Name: Evaluatie van de impact van een nieuw koelcelprocessorsysteem op de faciliteit voor het isoleren van eilandjescellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Leer een gekoeld celprocessorsysteem voor het isoleren van humane mononucleaire buffy coat-cellen in een GMP-cleanroom. Deze methode verbetert celviabiliteit en herstel na centrifugatie voor klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het Europese genomische instituut voor diabetes bedanken (ANR-10- LABEX-0046 naar FP) en Qatar metabool instituut - Hamad medische corporatie, Qatar. De auteurs bedanken ook het Medisch Onderzoekscentrum bij Hamad Medical Corporation voor  ondersteuning van artikelverwerkingskosten.

In dit protocol is gebruikgemaakt van afgedankt volbloed dat niet geschikt was voor gebruik volgens de richtlijnen voor afvoer van de instelling. Goedkeuring door de ethische commissie (IRB) en geïnformeerde toestemming zijn niet van toepassing.
1. Opstelling van de gekoelde celprocessor
OPMERKING: Alle procedures moeten in een cleanroom-omgeving worden uitgevoerd, en het personeel moet de kledingvoorschriften voor de cleanroom naleven.
<ol>
	<li>Aanschaf van apparatuur
	<ol>
		<li>Koop een reserveplexiglasdeksel. Koop het koelapparatuursysteem: een koeler met een mechanisch gekoelde gasstroomtemperatuurregelaar, een luchtdroger, een druk- en debietregelaar en de garantie (optioneel). Raadpleeg de Tabel met materialen voor referenties. 
		OPMERKING: De totale kosten bedragen $ 16.13 exclusief verzend- en douanekosten.</li>
		<li>Bestel medische droge lucht, een gecomprimeerd medisch gas dat voldoet aan de standaardgraad (referentie Europese farmacopee 1238), bij de lokale leverancier van medische gassen. Koop 2 cilinders van 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diameter x lengte).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installatie van de apparatuur (Figuur 1 en Figuur 2)
	<ol>
		<li>Plaats de apparatuur in de GMP-cleanroom (desinfecteer vóór het betreden van de cleanroom volgens de GMP-procedures).</li>
		<li>Installeer voor de medische perslucht een gasleiding in plaats van de gascilinder direct in de cleanroom te plaatsen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modificatie van de celprocessor voor koeling
	<ol>
		<li>Verwijder eerst de plexiglasafdekking. Bewaar de originele plexiglasafdekking voor het geval er problemen ontstaan met de garantie. Boor een gat in het reservedeksel van de celprocessor met een diameter die overeenkomt met de buitendiameter van de spuitmond van het koeltoestel om barsten in de centrifugedekking te voorkomen (13,3 mm aanbevolen).</li>
		<li>Bevestig beugels samen met een cirkelvormig stuk schuim. Dit wordt gedaan om breuk en/of krassen op het deksel te voorkomen, om de koelspuitmond boven de celprocessor op zijn plaats te houden, om het deksel te beschermen tegen overmatige buiging door de hoge druk van de ingespoten lucht, om het gewicht van de spuitmond te ondersteunen en ten slotte om de maximale veiligheid van de operator te waarborgen, zodat er vrije en veilige toegang is tot alle vereiste functies van de celprocessor tijdens de experimentele procedure.</li>
		<li>Koppel het koelsysteem aan de celprocessor door de koelspuitmond aan het gat in het plexiglas te bevestigen. Zet deze vast met beugels en schuimkussens.</li>
		<li>Plaats de koelbehuizing op maximaal 8 voet (2,4 m) afstand van de spuitmond. Plaats de temperatuurregelaar in een aparte kast binnen 6 voet (1,83 m) van de koelbehuizing.</li>
