Name: Intracerebroventriculaire injecties uit de vrije hand bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Leer een snelle vrije-handtechniek voor intracerebroventriculaire injecties bij muizen zonder stereotaxisch apparaat. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neuroendocriene regulatie van voortplanting en hormoonafgifte onder stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Kellie Breen Church, de heer Michael Kreisman en mevrouw Jessica Jang bedanken voor hun bijdragen aan het verzamelen van de gegevens die in de representatieve resultaten worden getoond. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (RBM).

Alle procedures werden goedgekeurd door de Colorado State University (#3960) en de University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees, waar de representatieve gegevens werden verzameld (S13235, PI Kellie Breen Church). Gegevens van vijf volwassen vrouwelijke en twee volwassen mannelijke C57/BL6-muizen (9-16 weken oud) zijn weergegeven in de sectie representatieve gegevens. Vrouwelijke muizen werden 3-4 weken voorafgaand aan ICV-injectie en bloedafname ovariëctomie toegediend, zoals eerder beschreven7. Voorafgaand aan de experimenten werden deze muizen gehuisvest met een lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker en hadden ze vrije toegang tot voer en water in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Craniotomie uitvoeren
OPMERKING: Craniotomie kan een of meer dagen voorafgaand aan de eigenlijke injectie worden uitgevoerd, waardoor het injectieproces op de dag van het experiment sneller verloopt.
<ol><li>Bereid de materialen voor de craniotomie voor zoals hieronder beschreven.<ol><li>Leg een schone onderlegger of drapermateriaal op het werkoppervlak. Plak de neuskegel van een isofluraanverdamper op het werkoppervlak (dicht bij, maar van de onderzoeker af gericht; zie figuur 1A).</li>
		<li>Plaats silastic slang op het uiteinde van een steriele scherpe naald van 18 G zodat ~1 mm van de naaldpunt uitsteekt. Plaats silastic slangetjes op het uiteinde van een steriele stompe naald zodat ~1 mm van de naaldpunt uitsteekt. OPMERKING: Voor elke muis moeten afzonderlijke en steriele voorverpakte naalden (scherp en stomp) worden gebruikt.</li>
		<li>Verzamel een elektrisch scheerapparaat, jodiumscrub, steriel gaas en alcoholdoekjes om de injectieplaats voor te bereiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Oefen met het bewegen van een naald 2 mm lateraal en 1 mm caudaal zoals hieronder beschreven.<ol><li>Gebruik een liniaal en een pen om een vel papier te markeren met een beginpunt (dit is bregma), een markering 2 mm naar links of rechts en een andere markering 1 mm boven de laatste (dit is de injectieplaats; zie figuur 1B).</li>
		<li>Oefen met het verplaatsen van de naald van het startpunt naar markeringspunt 1 naar markeringspunt 2 (bregma naar injectieplaats) totdat u er zeker van bent dat de beweging herhaalbaar is zonder geleiders. OPMERKING: De hier beschreven coördinaten zijn effectief bij volwassen C57/BL6-muizen, maar andere stammen of leeftijdsgroepen kunnen aanpassing vereisen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de muis voor op craniotomie zoals hieronder beschreven.<ol><li>Plaats de muis in een inductiekamer en verdoven de muis met 3%-4% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit. Verkort met oefening en vertrouwdheid met de procedure de totale duur van blootstelling aan isofluraan tot minder dan 10 minuten voor de craniotomieprocedure. LET OP: Blootstelling aan isofluraan is gevaarlijk voor de menselijke gezondheid; Gebruik een goedgekeurde en geïnspecteerde isofluraanverdamper in een goed geventileerde ruimte met middelen om afvalgassen op te vangen.</li>
		<li>Zodra de teenreflex afwezig is, scheert u de kop van het dier. Breng oogsmeermiddel aan.</li>
		<li>Plaats de muis op het werkoppervlak met de kop in de neuskegel om de anesthesie te behouden.</li>
		<li>Dien een pijnstillend middel toe, zoals buprenorfine (0,6-0,8 mg/kg lichaamsgewicht van muizen, subcutaan), zoals voorgeschreven door de leverancier.</li>
		<li>Reinig de injectieplaats door het hoofd af te vegen met een steriel gaasje gedrenkt in een jodiumoplossing (voer drie scrubs uit) en veeg vervolgens af met een alcoholscrubpad (drie keer uitvoeren). OPMERKING: Verwijder de vacht en reinig de huid rond de injectieplaats en gebruik steriele instrumenten en naalden, zoals aanbevolen door de American Veterinary Medical Association om infecties te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Houd de kop van de muis stevig vast met de niet-dominante hand. Plaats de kop zo plat mogelijk op het werkoppervlak.</li>
	<li>Lokaliseer de plaats van de injectie.<ol><li>Gebruik de voorbereide scherpe naald van 18 G om eerst bregma te identificeren; Sleep hiervoor de naald over de huid van het hoofd langs de middellijn en beweeg in het rostral-caudale vlak. Stel je een gelijkzijdige driehoek voor waarin de twee hoekpunten de ogen zijn en het derde hoekpunt de geschatte locatie van bregma is (zie figuur 1C).</li>
