Name: Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Ontdek een geoptimaliseerde methode voor gemengde neuronale en gliale celculturen uit embryonale muizenhersenen. Dit protocol vermindert dierproeven en ondersteunt onderzoek naar aangeboren immuniteit en virale infecties in het centrale zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de leden van de Edgar- en Linington-laboratoria bedanken, in het bijzonder prof. Chris Linington, dr. Diana Arseni en dr. Katja Muecklisch, voor hun advies, nuttige opmerkingen en hulp bij het voeden van de culturen terwijl we deze culturen opzetten. Speciale dank gaat uit naar Dr. Muecklisch voor het leveren van de uitgangspunten voor de Cell Profiler-pijplijnen. Dit werk werd ondersteund door de MS Society (subsidie 122) en de Yuri en Lorna Chernajovsky stichting aan MP; Financiering van de Universiteit van Glasgow aan JC en MP; en Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) en Medical Research Council (MRV0109721) aan GJG.

Alle dierproeven voldeden aan de lokale wetten en richtlijnen voor diergebruik en werden goedgekeurd door de lokale ethische beoordelingscommissie van de Universiteit van Glasgow. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de UK Animals Scientific Procedures Act 1986, onder auspiciën van een UK Home Office Project License. Voor deze studie werden in-house gefokte volwassen C57BL/6J muizen gebruikt. Het gebruik van jonge vrouwen (8-12 weken) wordt aanbevolen vanwege het hogere slagingspercentage van de zwangerschap; Mannetjes kunnen worden hergebruikt voor meerdere fokrondes. Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de beschreven methode om gemengde neuronale en gliale culturen te genereren.
1. Bereiding van de verbruiksartikelen voor weefselkweek
<ol><li>Bereid de borden en/of schalen met microscopie coverslips in een klasse 2 veiligheidskast. Steriliseer alle reagentia of autoclaaf om steriliteit tijdens de kweekperiode te garanderen.</li>
	<li>Voeg het juiste volume BA-PLL (13,2 μg/ml poly-L-lysinehydrobromide [PLL] in boorzuurbuffer [BA] [50 mM boorzuur, 12,5 mM natriumtetraboraat, pH 8,5]; zie materiaaltabel) toe aan elke put (1.000 μl/put in een plaat met 6 putten, 100 μl/put in een plaat met 96 putten; de volumes zijn samengevat in tabel 1). Voeg voor microscopie coverslips 20 ml BA-PLL toe aan een weefselkweekschaal met een diameter van 9 cm met 200 steriele coverslips en draai om gelijkmatig te verdelen.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 uur.</li>
	<li>Verwijder de BA-PLL-oplossing uit elke put of schaal met microscopie-afdekzeilen en was door 20 ml steriel water toe te voegen, de dekzeilen te draaien en vervolgens het water te verwijderen. Herhaal deze wasstap drie keer. Voor een schaal met coverslips, laat u steriel water in de weefselkweekschaal op de laatste wasbeurt om de coverslips gemakkelijk te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder zoveel mogelijk vloeistof met een steriele pipet en laat minstens 2 uur tot een nacht drogen.</li>
	<li>Bewaar de gecoate platen bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden. OPMERKING: Het bereide boorzuur met poly-l-lysine (BA-PLL) oplossing kan tot drie keer worden hergebruikt, waarbij elke keer nieuwe PLL wordt toegevoegd. Bewaar de BA-PLL bij 4 °C. Gerechten worden behandeld met BA-PLL, omdat de PLL de cellen laat plakken en groeien. Zonder deze behandeling zullen de cellen na ongeveer 1 week kweek optillen en niet meer kunnen differentiëren.</li>
</ol>2. Dissectie van E17 embryonale hersenen
