. (A ) Ontlede laterale gastrocnemiuskop van de rat (zwarte pijl) in een petrischaal met Relax-oplossing. (B) Representatief beeld van gastrocnemius-spiervezelbundels in Relax-oplossing vóór TMRE-belasting. Afkorting: TMRE = tetramethylrhodamine ethylester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Figuur 3: Mitochondriale dichtheidsanalyse. (A) Illustratie die de aanbevolen Z-afstand weergeeft voor confocale scanning van IMF-mitochondriën in skeletspiervezels. (B) Reeks confocale beelden van mitochondriën geladen met TMRE in skeletspiervezels, verkregen van een getrainde Zucker +/+ rat (Lean) en van een zwaarlijvige Zucker fa /fa rat (Ob) opgenomen in de Z-afstand (van 15 tot 21 μm diepte). De beelden werden verwerkt door middel van drempels en omgezet in binaire beelden. (C) Berekende mitodichtheid van de confocale plakken verkregen op verschillende Z-afstanden waargenomen in paneel B. (D) De mitodichtheid verkregen uit de schoorsteen die is samengesteld uit de beelden die zijn waargenomen in paneel B. Beelden in paneel B zijn 65 x 50 μm. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: Mito-dichtheid = Mitochondriale dichtheid; IMF = intermyofibrillaire mitochondriën; Ob = zwaarlijvig; SSM = subsarcolemmale mitochondriën. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Figuur 4: Mitochondriale verdelingsanalyse door FFT. Representatieve confocale beelden van mitochondriën geladen met de fluorescerende indicator TMRE verkregen op 21 μm van de diepte van skeletspiervezels verkregen van een getrainde Zucker +/+ rat (Lean, panel A) en van een zwaarlijvige Zucker fa /fa rat (Ob, panel B). De beelden werden verwerkt door middel van drempels en omgezet in binaire beelden. Laterale en centrale ROI's van paneel A (paneel C) en paneel B (paneel D) met hun respectievelijke plotprofielen van fluorescentie-intensiteit (bovenste plot) en FFT-spectrum (onderste plot). FFT werd berekend op basis van ROI's met een breedte van 256 pixels, wat overeenkomt met een ROI-grootte van 39 x 5 μm in paneel A en een ROI-grootte van 50 x 5 μm in paneel B. Panel E toont de verschillen van het FFT-spectrum tussen mitochondriën afgeleid van Lean en Ob-ratten in de laterale ROI, terwijl panel F de verschillen van het FFT-spectrum van centrale ROI laat zien. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: A.U. = Arbitrary Units; FFT = Snelle Fouriertransformatie; ROI's = regio's van belang; Ob = zwaarlijvig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie in 100 ml</td>
			<td>Voorraad </td>
		</tr><tr><td>K-aspartaat</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-glutaminezuur</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Appelzuur</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM vrij Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,00002 mM vrij Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fosfocreatine di-Na</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr><tr><td>Creatine fosfokinase</td>
			<td>5 E/ml</td>
			<td>200 E/ml</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7,3 (met NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Relaxoplossing, reagentia en concentratie.
Aanvullende figuur S1: Effect van de methoden voor het voorbewerken van afbeeldingen. (A) Representatieve confocale beelden van mitochondriën geladen met de fluorescerende indicator TMRE, verkregen op een diepte van 18 μm in skeletspiervezels, verkregen van een getrainde Zucker +/+ rat (Lean, bovenste paneel) en van een zwaarlijvige Zucker fa /fa rat (onderste paneel), samen met hun respectievelijke beelden verkregen na voorbewerking met behulp van Otsu'-drempelwaarde, mediaanfilter en Otsu'-drempelwaarde, en 2D-deconvolutie en Otsu'-drempels. (B) Plotprofiel van de mitodichtheid verkregen uit de confocale beelden (paneel A) na voorbewerking met verschillende methoden. Beelden in paneel A zijn 65 x 50 μm. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: 2D-Decon = 2D deconvolutie; Mito-dichtheid = Mitochondriale dichtheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een protocol om veranderingen in mitochondriale dichtheid en longitudinale distributie te analyseren door middel van beeldvorming van levende skeletspieren met behulp van confocale microscopie voor het scannen van mitochondriale netwerken.

Analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

De remodellering van het mitochondriale netwerk vindt plaats bij fysiologische stress en pathologische omstandigheden. De effecten van mitochondriale remodellering in een skeletspier blijven echter onvolledig begrepen. Dit protocol maakt het mogelijk om veranderingen van mitochondriën in levende skeletspieren te kwantificeren, waardoor we het samenspel tussen mitochondriale veranderingen en cellulaire functie beter begrijpen.Het werken met levende skeletspieren brengt uitdagingen met zich mee als gevolg van vezelcontractie tijdens isolatie en gevoeligheid voor beeld tijdens confocaal scannen. Dit protocol beschrijft een isolatieproces met behulp van een ontspanningsoplossing, waardoor levensvatbare spiervezels kunnen worden geanalyseerd voor mitochondriale beoordeling via confocale microscopie. Ons protocol richt zich op het gebrek aan workflows om mitochondriale netwerken in skeletspiervezels kwantitatief te analyseren.De hier beschreven stappen stellen gebruikers in staat om meer te profiteren van beelden die zijn verkregen door confocale microscopie met behulp van beeldverwerking door drempels en snelle Fourier-analyse om kwantificering van de mitochondriale dichtheid en distributie te bereiken. We zijn geïnteresseerd in de studie van skeletspierverandering, in het bijzonder mitochondriale dynamiek en mitochondriale structurele remodellering tijdens tegenspoed en hoe deze kunnen worden gemoduleerd door interventie zoals lichaamsbeweging en intermediair vasten.

analysis-mitochondrial-density-longitudinal-distribution-rat-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk...

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Het visualiseren en analyseren van mitochondriën uit hersenweefsel van zoogdieren is een uitdagende taak. Hier beschrijven we hoe driedimensionale (3D) reconstructie-analyse van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de morfologische en volumetrische analyse van dit cruciale energieproducerende orgaantje.

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.

Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Hier beschrijven we de mitochondriale gebeurtenislokalisator (MEL), een ImageJ-plug-in die nuttig is bij het kwantificeren van de 3-dimensionale veranderingen in mitochondriale splijting en fusieactiviteit in de loop van de tijd. We beschrijven ook een beeldverwerkingspijplijn die nuttig is voor het opschonen van microfoto's voorafgaand aan analyse in ImageJ.

Inzicht in de veranderingen in mitochondriale morfologie door middel van dynamische en driedimensionale fluorescentiemicrofoto's

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Verken de analyse van mitochondriale dichtheid en verdeling in levende skeletspiervezels van ratten met behulp van confocale microscopie en beeldverwerking. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale dynamiek.

Analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie (Video) | JoVE Journal

Analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie

Meer video's verkennen