		<li>Beweeg de naald vanuit bregma 2 mm lateraal en 1 mm caudaal naar de injectieplaats.</li>
	</ol></li>
	<li>Terwijl u de naald verticaal houdt, duwt u de naald stevig door de huid en het bot totdat de slang gelijk ligt met de huid.</li>
	<li>Trek de naald terug, draai de naald en druk opnieuw door de huid en het bot. Herhaal het proces totdat er een klein gaatje in het bot ontstaat.</li>
	<li>Gebruik de stompe naald om te controleren of er voldoende gat in het bot is gemaakt. Probeer een opening in het bot te maken die groot genoeg is om de stompe naald doorheen te laten.</li>
	<li>Haal de muis uit de neuskegel, verwijder al het bloed van de injectieplaats met steriel gaas en plaats de muis in een kooi op een kooiverwarmer totdat hij wakker is. Omdat de opening die door de craniotomie wordt gemaakt klein is (naald van 18 G), hoeft de plaats niet te worden afgesloten met een hechtdraad of wondclips. OPMERKING: De hier geproduceerde opening is klein (18 G), dus veel instellingen beschouwen deze procedure als een injectie in plaats van een operatie. Bovendien, hoewel er een opening door huid en bot naar de hersenen wordt gemaakt, resulteert het strak houden van de huid erin dat de gaten niet op één lijn liggen, wat waarschijnlijk helpt voorkomen dat huidflora of kooibedekking in contact komt met de hersenen.</li>
</ol>2. Het toedienen van de injectie
<ol><li>Bereid de materialen voor de injectie voor zoals hieronder beschreven.<ol><li>Leg een schone onderlegger of drapermateriaal op het werkoppervlak. Plak de neuskegel van een isofluraanverdamper op het werkoppervlak (dicht bij, maar van de onderzoeker af gericht; zie figuur 1A).</li>
		<li>Bevestig een 10 mm lange naald van 27 G met een afschuining van 45° op een glazen spuit van 5 μL. Plaats silastic slang op de naald zodat 3.5 mm van de naaldpunt uitsteekt; gebruik laboratoriumtape om de slang aan het lichaam van de spuit te bevestigen (zie afbeelding 1D).</li>
		<li>Bereid de injectiemedia (geneesmiddel, virus of andere vloeistof voor injectie) voor in een buisje. Voor de representatieve resultaten in deze studie werd steriele isotone zoutoplossing geïnjecteerd. OPMERKING: Kies een slang die toegankelijk is voor de glazen spuit en naald, zoals een microcentrifugebuis van 2 ml.</li>
		<li>Zuig 3 μL injectiemedia op in de glazen spuit. Zuig eerst meer op dan het gewenste volume en verwijder totdat er 3 μL in de spuit achterblijft.</li>
		<li>Verzamel jodiumscrub, steriel gaas en alcoholdoekjes om de injectieplaats voor te bereiden.</li>
		<li>Start een laboratoriumtimer in de optelmodus en plaats de timer zo dat deze zichtbaar is voor de onderzoeker tijdens het toedienen van injecties.</li>
		<li>Oefen met het bewegen van een naald 2 mm lateraal en 1 mm caudaal zoals de vorige dag is uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de muis voor op injectie zoals hieronder beschreven.<ol><li>Plaats de muis in de inductiekamer en verdoven de muis met isofluraan. Zodra de teenreflex afwezig is, brengt u oogsmeermiddel aan en plaatst u de muis op het werkoppervlak met het hoofd in de neuskegel.</li>
		<li>Reinig de injectieplaats met drie doekjes jodium en alcohol. Identificeer de injectieplaats met een naald van 18 G (of stompe naald) zoals beschreven in stap 1.8. Het gat dat tijdens de craniotomie is ontstaan, moet detecteerbaar zijn. OPMERKING: Als de craniotomie niet van tevoren is uitgevoerd, of als het gat in de schedel niet detecteerbaar is, kan de craniotomie hier worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de injectie uit met een glazen spuit zoals hieronder beschreven.<ol><li>Houd de kop van de muis stevig vast met de niet-dominante hand. Plaats de kop zo plat mogelijk op het werkoppervlak.</li>
		<li>Steek de naald van de glazen spuit door het gat in de schedel totdat het slangetje dat over de in stap 2.1.2 voorbereide naald is geplaatst, op de huid van de muis rust.</li>
		<li>Houd de spuit zo verticaal mogelijk en let daarbij op zowel het coronale als het sagittale vlak. Injecteer het medium langzaam gedurende een periode van 1 minuut.</li>
		<li>Houd de spuit en naald nog een minuut op hun plaats na voltooiing van de injectie om terugstroming tot een minimum te beperken. Trek de naald langzaam terug uit de kop van de muis.</li>
		<li>Haal de muis uit de neuskegel, verwijder eventueel bloed van de injectieplaats met steriel gaasje (als dat aanwezig is) en plaats de muis in een kooi op een kooiverwarmer totdat hij wakker is.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bevestiging van de injectieplaats
<ol><li>Verdoof en doordrenk de muis diep met zoutoplossing en 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zoals eerder beschreven8. Bewaar de hersenen in 30% sucrose in PBS bij 4 °C totdat de hersenen zinken (meestal 2 dagen).</li>
	<li>Snijd coronale secties van 20-50 μm op een cryostaat zoals eerder beschreven9. Observeer tijdens het doorsnijden het injectiekanaal in het weefselblok. Noteer of het injectiekanaal duidelijk de laterale ventrikel snijdt.</li>
</ol>