		<li>Stel het koeler-setpoint in op -40 °C voor het koelen van de luchtstroom op de koeler. De uitlaattemperatuur van de lucht wordt continu weergegeven op de digitale indicator met een resolutie van 0,1 °C. Stel de uitlaattemperatuur digitaal in op 0,1 °C met de temperatuurregelaar.</li>
		<li>Controleer de druk en het debiet van de luchttoevoer op de druk- en debietregelaarmodule (Figuur 2) voordat deze naar de koeler gaat. Stel deze respectievelijk in op 55 psi en een debiet van 4 SCFM om de optimale condities te bereiken bij een luchtstroom die is gekoeld op -30 °C ± 2 °C.</li>
		<li>Verifieer dat de medische gastoevoer gereguleerd is op een uitlaagdruk van 5 bar en ten minste 90 min meegaat, aangezien dit vereist is om de perslucht -30 °C te laten bereiken. 
		&#8203;OPMERKING: Medische droge lucht is gecomprimeerd medisch gas, en volledig onder druk gezette droge lucht voldoet aan de standaardgraad.</li>
		<li>Lever 5 bar vanuit een koelspuitmond die is verbonden met het deksel van de celprocessor via een gat dat in de centrifugedekking is geboord. Spuit de gekoelde medische lucht in de centrifugatiekom van de celprocessor (Figuur 2). Selecteer de positie van de luchtinjectie zodanig dat de gekoelde lucht loodrecht op de aluminium rand van de centrifugerotor is gericht.</li>
		<li>Zorg bij het voorbereiden van de celprocessor dat de rotor op kamertemperatuur (18 °C) is. Stel de automatische thermoregelaar van het koelsysteem in op -30 °C en richt de injecties van koude lucht op de rotor. 
		OPMERKING: Er zijn verschillende testcondities beproefd om een optimale temperatuurgradiënt van +4 °C te bereiken, wat noodzakelijk is om de thermische weerstand van het cel-separator-systeem van de celprocessor en de opwarming van de rotor tijdens centrifugatie te overwinnen. De geprogrammeerde thermoregelaar houdt de optimale doeltemperatuur in de celprocesmachine tijdens de procedure, en met name tijdens de centrifugatie, in stand bij een cleanroomtemperatuur van +18 °C.
		<ol>
			<li>Stel de celprocessor in met een eerste voorkoelfase om de processor (zonder de celprocessor-kit) af te koelen tot +3 °C gedurende 30 tot 45 min, en een tweede voorkoelfase waarbij de celprocessor moet draaien met de kit die is voorkoeld op +4 °C bij 134 x g gedurende 5 min.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Telling van zwevende deeltjes
<ol>
	<li>Beoordeel de conformiteit van het koelapparaat met de GMP-cleanroomomgeving volgens de ISO 1464-1 norm om de impact van warmteapparaten tijdens de operationele fase te evalueren.</li>
	<li>Gebruik monitoring van de partikelconcentratie om aan te tonen dat het vereiste reinigheidsniveau wordt bereikt bij kritische controlepunten in rust en tijdens gebruik.
	<ol>
		<li>Het minimale aantal bemonsteringslocaties is afhankelijk van het gemeten oppervlak. Bereken dit met de vergelijking 
		<img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;waarbij A het oppervlak van de cleanroom of de gecontroleerde schone luchtruimte is in m2, en NL het aantal bemonsteringslocaties is, naar boven afgerond op een geheel getal.</li>
		<li>Het luchtbemonsteringsvolume is het minimumvolume per locatie. Zorg ervoor dat het luchtvolume groot genoeg is om 20 partikels van de grootste gespecificeerde partikelgrootte te tellen. Bereken het luchtbemonsteringsvolume via de vergelijking 
		V= 20/C x 10 
		waarbij V het minimale enkelvoudige bemonsteringsvolume per locatie is, uitgedrukt in L, en C de klasselimiet is (aantal partikels/m3).</li>
