Name: Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Leer normotherme ex vivo levermachineperfusie in muizen voor orgaanherstelonderzoek met behulp van een gecontroleerd systeem bij 37 graden. Deze methode ondersteunt studies naar moleculaire mechanismen en nieuwe perfusaatadditieven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tijdens het schrijven van dit artikel heb ik veel steun en hulp gekregen. Ik wil in het bijzonder mijn teamgenoot XinPei Chen bedanken voor zijn geweldige samenwerking en geduldige ondersteuning tijdens mijn operatie.

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de huidige Duitse regelgeving en richtlijnen voor dierenwelzijn en de ARRIVE-richtlijnen voor het rapporteren van dierproeven. Het protocol voor dierproeven is goedgekeurd door het Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Duitsland (goedkeuringsnummer: UKJ - 17 - 106).
OPMERKING: Mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 34 ± 4 g (gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde [SEM]) werden gebruikt als leverdonor. Ze werden onderhouden onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (50% vochtigheid en 18 - 23 °C) met vrije toegang tot standaard muischow en water. Gedurende de gehele chirurgische ingreep werd een ademhalingsfrequentie van meer dan 60 ademhalingen/min gehandhaafd en werd de lichaamstemperatuur boven 34 °C gehouden.
1. Voorbereiding
<ol><li>De operatietafel instellen
	<ol><li>Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en verbruiksartikelen voor sterilisatiedoeleinden.</li>
		<li>Schakel alle apparatuur in, inclusief het verwarmingsbord en de elektrocoagulatie.</li>
		<li>Plaats een spuit van 50 ml met 25 ml gehepariniseerde (2.500 U/L) zoutoplossing in een warme couveuse (37 °C).</li>
		<li>Plaats de chirurgische instrumenten, de 6 - 0 zijden hechtdraad, steriele kleine katoenen applicator, veterinaire zoutoplossing (500 ml) en niet-geweven gaassponzen (10 cm x 10 cm) op de juiste manier op de operatietafel.</li>
		<li>Plaats een naald van 26 G op de operatietafel om een klein gaatje in het deksel van de microcentrifugebuis van 0,5 ml te maken om de galbuis te ontvangen voor galverzameling.</li>
		<li>Plaats de canule (1 Fr polyurethaan canule of UT - 03 polyethyleen canule) en een gesteriliseerde 0,5 ml microcentrifugebuis voor galopvang op de operatietafel.</li>
	</ol></li>
	<li>Zelfgemaakte poortadercanule
	<ol><li>Houd de 2 Fr canule met een tang vast en prik de wand door met een naald van 30 G op 1 cm afstand van het uiteinde van de canule. Duw de naald door de canule totdat de punt van de naald zichtbaar wordt.</li>
		<li>Snijd de punt van de canule af, wat resulteert in een scherpe driehoek.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van gehepariniseerde zoutoplossing
	<ol><li>Bereid 25 ml gehepariniseerde zoutoplossing met een eindconcentratie van 2.500 IE/ml.</li>
		<li>Verwijder alle luchtbellen en plaats de spuit in de couveuse van 40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Demonstratie van het perfusiesysteem
	<ol><li>Zie figuur 1 voor de belangrijkste onderdelen van het machineperfusiesysteem.</li>
	</ol></li>
	<li>Opstelling van de orgelkamer
	<ol><li>Zie figuur 2 voor de indeling van de orgelkamer.</li>
	</ol></li>
	<li>Opstelling van het perfusiesysteem
	<ol><li>Schakel het labdiagramprogramma in voor drukbewaking.</li>
		<li>Sluit de drukkalibrator en druksensor aan op het niveau van de orgelkamer.</li>
		<li>Stel de drukkalibrator in op 0 mmHg en controleer de overeenkomstige waarde op de drukregelsoftware.</li>
		<li>Stel de drukkalibrator in op 20 mmHg en controleer nogmaals de overeenkomstige waarde op de drukregelingssoftware.</li>
		<li>Zet het waterbad aan en verwarm de orgelkamer voor op 40 °C.</li>