Intracerebroventriculaire injectie uitvoeren bij muizen met behulp van een benadering uit de vrije hand

<ol><li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).</li>
<li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4%28%2B%29+T+cells+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).</li>
<li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity%2C+oncostreams%2C+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).</li>
<li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li>
<li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin%27s+central+effects+on+feeding+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li>
<li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li>
<li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding%2C+body+weight+regulation%2C+and+reproduction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt een eenvoudige en effectieve manier beschreven voor het maken van ICV-injecties bij muizen. Aangezien deze techniek geen stereotaxisch frame vereist, is deze aanpak voor de centrale toediening van medicijnen en experimentele middelen toegankelijk voor meer onderzoekers. Bovendien heeft deze aanpak een relatief hoge doorvoer, omdat de voorbereidings- en injectieprocedure snel kan worden uitgevoerd.
Aangezien deze procedure de manipulatie van naalden en een glazen spuit met de hand vereist met behulp van geschatte afstanden, wordt geadviseerd dat de nieuwe beoefenaar enige tijd besteedt aan het oefenen van de bewegingen voordat hij met levende dieren gaat werken. Bovendien kunnen muizenkadavers nuttig zijn om te oefenen met het identificeren van bregma met de naald. Als er eenmaal enig vertrouwen in de beweging is gewonnen, is ervaring met toegewijde levende oefendieren nuttig. Tijdens de oefensessies maakt de injectie van 3 μL Oost-Indische inkt de visuele beoordeling van de injectieplaats gemakkelijker. Correct geplaatste injecties zullen resulteren in zwarte kleuring in de ipsilaterale laterale ventrikel en vaak in de derde ventrikel en contralaterale laterale ventrikel. Injectie van inkt is een terminale procedure en muizen mogen niet herstellen van anesthesie na inktinjectie. Zelfs ervaren beoefenaars kunnen er baat bij hebben om de zijwaartse beweging van 2 mm en de caudale beweging van 1 mm een paar keer te oefenen voordat ze een injectie geven. Daarnaast is het belangrijk om de glazen spuit verticaal te houden wanneer deze in de hersenen wordt geplaatst. Met oefening kan worden verwacht dat >75% van de injecties correct wordt geplaatst. Door de naald ~1 minuut op zijn plaats te houden nadat het volledige volume is geïnjecteerd, kan worden voorkomen dat de vloeistof uit de hersenen terugstroomt. Gedurende deze tijd is het essentieel om de naald in de juiste positie te houden zonder te bewegen. De succesvolle uitvoering van deze procedure vereist ervaring met het betrouwbaar manipuleren en vasthouden van de naald en de glazen spuit.
Als sommige injecties niet correct zijn geplaatst, zijn er verschillende opties om problemen op te lossen. Controleer eerst of de injectienaald recht (niet gebogen) is en of de naald stevig op de glazen spuit is bevestigd. Vervolgens, als de gemiste injecties variabel zijn in hun locatie, is extra oefening in het manipuleren en vasthouden van de glazen spuit gerechtvaardigd. Het kan ook nuttig zijn om een extra persoon te hebben om te zien of de spuit tijdens de injectie verticaal wordt gehouden. Het vinden van bregma over intacte huid met de naald vereist ook oefening. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de tijd te nemen om dit herkenningspunt met vertrouwen te identificeren voordat u doorgaat met de injectie. Als injecties consequent op een verkeerde locatie worden geplaatst, is het nodig om de injectiecoördinaten te wijzigen. De hier beschreven coördinaten (±2 mm lateraal, 1 mm caudaal tot bregma) zijn effectief bij volwassen C57/BL6-muizen, maar deze coördinaten moeten mogelijk worden aangepast voor andere stammen of leeftijdsgroepen.