		<li>Gebruik voor elke locatie, afhankelijk van het oppervlak, één of meer monsters. Zorg dat het kleinste bemonsterde volume per locatie 2 L is en de minimale bemonsteringstijd ten minste 1 min bedraagt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spoel voor het bemonsteren de partikelteller door met een spoelfilter. Verwijder het filter en plaats de isokinetische probe voor bemonstering.</li>
	<li>Plaats de partikelteller op de geïdentificeerde bemonsteringslocatie. Start de monstername vanaf het hoofdscherm van de partikelteller.</li>
	<li>Zodra de bemonstering is voltooid, brengt u de partikelteller naar de volgende locatie. Wanneer alle bemonsteringslocaties zijn bewerkt, beoordeelt u de gegevens en print u een rapport.</li>
	<li>Wanneer de gemiddelde partikelconcentratie voor alle bemonsteringspunten in het gebied onder de klasselimiet ligt die is vermeld in Tabel 1, wordt de ruimte beschouwd als goedgekeurd voor de toegestane partikelconcentratie.</li>
</ol>
3. Bereiding van de gradiënt en verwerking van de celseparatie
<ol>
	<li>Koel de gradiënten met lage en hoge dichtheid en de cell processor-kits vooraf een nacht lang bij +4 °C in een koelkast.</li>
	<li>Koel de cell processor 45 min voor in rust (d.w.z. schakel de cell processor in voor gebruik). Houd de temperatuur tussen +2 °C en +5 °C. Plaats de bij +4 °C voorgekoelde cell processor-kit.</li>
	<li>Sluit bij de standaard met ethanol gekoelde dubbelwandige gradiëntmaker (optioneel; Figuur 3) de 2 glazen kamers aan en plaats deze op een magneetroerer. Klem de slang tussen de 2 kamers. Koel de gradiëntmaker met een ethanol-circulerende koelmachine bij 0 °C.</li>
	<li>Bereid eerst het laden van de zware laag aan de onderkant van de zak voor door de kamer te vullen met 130 mL gradiënt met hoge dichtheid (HD; 1,087 g/mL). Laad bij een pompsnelheid van 150 mL/min.</li>
	<li>Zodra de zware gradiënt in de zak zit, voegt u 130 mL hoge dichtheid (HD) toe aan het voorste bekerglas en 140 mL gradiënten met lage dichtheid (LD; 1,063 g/mL) aan de achterzijde (klem gesloten).</li>
	<li>Verwijder de hemostat/klem tussen de 2 kamers en creëer een continue gradiënt bij een pompsnelheid van 50 mL/min.</li>
	<li>Bereid vooraf menselijke mononucleaire buffy coat-cellen voor op zuivering uit meerdere gepoelde anonieme buffy coats verzameld uit whole blood-afvalproducten (40 mL tot 60 mL volbloed werd toegevoegd aan 10 buffy coat-zakken), afhankelijk van de beschikbaarheid vanuit de bloedbank.
	<ol>
		<li>MNC-separatie
		<ol>
			<li>Gebruik dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor de isolatie van mononucleaire menselijke cellen met lage dichtheid. Volg hiervoor de hieronder beschreven stappen.</li>
			<li>Bereken voor de celvoorbereiding het volume bloed (anticoagulatievolbloed of gesuspendeerde buffy coat). Verdun het bloed met 2x-4x buffersolution door mengen via inversie. Hoe verder het bloed is verdund, hoe hoger de zuiverheid van de mononucleaire cellen.</li>
			<li>Bereid de buffer voor door fosfaatbuffer te mengen met een antistollingsmiddel. Bereken het aantal benodigde buisjes door het bloedvolume te delen door 35 mL en giet 15 mL dichtheidsgradiëntoplossing van 1,073 in elk buisje.</li>
			<li>Laag 35 mL van de verdunde bloedsuspensie geleidelijk over de dichtheidsgradiënt door deze voorzichtig over het oppervlak van de dichtheidsgradiënt te laten lopen met behulp van een spuit van 60 mL verbonden met een naald; gebruik bij kleine volumes een pipet. Probeer de interface niet te verstoren, aangezien dit zal leiden tot een gebrekkige mononucleaire laag.</li>