<ol><li>Co-house een of meerdere vrouwelijke muizen met een mannelijke muis. Controleer de vrouwtjes dagelijks op een slijmprop, wat aangeeft dat er paring heeft plaatsgevonden. OPMERKING: Alle "aangesloten" vrouwelijke muizen moeten van het mannetje worden gescheiden om de juiste startdatum van de dracht te garanderen. Muizen kunnen worden gewogen om de zwangerschap te bevestigen of visueel worden gecontroleerd.</li>
	<li>Ruim de zwangere muis op E17 met behulp van geschikte methoden in overeenstemming met de lokale richtlijnen en wetten voor dierenwelzijn, bijvoorbeeld door de kooldioxideconcentratie (CO2) te verhogen, een dodelijke overdosis anestheticum of dislocatie van de nek. OPMERKING: De gekozen methode mag de embryo's niet verstoren. Voor deze studie werd blootstelling aan een stijgende concentratie koolstofdioxidegas gevolgd door bevestiging van de dood door het doorsnijden van de dijbeenslagader gebruikt om zwangere moederdieren te ruimen.</li>
	<li>Plaats de geruimde, zwangere muis op zijn rug op een snijbord; Hoewel het vastpinnen niet nodig is, kan het het voor onervaren onderzoekers gemakkelijker maken. Knijp met een tang in de middellijn van de buik. Knip met een scherpe schaar de buik open door de huid en het peritoneum over de middellijn van de genitaliën naar de ribbenkast, waarbij u voorzichtig bent om de baarmoeder niet te doorboren.<ol><li>De baarmoeder van de muis heeft twee hoorns, die elk meestal één tot vijf embryo's bevatten. Verwijder de baarmoeder met de embryo's van de moeder en plaats deze onmiddellijk op ijs.</li>
	</ol></li>
	<li>Snijd door de dooierzak aan de zijkant van de placenta's, zorg ervoor dat u de embryo's niet beschadigt en verwijder de embryo's uit hun dooierzak.</li>
	<li>Onthoofd de embryo's onmiddellijk. Voeg de onthoofde koppen toe aan een schaal met Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium (Ca 2+) en magnesium (Mg2+) (HBSS-/-) op ijs. OPMERKING: Als genotypering vereist is, kan men de staart in dit stadium verwijderen voor genetische analyse. Wanneer meerdere genotypen worden verwacht, moeten de koppen van elk embryo apart worden gehouden voor het kweken.</li>
	<li>Plaats met een schuine tang het hoofd op zijn kant naar links.</li>
	<li>Doorboor het oog met de ene rand van de tang en houd de kin stevig vast met de andere.</li>
	<li>Begin bij de nek en scheur de huid van de hoofdhuid voorzichtig langs de middellijn naar de punt van de snuit.</li>
	<li>Als je door het ruggenmerg binnenkomt, merkbaar als een witte ovaal, gebruik je de schuine tang om de schedel langs de middellijn open te breken, waardoor de hersenen worden blootgesteld.</li>
	<li>Pel de schedel voorzichtig weg aan de kant die naar boven is gericht, waardoor de hersenen worden blootgesteld.</li>
	<li>Til de hersenen uit de schedel en gooi de schedel weg zodra de hersenen volledig zijn verwijderd.</li>
	<li>Verwijder met behulp van de tang de hersenvliezen, die merkbaar zijn als een dun membraan met dichte bloedvaten.</li>
	<li>Plaats de hersenen in een bijou (zie Tabel van Materialen) met daarin 2 ml HBSS-/- op ijs.</li>
	<li>Herhaal stap 2.6 tot 2.13 met de resterende hersenen, waarbij je maximaal vier hersenen per bijou optelt.</li>
	<li>Voeg 250 μL 10x trypsine toe aan de bijou en trituleer de hersenen door de bijou te schudden. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. OPMERKING: Alle stappen vanaf dit punt moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweekkap.</li>
	<li>Ontdooi 2 ml soja-trypsine (SD)-remmer (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml trypsineremmer uit sojabonen, 40 μg/ml DNase I, 3 mg/ml runderserumalbumine [BSA]-fractie V; zie materiaaltabel) van -20 °C door deze bij 37 °C te plaatsen.</li>
	<li>Voeg 2 ml SD-remmer toe aan elke bijou bevattende hersenen (per bijou met maximaal vier hersenen), schud de bijou opnieuw om deze gelijkmatig te verspreiden. OPMERKING: SD-remmer vermindert de trypsine-activiteit om onnodige vertering van de monsters te voorkomen en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.</li>