		<li>Spoel het hele sanitairsysteem twee keer met gedestilleerd gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten elk, zodat de ontsmettingsoplossing volledig wordt verwijderd.</li>
		<li>Start de circulatie van de desinfectieoplossing door het hele systeem gedurende een duur van 20 minuten om een grondige desinfectie te garanderen.</li>
		<li>Zet het gasmengsel (95% zuurstof (O 2) en 5% koolstofdioxide (CO2) aan.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusaat vulling
	<ol><li>Supplement 250 ml van Williams ' E-medium met 50 ml foetaal runderserum, 3 ml penicilline / streptomycine (1 mg / ml), 0,17 ml insuline (100 IE / ml), 0,34 ml heparine (5000 U / ml) en 0,07 ml hydrocortison (100 mg / 2 ml) om het volledige Williams 'E-medium te bereiden.</li>
		<li>Voeg gelijke volumes (150 ml) perfusaat toe aan het reservoir en de orgelkamer om het systeem voor te bereiden. OPMERKING: Speciale aandacht moet worden besteed aan het handhaven van de steriliteit tijdens het vulproces. Het perfusaat wordt constant door deze twee belangrijke componenten van de gesloten recirculerende machineperfusie gepompt.</li>
		<li>Zet de peristaltische pomp op gemiddelde snelheid (15 ml / min) aan om het perfusiesysteem te primen met het zuurstofrijke medium.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Leverexplantatie
<ol><li>Pre-operatieve voorbereiding
	<ol><li>Weeg het dier. Bereid het pijnstillend middel buprenorfine (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg lichaamsgewicht).</li>
		<li>Verbind de inductiekamer met het stopcontact. Zet de zuurstof op 0,5 L/min. Draai isofluraan naar 3%.</li>
		<li>Plaats het dier in de kamer totdat diepe anesthesie (rechtrichtreflex positief) is bereikt.</li>
		<li>Gebruik een microspuit om de aan het lichaamsgewicht aangepaste dosis analgesie subcutaan aan te brengen.</li>
		<li>Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de vacht op de buikhuid te trimmen.</li>
		<li>Breng de muis over naar de operatietafel en zet de isofluraan vaporizer aan tot 2,5% om de anesthesie te behouden. Bevestig de diepte van de anesthesie door de interdigitale teenreflex te testen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de buik van de muis
	<ol><li>Plaats de muis in rugligging.</li>
		<li>Test interdigitale reflex om de juiste diepte van de anesthesie te bevestigen. Bevestig alle vier de ledematen met tape.</li>
		<li>Desinfecteer beide zijden van de buik tot de mid-oksellijn met behulp van drie opeenvolgende rondes jodiumalcohol. Gebruik niet-geweven gesteriliseerd gaas om het gebied rond het chirurgische veld te bedekken.</li>
		<li>Maak een transversale incisie van 3 cm 1 cm onder de xiphoid in de buikstreek van de muis met behulp van een Metzenbaum-babyschaar en een chirurgische tang.</li>
		<li>Verleng de huidincisie bilateraal naar de midaxillaire lijn aan beide zijden.</li>
		<li>Maak voorzichtig een longitudinale incisie van 2 cm langs de linea alba met behulp van een voorjaarsschaar.</li>
		<li>Knip de buikspierlaag door met elektrocoagulatie en Vannas veerschaar.</li>
		<li>Plaats voorzichtig een stuk nat gaas om de lever te beschermen tegen elektrocoagulatie.</li>
		<li>Gebruik een 6 - 0 zijden hechting met de ronde naald om het xiphoid-proces in te trekken voor een betere blootstelling van het coronaire ligament.</li>
		<li>Gebruik twee rib retractors om de buikholte van de muis volledig bloot te leggen.</li>
		<li>Beweeg de dunne darm voorzichtig uit de buikholte met een nat wattenstaafje om het hilum volledig bloot te leggen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gemeenschappelijke galwegvoorbereiding
	<ol><li>Transect de falciforme, phrenic en gastrohepatische ligamenten met een scherpe schaar.</li>