			<li>Centrifugeer 20 min bij 40 x g bij 20 °C zonder onderbrekingen (acceleratie&#160;0, deceleratie&#160;0). Oogst na centrifugatie voorzichtig de interfaselayer van mononucleaire cellen met een steriele transferpipet. Overbreng de cellen naar een andere nieuwe conische buis van 50 mL.</li>
			<li>Was de cellen 2x met buffer (PBS met toegevoegd antistollingsmiddel). Vul bij de eerste wasbeurt de buis met de cellen met buffer tot 50 mL. Centrifugeer 10 min bij 30 x g bij 20 °C om de cellen te pelletteren (acceleratie&#160;9, deceleratie&#160;0). Verwijder voorzichtig al het supernatant.</li>
			<li>Voer de tweede wasbeurt uit voor de verwijdering van bloedplaatjes. Resuspendeer de pellet tot een volume van 50 mL met buffer. Centrifugeer 10 min bij 200-30 x g bij 20 °C (acceleratie&#160;9, deceleratie&#160;0).</li>
			<li>Reconstitueer de cellen tot een eindvolume van 5 mL; deze cellen moeten een specifiek gewicht hebben dat overeenkomt met MNC met lage dichtheid &lt; 1,073. Meet de specifieke dichtheid van de gradiënt met een densitometer.</li>
			<li>Resuspendeer de pellet tot een eindvolume van 10 mL met 95 mL gradiëntmedium met hoge dichtheid (1,083 g/mL) in een transferzak. Gebruik dit product voor zuivering met een celseparator. Het eindvolume van 10 mL bevat cellen en 1,083 gradiëntmedium met hoge dichtheid. 
			OPMERKING: De buffy coat kan een nacht lang in de koelkast worden bewaard in PBS bevattend 0,5% BSA of autoloog plasma. De buffy coat kan ook worden gewassen.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laad de vooraf gevormde gradiënten bovenaan met maximaal 30 mL MNC geïsoleerd uit de buffy coat, gesuspendeerd in 10 mL geconcentreerd conserveermedium, met behulp van een peristaltische pomp bij 25 mL/min. Houd de gradiënt bij +4 °C.</li>
	<li>Meet continu de temperatuur in de cell processor met een vooraf gekalibreerde thermoprobe. Controleer met een digitale thermokoppel verbonden met een steriele thermoprobe de temperatuur van de gradiënten en cellen tijdens het proces.</li>
</ol>
4. Optimalisatie van verschillende stappen van gradiëntladen
<ol>
	<li>Plaats de celprocessor-kit die is voorgekoeld op +4 °C. Laad de zware gradiënt (130 mL) bij + 4,5 °C. Stel aan het einde van het laden van de gradiënt de centrifuge in op een relatief lage snelheid (537 x g) om de door de rotor gegenereerde warmte te minimaliseren.</li>
	<li>Schakel de celprocessor uit zodat het hydraulische systeem kan terugkeren naar de niveaus van vóór de run en lucht kan ontsnappen.</li>
	<li>Start de celprocessor opnieuw op 537 x g en voeg de zware (130 mL) en lage (140 mL) dichtheidsgradiënten toe om een continue dichtheidsgradiënt te creëren bij +4,3 °C en een stroomsnelheid van 50 mL/min.</li>
	<li>Laad de buffy coat (30 mL) met 10 mL koud bewaarmedium bij +6 °C en een stroomsnelheid van 25 mL/min. Voeg 50 mL (25 mL x 2) wassoplossing toe.</li>
	<li> Verzamel na 5 min bij +5 °C de gecentrifugeerde gradiënt in 12 flessen bij een stroomsnelheid van 10 mL/min.</li>
	<li>Vul buizen met wasmedium (M19 + 20% humaan albumine + 10% penicilline-streptomycine). Vul buis 1 met 10 mL wasmedium en 150 mL cellen en buizen 2-12 met 25 mL wasmedium en 25 mL cellen.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Eilandjesisolatiefaciliteiten over de hele wereld hebben decennialang de zuivering van menselijke eilandjes in een herbestemde celprocessor geadopteerd. Hoewel sommige eilandjeproductiefaciliteiten eilandjes nog steeds in een niet-gekoelde celprocessor verwerken, gebruikt de meeste centra een gekoelde versie van de celprocessor10,11,15. Centra plaatsen de celprocessor ofwel in een koude ruimte die het grote nadeel heeft van bloo...