Hoewel deze techniek zeer effectief kan zijn bij het snel centraal leveren van agenten, zijn er enkele beperkingen. Omdat de zuiger van de spuit met de hand wordt bewogen, kan de injectiesnelheid variabel zijn. Het wordt geadviseerd om het relatief langzaam te injecteren om mogelijke off-target effecten van druk in het ventriculaire systeem te voorkomen. In dit protocol wordt een injectievolume van 3 μL aanbevolen; in andere laboratoria is echter een groter injectievolume (5 μL) gebruikt11. Afhankelijk van het gemeten resultaat moeten het injectievolume en de injectiesnelheid mogelijk worden aangepast. Jonge muizen tolereren bijvoorbeeld alleen kleinere injectievolumes. Daarom worden voorbereidende experimenten aanbevolen om te testen op effecten op het medium. Een bijkomende beperking is dat de bevestiging van de juiste plaatsing van de injectie beperkt is tot een enigszins subjectieve beoordeling van het injectiekanaal nadat het weefsel is afgenomen. Het injectiekanaal is zichtbaar in zowel vers ingevroren als met paraformaldehyde doorbloed weefsel dat enkele uren na de ICV-injectie is verzameld (zie afbeeldingen in representatieve resultaten). Als er meerdere injecties worden gegeven, is het mogelijk dat aan de hand van de kanaalmarkeringen niet duidelijk is of elke injectie met succes is geplaatst.
Deze benadering uit de vrije hand voor het maken van ICV-injecties vereist anesthesie. Met oefening kunnen de injecties snel worden toegediend, wat resulteert in een korte (3-5 min) blootstelling aan de verdoving. Door het scheren van de kop van de muis en het uitvoeren van de craniotomie (het doorboren van de schedel met een scherpe naald) voorafgaand aan de experimentele dag, kan de tijd onder narcose tijdens het experiment worden verkort. Muizen herstellen meestal binnen enkele minuten volledig van deze korte blootstelling aan anesthesie. Het verzamelen van bloedmonsters onmiddellijk na de anesthesie kan een uitdaging zijn, dus de bemonstering kan ~30 minuten na de injectie worden opgeschort om stress bij de muizen te minimaliseren, hoewel dit niet strikt noodzakelijk is. Andere laboratoria hebben ook met succes veranderingen in LH-secretie gemeten (eenmalige monsters) 30 minuten na de toediening van farmacologische middelen met behulp van deze ICV-techniek uit de vrije hand 1,12. Veranderingen in het bewegings- en inslikkende gedrag gedurende een periode van 24 uur zijn ook gedetecteerd na ICV-injecties13, zodat monitoring op lange termijn kan worden uitgevoerd. Het wordt aanbevolen om voorbereidende tests uit te voeren om het gemak van bemonstering en de mogelijke effecten van anesthesie op interessante resultaten te bepalen.
Samengevat is de ICV-injectietechniek uit de vrije hand die hier wordt beschreven een eenvoudige maar krachtige methode om experimentele middelen in de hersenen af te leveren. De specifieke voordelen zijn dat de aanpak snel en technisch eenvoudig is en een hoog percentage succesvol geplaatste injecties mogelijk maakt. Bovendien, aangezien deze techniek slechts een korte blootstelling aan anesthesie vereist, kan deze worden gecombineerd met een verscheidenheid aan andere technieken, zoals frequente bloedafname, manipulatie van het neurale circuit of in vivo opname om neuro-endocriene processen te onderzoeken.