	<li>Verwijder zonder centrifugatie 2 ml van het supernatant uit elke bijou en breng het over in een centrifugebuis van 15 ml, waarbij u voorzichtig moet zijn om geen celklonten over te brengen.</li>
	<li>Trituleer de resterende cellen in de bijou met een naald van 19 G bevestigd aan een spuit van 5 ml door de suspensie tweemaal aan te zuigen. Hierdoor ontstaat een dik slijmachtig mengsel.<ol><li>Herhaal dit nog twee keer met een naald van 21 G. Als er klontjes overblijven, trituleer dan nogmaals met de naald van 21 G.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de cellen van de bijou over naar dezelfde centrifugebuis van 15 ml (uit stap 2.18) met behulp van een naald van 23 G.</li>
	<li>Centrifugeer op 200 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder al het supernatant met behulp van een serologische pipet van 5 ml en breng het over naar een andere centrifugebuis van 15 ml, waarbij u voorzichtig moet zijn om de losse pellet aan de onderkant met de vereiste cellen niet te verstoren.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatant opnieuw op 200 x g bij RT gedurende 5 minuten. OPMERKING: Deze stap is niet essentieel, maar als men veel cellen nodig heeft of weinig embryo's heeft, kan men deze stap uitvoeren om zoveel mogelijk cellen van het supernatant te herstellen.</li>
	<li>Gebruik 10 ml plating media (PM) (49% Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium [DMEM], 1% penicilline/streptomycine [Pen/Strep], 25% paardenserum, 25% HBSS met Ca 2+ en Mg2 + [HBSS+ /+]; zie Materiaaltabel), combineer en resuspensie van de twee pellets samen om een hele celsuspensie te creëren.</li>
	<li>Tel de cellen met trypan blauw en een hemocytometer of digitale celteller en verdun de celsuspensie met PM tot een concentratie van 1,8 x 106 cellen / ml.</li>
</ol>3. De cellen plateren
<ol><li>Voeg het vereiste volume van de celsuspensie toe aan het vereiste formaat zoals beschreven in tabel 1: 1.000 μL per put in 6-well-formaat, 50 μL per put in 96-well-formaat of 100 μL per coverslip.</li>
	<li>Incubeer gedurende 2-4 uur bij 37 °C met 5%-7% CO2. Controleer of de cellen zich hebben vastgehecht met behulp van een omgekeerde microscoop.</li>
	<li>Verwijder de media en vul aan met nieuwe differentiatiemedia (DM+: DM- inclusief 10 μg/ml insuline. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hydrocortison, 10 ng/ml biotine, 2,5 ml 100x N1 mediasupplement; zie Materiaaltabel). De volumes zijn opgenomen in tabel 1. Druk eventuele zwevende coverslips naar beneden met behulp van een steriele pipetpunt.</li>
</ol>4. Behoud van de culturen
OPMERKING: Deze culturen moeten driemaal per week worden gevoerd om optimale groei en differentiatie te ondersteunen. De culturen zullen een optimale gezondheid en rijpheid bereiken voor experimenten op DIV (dagen in vitro) 21. Cellen kunnen tot 28 dagen in cultuur worden gehouden, waarna de culturen snel degenereren.
<ol><li>Vervang drie keer per week tot DIV12 een deel van het supernatant door vers DM+ door 500 μL per put in 6-well-formaat, 50 μL per put in 96-well-formaat, of 500 μL per gerecht met drie coverslips, te verwijderen en 600 μL per put toe te voegen in 6-well-formaat, 60 μL per put in 96-well-formaat, of 600 μL per afdekplaat (tabel 1).</li>
	<li>Vervang vanaf DIV13 drie keer per week een deel van het supernatant door vers DM- door 500 μL per put in 6-well-formaat te verwijderen, 50 μL per put in 96-well-formaat, of 500 μL per gerecht met drie coverslips, en 600 μL per put toe te voegen in 6-well-formaat, 60 μL per put in 96-well-formaat, of 600 μL per afdekplaat (tabel 1).</li>
</ol>