Transplantatie van eilandjes voor ernstige type 1 diabetes kan de endogene insulinesecretie herstellen en is in een aantal landen de standaardzorg geworden1. Eilandje-isolatie is een meerfasenprocedure die warme enzymatische en mechanische vertering van de pancreas omvat, gevolgd door gekoelde fasen voor herstel van verteerd weefsel en eilandje-zuivering met continue of discontinue dichtheidsgradiënten op een celprocessor. Snel afkoelen vertraagt de enzymatische verteringsfase en beschermt eilandjes tegen spijsverteringsenzymen die worden vrijgegeven door verontreinigende acinar cellen. De celprocessor was oorspronkelijk ontworpen om cellulaire bloedcomponenten bij kamertemperatuur te scheiden2. In 1989 werd het hergebruikt om humane eilandjes van Langerhans te zuiveren3. Al drie decennia lang worden humane eilandjes gezuiverd voor klinische onderzoeken en, meer recent, voor de standaardzorg, hetzij in een celprocessor met discontinue gradiënten4 of continue dichtheidsgradiënten1 gemaakt met een gradiëntmaker1 of gelijkwaardige computergestuurde mixer5,6,7. Andere groepen hebben melding gemaakt van eilandje-zuivering van grote zoogdieren en mensen met behulp van grote cilindrische plastic flessen8,7,9, wat de effectiviteit van zuivering en eilandjeskwaliteit aanzienlijk heeft verbeterd.
Inderdaad, als we kijken naar de gouden standaard voor het zuiveren van humane eilandjes voor klinische transplantatie10,11, was de geproduceerde celprocessor zonder koeling. Als direct gevolg van het gebrek aan koeling, werden eilandjes blootgesteld aan toenemende temperaturen tijdens de zuiveringsstap. Tijdens centrifugatie treedt een ongecontroleerde temperatuurstijging op als gevolg van de mechanische wrijving van de rotor12,13. Celprocessors werden aangepast met een koelsysteem in eilandje-isolatiecentra dat statistisch glucose-geïnduceerde insulinesecretie en celviabiliteit verhoogde, wat het voordeel bevestigt van het houden van pancreaseilandjes op lage temperaturen tijdens de zuiveringsprocedure14,15.
Opgemerkt moet worden dat eind jaren tachtig 10 gekoelde prototypes werden gebouwd om eilandjesschade tijdens dichtheidsgradiëntzuivering te verminderen, maar deze kregen geen verdere aandacht. De prototypes van de celprocessor waren gebaseerd op spindel- en komkoeling met gekoeld polyethyleenglycol. In het bijzonder kunnen eilandje-zuiveringsoplossingen, inclusief orgaanbewaringsoplossingen en polysacharide dichtheidsgradiënten, schadelijk zijn voor eilandjesviabiliteit wanneer ze worden gebruikt bij of boven kamertemperatuur16,17,18. Een vergelijking van verschillende koelstrategieën van de celprocessor voor eilandjescelzuivering versus de originele niet-gekoelde celprocessor werd geëvalueerd om de ongecontroleerde temperatuurstijging die optreedt als gevolg van de wrijving van de rotor te bestrijden. Er zijn verschillende pogingen gedaan om de celprocessor af te koelen tijdens humane eilandje-zuivering. De celprocessor kan tijdelijk of permanent worden gehuisvest in een speciaal ontworpen koude ruimte om een temperatuur van 0-8 °C19 te handhaven tijdens de gradiëntcentrifugering die momenteel wordt gebruikt bij de eilandje-isolatiecentra aan de University of Illinois Chicago19, University of Miami14, University of Oxford faciliteiten15, en de University of San Francisco (de aangepaste koeleenheid omvat de celprocessor). Een andere aanpassing omvat kernkoeling van de celprocessorspindel met een koelsysteem met elektronisch gecontroleerde vloeibare stikstofkoeling in Genève, Zweden en de Tsjechische Republiek15,19. Een andere alternatief midden jaren 2000 was de kernkoeling van de celprocessor met een airconditioning-eenheid12 of door vloeistofkoeling van de as bij de University of Lille.
Koelmodificaties van de celprocessor zijn niet direct beschikbaar en brengen risico's met zich mee (luchtvochtigheid, ophoping van condensatie) in GMP-schoonruimomgevingen, inclusief verlies van garantie en weigering van de constructeur om de machine te onderhouden. Bijgevolg gebruiken sommige eilandjecentra, waaronder Milaan, Italië, Oslo, Noorwegen en Edinburgh, Schotland, geen koelsysteem voor celprocessors tijdens het eilandje-zuiveringsproces15.
Het huidige onderzoek is ontworpen om de effectiviteit van een nieuw ontwikkelde, gemakkelijk beschikbare koeler in combinatie met een minimaal aangepaste celprocessorsysteem te testen. Kort gezegd, de hier beschreven luchtgebaseerde koeler is een mechanisch gekoelde warmtewisselaar die de temperatuur van 1 standaard kubieke voet per minuut (SCFM) droog gas regelt tussen -40 °C tot -100 °C. Dit koelsysteem vereist een droge medische luchtvoorziening. De lucht stroomt door de lijn en warmtewisselaar en uit door de (7,9 mm) spuitmond. Een verwarming in de spuitmond levert warmte om de temperatuur van de luchtstroom te regelen. Een reserve deksel van massief plastic voor de centrifuge werd gekocht en er werden minimale aanpassingen gemaakt. Er werd een gat van 13,3 mm diameter in het deksel geboord en gekoelde lucht werd van de koelerspuitmond naar de celprocessor geleid via het gat in het centrifugedeksel. De gekoelde medische lucht werd met constante temperatuurregeling van de vloeistoffen of dichtheidsgradiënten in de centrifugeerkom van de celprocessor geïnjecteerd.
<p class="jove_content