De afgifte van experimentele middelen, zoals geneesmiddelen1, virussen2 of cellen3, aan de hersenen is vaak nodig voor neuro-endocrien onderzoek. Als het middel niet gemakkelijk de bloed-hersenbarrière passeert of als het experimentele doel is om specifiek de centrale effecten van het middel te testen, is het belangrijk om een betrouwbare methode te hebben voor het toedienen van injecties in de hersenen. Bovendien biedt injectie in de intracerebroventriculaire (ICV) ruimte de mogelijkheid om het middel op grote schaal in de hersenen te verspreiden en biedt het een groot doelgebied, waardoor de kans op een succesvolle injectie toeneemt2. 
Een veelgebruikte methode voor het maken van ICV-injecties is het plaatsen van een permanente verblijfscanule. Bij deze aanpak is een stereotaxisch frame nodig om de in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte canule te positioneren, aangezien de canule op zijn plaats wordt gelijmd of gecementeerd. Vaak wordt bij herstel een suprafysiologische dosis angiotensine II via de canule toegediend en als het drinkgedrag onmiddellijk wordt waargenomen, wordt de canule als correct geplaatstbeschouwd 4. Deze aanpak heeft veel voordelen, waaronder de mogelijkheid om langdurige infusie uit te voeren en de mogelijkheid om hetzelfde dier meerdere keren te injecteren; bovendien, als angiotensine II wordt gebruikt, kan de juiste plaatsing worden bevestigd voorafgaand aan de toediening van experimentele verbindingen. Er zijn echter enkele beperkingen aan het plaatsen van een permanente canule, waaronder de vereiste voor dure apparatuur (stereotaxisch frame), de mogelijkheid van beschadiging van de canule na plaatsing (muizen kunnen bijvoorbeeld op de canule van een kooigenoot kauwen) en de mogelijkheid van infecties rond de permanente canule. Enkelvoudige ICV-injecties kunnen worden gemaakt met behulp van een stereotaxisch frame3, dat, hoewel effectief, aanzienlijke blootstelling aan anesthesie vereist en dus enkele acute fysiologische en gedragseffecten van de behandeling kan verdoezelen. Bovendien vereist de plaatsing van muizen in een stereotaxisch frame een aanzienlijke training om een stabiele plaatsing te bereiken en het scheuren van de gehoorgangen te voorkomen.
Hier wordt een gevestigde methode beschreven voor het maken van injecties uit de vrije hand bij muizen. Deze methode is gebaseerd op eerdere rapporten 5,6. De voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig en snel is en dat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is, zoals een stereotaxisch frame. Zoals hieronder beschreven, omvat deze procedure het manipuleren van een glazen spuit ten opzichte van oriëntatiepunten op het hoofd van de muis om de injecties uit te voeren, wat snel kan worden gedaan en dus slechts enkele minuten gasanesthesie op de experimentele dag vereist.