Embryonale muizenhersenen gemengde celculturen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

<ol><li>Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKovacs%2C+GG+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22">Handbook of Clinical Neurology</a>. 145, Elsevier. 13-23 (2018).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Techniques%22">The Principles of Humane Experimental Techniques</a>. 1, Methuen. (1959).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Thomson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synapsing+cultures+of+murine+spinal+cord-validation+as+an+in+vitro+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system.</a> The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).</li>
<li>Bijland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+studying+CNS+white+matter%3A+Functional+properties+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches.</a> F1000Research. 8, 117(2019).</li>
<li>Fragkoudis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+and+oligodendrocytes+in+the+mouse+brain+differ+in+their+ability+to+replicate+Semliki+Forest+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurovirology%22%5BJournal%5D)">Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus.</a> Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).</li>
<li>Hayden, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-specific+IgMs+induce+antiviral+responses+in+the+CNS%3A+Implications+for+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).</li>
<li>Kantzer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-ACSA-2+defines+a+novel+monoclonal+antibody+for+prospective+isolation+of+living+neonatal+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes.</a> Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).</li>
<li>Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+CNS+homeostasis%2C+autoimmunity%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer.</a> Journal of Immunology Research. 2017, (2017).</li>
<li>Gee, J. R., Keller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+Regulation+of+brain+homeostasis+via+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).</li>
<li>Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+myelination%3A+possible+roles+of+the+immune+proteasome+in+oligodendroglial+homeostasis+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).</li>
<li>Keller, D., Erö, C., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+densities+in+the+mouse+brain%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cell densities in the mouse brain: A systematic review.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygenglucose+deprivation+enhancement+of+cell+death%2Fapoptosis+in+PC12+cells+and+hippocampal+neurons+correlates+with+changes+in+neuronal+excitatory+amino+acid+neurotransmitter+signaling+and+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents.</a> Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Chen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+prenatal+and+postnatal+mouse+central+nervous+system%2C+with+emphasis+on+prenatal+days+E7.5+to+E18.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5.</a> Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+decades+of+new+drug+development+for+central+nervous+system+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two decades of new drug development for central nervous system disorders.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).</li>
<li>Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+new+approaches+in+CNS+drug+discovery%3A+Why+drugs+have+failed%2C+and+what+can+be+done+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes.</a> Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+%28polydendrocytes%29+in+brain+physiology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+Promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).</li>
<li>Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+actin-containing+filaments+of+normal%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells.</a> Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).</li>
<li>Koch, K. S., Leffertt, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+differentiated+adult+rat+hepatocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).</li>
<li>Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+the+infiltrating+immune+cells+in+the+brain+of+healthy+individuals%3A+effect+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity+and+Ageing%22%5BJournal%5D)">Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging.</a> Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het CZS is een complex netwerk dat zich uitstrekt van de hersenen tot aan het ruggenmerg en bestaat uit vele celtypen, voornamelijk neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en microglia1. Omdat elke cel een belangrijke rol speelt bij het handhaven van homeostase en het genereren van passende reacties op uitdagingen in het CZS 9,10,11, is een kweeksysteem dat al deze celtypen bevat een nuttig en veelzijdig hulpmiddel om te onderzo...