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air particles counter</td><td>Lasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AirJet XR40&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>FTS system XR40</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>Circulating Cooling Chiller</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp;</td><td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conical Cooling Tray</td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>Double jacketed gradient maker&nbsp;</td><td>customized in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KJT-Thermocouple Thermometer</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI93551N</td><td>Voor het meten van de temperatuur van vloeistoffen</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&nbsp;</td><td>MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer&nbsp;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>Voor COBE-temperatuur</td></tr><tr><td>Waterless Bead Bath</td><td>Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td>Materials and reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD stem cell enumeration kit</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>344563</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2911 tubing kit</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tubes 250ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Gradient density 1.1</td><td>Biochrom&nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Graduated disposable bottles</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Human albumin 20%&nbsp;</td><td>Kedrion Biopharma&nbsp;</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 washing solution&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex tubes</td><td>Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>Medical Dry Air</td><td>Linde Healthcare</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Thermoprobe</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>Thermosensor</td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconsin Belzer (UW)&nbsp;</td><td>Bridge of Life&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>Conservatiemiddel</td></tr></tbody></table>

evaluatie van de impact van een nieuw koelcelprocessorsysteem op de faciliteit voor het isoleren van eilandjescellen

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

Standaard apparatuur voor celtherapie, inclusief de gouden standaard celprocessor om menselijke eilandjes te zuiveren voor klinische transplantatie, wordt zelden gekoeld, waardoor cellen mogelijk worden blootgesteld aan verhoogde temperaturen tijdens de centrifugeerstap. Aangepaste koelsystemen hebben een directe invloed op de levensvatbaarheid en functie van menselijke eilandjes. Het huidige onderzoek werd ontworpen om de effectiviteit van een nieuw ontwikkeld, gemakkelijk verkrijgbaar gekoeld celprocessorsysteem te testen dat minimale aanpassingen vereist, en om de invloed ervan op de levensvatbaarheid van menselijke cellen en het GMP-schoonmaakruimte-omgeving te evalueren. Het koelsysteem, een mechanisch gekoelde warmtewisselaar ingesteld op -30 °C, werd gebruikt om gekoelde medische kwaliteit droge lucht aan de celprocessorkom te leveren via een gat in de centrifugedeklaag. Met de beperkte beschikbaarheid van pancreasdonoren in Qatar, werd systeemvalidatie uitgevoerd met continue dichtheidsgradiëntzuivering van gepoolde menselijke beenmerg buffy coat. Steriliteit, turbulentie en deeltjestelling werden gemeten