<table><tbody><tr><td>18-gauge blunt needles</td><td>SAI Infusion</td><td>B18-150</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needles</td><td>BD Medical</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Bench pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62AC22</td><td></td></tr><tr><td>Betadine solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-892-5235</td><td>Gebrekstof</td></tr><tr><td>Eyelube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Injection needle</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45</td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;&nbsp;</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-893-8441</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer</td><td>Vet Equip</td><td>V-10</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Tape</td><td>VWR</td><td>89098-128</td><td></td></tr><tr><td>Medical grade oxygen</td><td>Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Millipore-Sigma</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>J67802.K2</td><td></td></tr><tr><td>PulsaR Software</td><td>Open source, University of Otago</td><td></td><td>Zie ref 9</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-00-152</td><td></td></tr><tr><td>Silastic tubing (0.040" I.D.)</td><td>DOW</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>Silastic tubing (0.078" I.D.)</td><td>DOW</td><td>508-009</td><td></td></tr><tr><td>Sterile saline</td><td>VWR</td><td>101320-574</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventriculaire injecties uit de vrije hand bij muizen

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

Het onderzoek van neuro-endocriene systemen vereist vaak de toediening van medicijnen, virussen of andere experimentele middelen rechtstreeks in de hersenen van muizen. Een intracerebroventriculaire (ICV) injectie maakt de wijdverspreide afgifte van het experimentele middel door de hersenen mogelijk (met name in de structuren nabij de ventrikels). Hier worden methoden beschreven voor het maken van ICV-injecties uit de vrije hand bij volwassen muizen. Door gebruik te maken van visuele en tactiele oriëntatiepunten op de hoofden van muizen, kunnen injecties in de laterale ventrikels snel en betrouwbaar worden uitgevoerd. De injecties worden toegediend met een glazen spuit die in de hand van de onderzoeker wordt gehouden en op ongeveer afstand van de oriëntatiepunten wordt geplaatst. Voor deze techniek is dus geen stereotaxisch frame nodig. Bovendien vereist deze techniek slechts een korte isofluraananesthesie, waardoor het gedrag en/of de fysiologie van muizen bij wakkere, zich vrij gedragende muizen achteraf kunnen worden beoordeeld. ICV-injectie uit de vrije hand is een krachtig hulpmiddel voor de efficiënte afgifte van experimentele middelen in de hersenen van levende muizen en kan worden gecombineerd met andere technieken zoals frequente bloedafname, neurale circuitmanipulatie of in vivo opname om neuro-endocriene processen te onderzoeken.