Het verbeteren van ons begrip van het centrale zenuwstelsel (CZS) is van cruciaal belang om de therapeutische opties voor veel neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten te verbeteren. Het CZS, een complex netwerk van onderling verbonden cellen in de hersenen, het ruggenmerg en de oogzenuwen, bestaat uit neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en hun aangeboren immuuncellen, de microglia1. Een in vitro aanpak kan vaak het aantal muizen dat nodig is om zinvol onderzoek uit te voeren drastisch verminderen; de complexe aard van het CZS maakt het echter onmogelijk om de in vivo situatie samen te vatten met behulp van cellijnen. Gemengde neurale celculturen bieden een uiterst waardevol onderzoeksinstrument om neuro(immuno)logie vragen te onderzoeken in een relevant model, in lijn met de Replacement, Reduction and Refinement (3Rs) principes 2,3.
Thomson et al. beschreven een celkweekmethode met behulp van prenatale ruggenmergcellen die differentiëren in alle bovengenoemde hoofdtypen van CZS-cellen4. Dit systeem heeft ook synapsvorming, gemyeliniseerde axonen en knooppunten van Ranvier. De belangrijkste beperking van deze kweekmethode is dat het, omdat het ruggenmerg is, de hersenen niet nuttig modelleert en dat de celopbrengsten van embryonale dag 13 (E13) ruggenmerg vernauwen. Dit beperkt dus het aantal experimentele omstandigheden dat kan worden onderzocht. Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een nieuw celkweeksysteem dat de kenmerken van de hersenen samenvat met een verhoogde celopbrengst om de vereisten voor dieren te verminderen.
Met Thomson et al. als uitgangspunt ontwikkelden we een celkweekmodel dat puur was afgeleid van prenatale muizenhersenen. Deze culturen hebben dezelfde celpopulaties, interconnectiviteit en behandelingsopties als de ruggenmergculturen, behalve dat er in vergelijking minder myelinisatie is. Het hebben van een CZS in vitro model met een ongeveer drie keer hogere celopbrengst is echter efficiënter, waardoor minder muizen en minder tijd nodig zijn om embryo's te verwerken. We hebben dit unieke kweeksysteem geoptimaliseerd voor meerdere downstream-toepassingen en weegschalen, waaronder het gebruik van glazen afdekplaten voor microscopie-analyse en verschillende maten plastic putplaten, waaronder 96-putplaten voor onderzoek met hoge doorvoer.

```html
<table><tbody><tr><td>10x Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4549-100ML</td><td>Om weefsel te verteren</td></tr><tr><td>140 mm TC Dish</td><td>Fisher</td><td>11339283</td><td>Plaats 8 35 mm schalen per 1 140 mm schaal</td></tr><tr><td>15 mL Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td>Om cellen te verzamelen in pellet voor resuspendering in beplatingsmedium</td></tr><tr><td>18 G naald</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710012040</td><td>Voor trituratie van monster</td></tr><tr><td>21 G naald</td><td>BD</td><td>304432</td><td>Voor trituratie van monster</td></tr><tr><td>23 G naald</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>Voor trituratie van monster</td></tr><tr><td>35 mm TC Dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Plaats 3 PLL gecoate deksels per 1 35 mm schaal</td></tr><tr><td>5 mL spuit</td><td>Fisher</td><td>15869152</td><td>Voor trituratie van monster</td></tr><tr><td>6 wel plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Om cellen uit te plateren voor RT-qPCR en flowcytometrie</td></tr><tr><td>7 mL Bijoux</td><td>Fisher</td><td>DIS080010R</td><td>Om hersenen in te plaatsen</td></tr><tr><td>96 wel plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Om cellen uit te plateren voor high-throughput testen</td></tr><tr><td>ACSA-2 Antilichaam, anti-muis, PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-123-284</td><td>Voor flowcytometrie kleuring van astrocyten</td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>Dumont</td><td>0108-5/45-PO</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td>Voor DM+/-</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Voor boorzuur buffer</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-muis CD24 Antilichaam, clone M1-69</td><td>Biolegend</td><td>101825</td><td>Voor flowcytometrie kleuring van neuronen en astrocyten</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-muis CD45 Antilichaam, clone 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>Voor flowcytometrie kleuring van microglia</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-muis/mens CD11b Antilichaam, clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101243</td><td>Voor flowcytometrie kleuring van microglia</td></tr><tr><td>BSA Fractie V</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>Voor SD Remmer</td></tr><tr><td>CNP</td><td>Abcam</td><td>AB6319</td><td>Volwassen oligodendrocyten</td></tr><tr><td>Deksel</td><td>VWR</td><td>631-0149</td><td>Om cellen uit te plateren voor microscopie</td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Sigma</td><td>S3146-1EA</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>DMEM Hoge glucose, natriumpyruvaat, L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td>Voor DM+/-, en voor beplatingsmedium</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermofisher</td><td>18047019</td><td>Voor SD Remmer, kan dit of de andere Dnase van Sigma gebruiken</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Voor SD Remmer, kan dit of de andere Dnase van Thermofisher gebruiken</td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermofisher</td><td>65-0865-14</td><td>Live / Dead kleuring</td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Dumont</td><td>0102-SS135-PO</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>Astrocyten</td></tr><tr><td>HBSS met Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9269-500ML</td><td>Voor beplatingsmedium</td></tr><tr><td>HBSS zonder Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td>Voor hersenen om toe te voegen</td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>Voor beplatingsmedium</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>Voor DM+/-</td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Alpha-Laboratories</td><td>019-1971</td><td>Microglia</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td>Voor DM+</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Gibco</td><td>11415-049</td><td>Voor SD Remmer</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA409S</td><td>Myeline</td></tr><tr><td>Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit</td><td>BioTechne</td><td>DY478-05</td><td>ELISA kit voor het kwantificeren van de concentratie van CCL5 in supernatanten van 96 wel plate</td></tr><tr><td>N1 media supplement</td><td>Sigma</td><td>N6530-5ML</td><td>Voor DM+/-</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Merck</td><td>MAB353</td><td>Neurale stam/voorlopercellen</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Thermofisher</td><td>PA578499</td><td>Neuronaal cellichaam</td></tr><tr><td>NG2</td><td>Sigma</td><td>AB5320</td><td>Onvolwassen oligodendrocyten</td></tr><tr><td>O4 Antilichaam, anti-mens/muis/rat, APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-119-155</td><td>Voor flowcytometrie kleuring van oligodendrocyten</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>Voor DM+/-, en voor beplatingsmedium</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinehydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Voor boorzuur / poly-L-lysine oplossing om deksels te coaten</td></tr><tr><td>SMI31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Axonen</td></tr><tr><td>Natriumtetraboraat</td><td>Sigma</td><td>221732-100G</td><td>Voor boorzuur buffer</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher</td><td>15596026</td><td>Voor het lyseren van cellen voor RT-qPCR</td></tr><tr><td>Trypsine remmer uit sojabonen</td><td>Sigma</td><td>T9003-100MG</td><td>Voor SD Remmer</td></tr></tbody></table>
```