in klasse C en klasse B schone ruimte omgevingen. Er ontwikkelde zich geen turbulentie rond de gekoelde celprocessor en er werden geen overtollige 0,5 µm en 5 µm luchtpartikels gegenereerd volgens de GMP-normen van de schone ruimte. Aan het begin en het einde van de verzamelstappen steeg de temperatuur respectievelijk tot 21,50 °C ± 0,34 °C en 21,93 °C ± 0,20 °C in de niet-gekoelde celprocessor en tot slechts 10,9 °C ± 0,17 °C en 11,16 °C ± 0,35 °C in de gekoelde celprocessor (p <0,05). De gekoelde celprocessor leidde tot zowel verbeterde herstel (98%) van de mononucleaire celfractie als levensvatbaarheid (100% ± 2%) na verwerking. Het nieuwe koelsysteem vermindert effectief de warmte geproduceerd door de celprocessor zonder deeltjesimpact op de GMP-schoonmaakruimte omgeving. De hier beschreven gekoelde celprocessor is een goedkope ($16.000 zonder belastingen, douane en transport) en minimaal invasieve methode om robuuste koeling te bieden. Momenteel wordt deze technologie in de GMP-celtherapiefaciliteit toegepast op menselijke eilandjescelisolatie en -transplantatie voor het klinische programma.

De invloed van de gekoelde celprocessor op de GMP-kleine ruimte werd eerst gekwantificeerd. Gestandaardiseerde methoden maakten gebruik van een deeltjesteller om de luchtgedragen deeltjesverontreiniging te meten in een GMP-klasse C- en klasse B-schone ruimteomgeving op kritieke punten in de nabijheid van de celprocessor en het persluchtkoelsysteem. De resultaten toonden aan dat er geen turbulentie ontstond rond de apparatuur. De geregistreerde gegevens toonden aan dat er geen overschrijding was van 0,5 µm en 5 µm luchtge...

Het protocol hier beschrijft een aangepast koelcel-processorsysteem dat compatibel is met een schone ruimte met goede fabricagepraktijken (GMP) om de cellevensvatbaarheid na verwerking te verbeteren.

Evaluatie van de impact van een nieuw koelcelprocessorsysteem op de faciliteit voor het isoleren van eilandjescellen

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

evaluation-impact-new-cooling-cell-processor-system-on-islet-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes

Een microfluïdische eilandje perifusion apparaat werd ontwikkeld voor de beoordeling van dynamische insuline secretie van verschillende eilandjes en gelijktijdige fluorescentie beeldvorming van calcium influx en mitochondriale potentiële veranderingen.

Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device

Transplantatie van geïsoleerde eilandjes is voorgesteld om een ​​potentiële behandeling voor diabetes type 1 zijn. Hier beschrijven we een methode om de eilandjes van de muis pancreata isoleren en transplantatie ze aan de subcapsulaire ruimte van de nier.

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de aanschaf van een alvleesklier van varkens voor isolatie en zuivering van eilandjes.

Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Ole Isacson geeft een beknopt overzicht van de ziekte van Parkinson, de oorzaken ervan, therapeutische strategieën, en de vorderingen in het onderzoek van Parkinson.

Ole Isacson: ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de ziekte van Parkinson

Leer een gekoeld celprocessorsysteem voor het isoleren van humane mononucleaire buffy coat-cellen in een GMP-cleanroom. Deze methode verbetert celviabiliteit en herstel na centrifugatie voor klinische toepassingen.

Evaluatie van de impact van een nieuw koelcelprocessorsysteem op de faciliteit voor het isoleren van eilandjescellen

Meer video's verkennen