Wanneer deze techniek met succes wordt uitgevoerd, maakt het mogelijk om een experimenteel middel snel in het ventriculaire systeem af te geven. Een luteïniserend hormoon (LH) pulsprofiel van een ovariëctomie van een ovariëctomie die een ICV-injectie van 3 μL steriele isotone zoutoplossing kreeg, het vehikel voor veel farmacologische verbindingen, wordt weergegeven in figuur 2A. Dit voorbeeld toont aan dat korte blootstelling aan gasanesthesie en de injectie van 3 μL vloeistof in het ventriculaire systeem alleen de pulserende LH-secretie niet veranderden. 3 uur na de ICV-injectie werd het dier geëuthanaseerd en werd vers ingevroren neuraal weefsel verzameld en op een cryostaat gesneden; Het injectiekanaal kruiste duidelijk het laterale ventrikel. Het injectiekanaal was ook zichtbaar in neuraal weefsel van muizen geperfundeerd met fixeermiddel (10 ml gehepariniseerde zoutoplossing gevolgd door 20 ml 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer). Voorbeelden van correct geplaatste injecties worden weergegeven in figuur 2B. Twee voorbeelden van verkeerd geplaatste injecties zijn weergegeven in figuur 2C. Voorbeelden van correct (links) en verkeerd geplaatste injecties met Oost-Indische inkt zijn weergegeven in figuur 2D. De injectie van Oost-Indische inkt is nuttig voor het oefenen van deze techniek, omdat het een duidelijke visualisatie van de injectielocatie mogelijk maakt. De stroom van kleurstof in zowel de laterale ventrikels als de derde ventrikel is te zien in correct geplaatste injecties (Figuur 2D, links).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig01.jpg"> Figuur 1: Afbeeldingen van de voorbereiding van de apparatuur en de injectiecoördinaten voor ICV-injecties uit de vrije hand. (A) Configuratie van het werkstation voor ICV-injecties uit de vrije hand. (B) Schema voor het oefenen van de beweging die nodig is om de ICV-injectie te plaatsen bij vrouwelijke C57/BL6-muizen van 3-4 maanden oud. (C) Geschatte locatie van bregma bij volwassen muizen. (D) Plaatsing van de slang om 3,5 mm van de punt van de naald voor de injectie te onthullen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve luteïniserend hormoon en histologiegegevens met betrekking tot ICV-injecties uit de vrije hand. (A) LH-polsprofiel voor en na de ICV-injectie. De datapunten met effen zwarte vulling vertegenwoordigen pulsen zoals bepaald met behulp van een herformulering van PULSAR10 met de parameters die in die referentie worden voorgesteld voor een OVX-muis en een detectieniveau van 0,32 ng/ml. (B) Foto's van een coronaal deel van de hersenen van muizen met een correct geplaatste ICV-injectie. (C) Foto's van een coronaal deel van de hersenen van muizen met een verkeerd geplaatste ICV-injectie: een injectiekanaal lateraal van het ventrikel (links) en een injectiekanaal dorsaal van het ventrikel (rechts). (D) Foto's van een coronaal deel van de hersenen van muizen met een correct geplaatste ICV-injectie met Oost-Indische inkt (links) en een verkeerd geplaatste ICV-injectie met Oost-Indische inkt (rechts). Opmerking: panelen B en C tonen met paraformaldehyde doordrenkte hersenen die 3 uur na injectie van zoutoplossing zijn verzameld; paneel D toont verse hersenen verzameld op droogijs 2 minuten na de injectie van Oost-Indische inkt. Schaalbalk = 1 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Hier wordt een eenvoudige en snelle aanpak beschreven voor het uitvoeren van intracerebroventriculaire injecties bij muizen met behulp van een benadering uit de vrije hand (dat wil zeggen zonder stereotaxisch apparaat).

Intracerebroventriculaire injecties uit de vrije hand bij muizen

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

We zijn geïnteresseerd in de neurale controle van de voortplantingsfunctie, met name hoe de hersenen de afgifte van hormonen reguleren die de geslachtsklieren regelen, zowel in gezonde omstandigheden als als reactie op stress. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig en snel is. Het afleveren van medicijnen in het laterale ventrikel is een geweldige manier om een breed net uit te werpen bij het testen van een signaalroute ter ondersteuning van meer gedetailleerde vervolgexperimenten.Er valt nog veel te leren over de neuro-endocriene controle van de voortplanting, inclusief de moleculaire mechanismen voor het genereren van luteïniserende hormoonpulsen, mechanismen voor het moduleren van de pulsfrequentie tijdens stress en het genereren van de pre-ovulatoire LH-piek. In de toekomst zijn we vooral geïnteresseerd in het integreren van ongelijksoortige bevindingen in modellen.

free-hand-intracerebroventricular-injections-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De autoloog bloed injectie model van intracerebrale bloeding bij muizen beschreven in dit protocol maakt gebruik van de dubbele injectietechniek te minimaliseren het risico van het bloed reflux tot de naald baan, geen anticoagulantia in het pompsysteem, en elimineert alle dode ruimte en uitbreidbaar slangen in het systeem.