het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Modellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) moeten het complexe netwerk van onderling verbonden cellen in vivo samenvatten.Het CZS bestaat voornamelijk uit neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en microglia. Vanwege de toenemende inspanningen om het gebruik van dieren te vervangen en te verminderen, zijn er verschillende in vitro celkweeksystemen ontwikkeld om aangeboren celeigenschappen te onderzoeken, die de ontwikkeling van therapieën voor CZS-infecties en pathologieën mogelijk maken. Hoewel bepaalde onderzoeksvragen kunnen worden aangepakt door op mensen gebaseerde celkweeksystemen, zoals (geïnduceerde) pluripotente stamcellen, heeft het werken met menselijke cellen zijn eigen beperkingen met betrekking tot beschikbaarheid, kosten en ethiek. Hier beschrijven we een uniek protocol voor het isoleren en kweken van cellen uit embryonale muizenhersenen. De resulterende gemengde neurale celculturen bootsen verschillende celpopulaties en interacties na die in vivo in de hersenen worden aangetroffen. In vergelijking met de huidige equivalente methoden bootst dit protocol de kenmerken van de hersenen beter na en verzamelt het ook meer cellen, waardoor meer experimentele omstandigheden van één zwangere muis kunnen worden onderzocht. Verder is het protocol relatief eenvoudig en zeer reproduceerbaar. Deze culturen zijn geoptimaliseerd voor gebruik op verschillende schalen, waaronder 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analyse en 6-well culturen voor flow cytometrie en reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analyse. Deze kweekmethode is een krachtig hulpmiddel om infectie en immuniteit te onderzoeken binnen de context van een deel van de complexiteit van het CZS met het gemak van in vitro methoden.