Autoloog bloed injectie tot spontane intracerebrale bloeding in Muizen Model

Dit artikel legt uit twee zeer verschillende methoden voor injectie: 1) in de hersenen (intracerebroventriculaire) en 2) systemische (intraveneus) op de therapeutische middelen te introduceren in het centrale zenuwstelsel van neonatale muizen.

Levering van therapeutische middelen door intracerebroventriculaire (ICV) en intraveneuze (IV) injectie in Muizen

This video demonstrates ommaya mediated intracerebroventricular injection in a mouse model. The method enables localized delivery of potential drug candidates and evades the blood-brain barrier.

Intracerebroventricular Injection in Mouse: An Ommaya Mediated Direct Drug Administration Method to Deliver Drugs to Cerebral Ventricles of Mouse Brain

Source: Li, D., et al. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for the intrathecal injection of adeno-associated viruses (AAV) into the cerebrospinal fluid (CSF) of an awake mouse, covering syringe preparation, spinal alignment, and precise needle insertion. This method validates targeted gene delivery, supporting its potential for CNS therapies.

Intrathecal Delivery of Viruses in a Mouse Model for Treating Central Nervous System Diseases

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Diermodellen van pediatrische ziekte vroeg begin en agressieve ziekteprogressie ervaren. Klinisch relevante afgifte van therapie aan jonge muismodellen kan zijn technisch moeilijk. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve werkwijze voor intraveneuze injectie pasgeboren muizen binnen de eerste twee dagen postnatale leven.

Intraveneuze injecties in pasgeboren muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor intracerebroventriculaire en intravasculaire injectie van virale deeltjes of fluorescente microbeads in de neonatale muizenhersenen. Het lokalisatiepatroon van het virus en de nanodeeltjes kan worden gedetecteerd door microscopische evaluatie of door in situ hybridisatie.

Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain

Hier beschrijven we een protocol voor microinjection in de knaagdier hersenen die gebruikmaakt van kwarts naalden. Deze naalden niet produceren detecteerbare weefselschade en zorgen voor betrouwbare levering zelfs in diepe regio's. Bovendien, zij kunnen worden aangepast aan de behoefte aan onderzoek door gepersonaliseerde designs en opnieuw kunnen worden gebruikt.

Gepersonaliseerde naalden voor Microinjections in de hersenen knaagdier

Van de darm afgeleide microbiële metabolieten hebben veelzijdige effecten die leiden tot complex gedrag bij dieren. We streven ernaar om een stapsgewijze methode te bieden om de effecten van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in de hersenen af te bakenen via intracerebroventriculaire toediening via een gidscanule.

Intracerebroventriculaire toediening van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Polyglutamine spinocerebellaire ataxieën worden veroorzaakt door CAG-expansies die aggregatiegevoelige eiwitten produceren. Dit protocol beschrijft vectorproductie, stereotaxische toediening en analyse van inclusies en verlies van neuronale markers, en biedt een gecontroleerd platform om mechanismen te onderzoeken en gerichte therapieën voor neurodegeneratieve ziekten te evalueren.

Lentiviraal-geïnduceerde striatale pathologie als preklinisch model van polyglutamine spinocerebellaire ataxie

Leer een snelle vrije-handtechniek voor intracerebroventriculaire injecties bij muizen zonder stereotaxisch apparaat. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neuroendocriene regulatie van voortplanting en hormoonafgifte onder stress.

Intracerebroventriculaire injecties uit de vrije hand bij muizen

Meer video's verkennen