Microscopie Culturen gekweekt op glazen dekplaten zijn ideaal om te analyseren door middel van microscopie. Om de ontwikkeling van de culturen te visualiseren, werden de coverslips gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) op meerdere tijdstippen van DIV0 (zodra cellen waren bevestigd) tot DIV28. De culturen werden gekleurd voor immunofluorescentiebeeldvorming zoals eerder beschreven5 met behulp van drie verschillende kleurcombinaties: NG2 (onrijpe oligodendrocyten) en nestine (ne...

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

De ultieme onderzoeksvraag van mijn project is om erachter te komen hoe we de aangeboren immuunreacties van het centrale zenuwstelsel kunnen manipuleren om te beschermen tegen virale infecties. Momenteel onderzoeken we hun reactie op het diep antivirale eiwit interferon bèta. Een experimentele uitdaging is het genereren van voldoende cellen om gedetailleerd onderzoek mogelijk te maken.Elk resultaat moet worden gevalideerd met behulp van meerdere technieken en dit kan er helaas toe leiden dat veel dieren worden geruimd. Vanwege het grote aantal cellen dat door deze nieuwe kweektechniek wordt gegenereerd, kunnen veel verschillende experimentele omstandigheden van één zwangere muis worden onderzocht. Daarnaast vermindert het gebruik van in vitro alternatieven, waar mogelijk, ook het dierenleed sterk.Deze methode vermindert en verfijnt het gebruik van dieren, nauwgezet volgens de principes van de drie V's.Deze kweekmethode kan worden gebruikt om veel verschillende onderzoeksvragen aan te pakken met behulp van een verscheidenheid aan uitleesmethoden zoals ELISA, qPCR, microscopie en flowcytometrie. Deze techniek kan andere onderzoekers helpen om hun diergebruik te verminderen en te verfijnen. We hopen ons begrip van de aangeboren antivirale respons te verbeteren door deze te moduleren om te beschermen tegen opportunistische virussen zoals humaan polyomavirus 2, of John Cunningham-virus, zoals het algemeen bekend is, het primaire agens van PML dat een ernstige bijwerking kan zijn van immuunonderdrukkende geneesmiddelen die worden gebruikt om MS en andere ziekten te behandelen.

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Wij bieden een protocol voor de cultuur van sterk gezuiverd hippocampale neuronen van prenatale muis hersenen zonder het gebruik van een feeder-gliale cellaag.

Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

This video demonstrates a technique for isolating and culturing primary mixed glial cells from adult mouse spinal cord tissue. The protocol involves enzymatic digestion of the tissue, followed by the removal of broken cell membranes and myelin debris to obtain a single-cell population. The cells are then cultured in media optimized for mixed glial cell growth.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

We demonstreren een celkweekprotocol voor de directe studie van neuronale en gliale componenten van het enterische zenuwstelsel. Een gemengde neuron/glia-kweek op dekglasjes wordt bereid uit de myenterische plexus van een volwasen muis, waardoor het mogelijk is om de functie van afzonderlijke neuronen en gliacellen te onderzoeken door middel van elektrofysiologie, immunohistochemie, enz.

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Ontdek een geoptimaliseerde methode voor gemengde neuronale en gliale celculturen uit embryonale muizenhersenen. Dit protocol vermindert dierproeven en ondersteunt onderzoek naar aangeboren immuniteit en virale infecties in het centrale zenuwstelsel.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen (Video) | JoVE Journal

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Meer video's verkennen