		<li>Maak het gemeenschappelijke galkanaal voorzichtig vrij met een fijne gebogen tang zonder tanden. OPMERKING: Het gemeenschappelijke galkanaal is zeer gemakkelijk beschadigd en breekt. Zodra het breekt, kan het niet meer worden gecannuleerd. Vanwege de richting van de anatomische positie is een gebogen tang beter te gebruiken.</li>
		<li>Plaats twee 6 - 0 zijden hechtlussen over het gemeenschappelijke galkanaal ter voorbereiding op de volgende stap.</li>
	</ol></li>
	<li>Gemeenschappelijke galwegcannulatie
	<ol><li>Prik voorzichtig door het galkanaal met een naald van 30 G. Gebruik een puntige gebogen tang om het kleine gaatje te vergroten zodat het in de galwegcannulatie past.</li>
		<li>Gebruik een vaatcannulatietang om de galwegcanule vast te pakken en in het galkanaal te duwen.</li>
		<li>Zet de canule dubbel vast met de vooraf ingestelde 6 - 0 hechtlussen. OPMERKING: Tijdens de cannulatie wordt weerstand door gal gevoeld. Als de kracht niet goed wordt gecontroleerd, wordt de canule uit de galwegen geduwd door de druk van galuitstroom. Pas de diepte van de canule zorgvuldig aan. Als het te diep is, kan het de galwegen beschadigen en als het niet diep genoeg is, kan het uitglijden.</li>
		<li>Observeer de galstroom in de canule na succesvolle cannulatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Portaaladervoorbereiding
	<ol><li>Klem de poortader vast met een platte tang en maak het bindweefsel voorzichtig vrij met een gebogen tang. Trek niet hard om te voorkomen dat de poortader scheurt. Zodra de poortader is beschadigd, is het moeilijk om de poortader opnieuw te kannuleren.</li>
		<li>Ontleed de PV net superieur aan de bifurcatie en plaats de eerste hechtlus met behulp van 6 - 0 zijdehechting op PV dicht bij de samenvloeiing voor later gebruik.</li>
		<li>Plaats de tweede hechtlus voor latere fixatie van de PV zo dicht mogelijk bij de leverhilum.</li>
	</ol></li>
	<li>Portaalader cannulatie
	<ol><li>Gebruik een arteriële clip om de distale poortader te sluiten.</li>
		<li>Prik heel voorzichtig de poortader door met een van de bovenstaande portaladercanules. De bloedstroom kan duidelijk worden waargenomen in de canule na een succesvolle punctie.</li>
		<li>Bevestig de PV-canule met de vooraf geplaatste 6 - 0 hechtlus.</li>
	</ol></li>
	<li>Blozen van de lever
	<ol><li>Verhoog isofluraan tot 5% en euthanaseer de muis met een overdosis isofluraaninhalatie.</li>
		<li>Neem voorverwarmde heparine zoutoplossing uit de incubator. Verwijder alle luchtbellen gevormd in de gehepariniseerde zoutoplossing.</li>
		<li>Bevestig de spuit met voorverwarmde gehepariniseerde zoutoplossing in de spuitpomp.</li>
		<li>Sluit de verlengbuis van de spuitpomp aan op de canule van de poortader, stel de snelheid in op 2 ml / min en start het spoelen van de lever.</li>
		<li>Observeer de kleur van de lever aan het einde van de spoelprocedure. Snijd de lever weg zodra de kleur homogeen geel wordt.</li>
		<li>Transect het diafragma, suprahepatische inferieure vena cava, infra hepatische vena cava, leverslagader, distale poortader en eventueel overblijvend bindweefsel.</li>
		<li>Plaats de lever in de petrischaal.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lever- en kamerverbinding
<ol><li>Leveroverdracht
	<ol><li>Breng de lever voorzichtig over in de orgaankamer met behulp van een petrischaaltje.</li>
		<li>Bewaar een kleine hoeveelheid zoutoplossing in de petrischaal om te voorkomen dat de lever uitdroogt. OPMERKING: Portaalader en galwegen kunnen gemakkelijk worden gedraaid tijdens deze procedure, wat de leverperfusie en galverzameling kan beïnvloeden.</li>
	</ol></li>
	<li>Portaal ader canule verbinding
	<ol><li>Infundeer langzaam normale zoutoplossing in de poortadercanule met een spuit om de luchtbellen in de canule te evacueren.</li>
		<li>Sluit de poortadercanule aan op de perfusate uitstroombuis in de orgelkamer.</li>
	</ol></li>
	<li>Galwegcanule aansluiting
	<ol><li>Leid de galkanaalcanule van de muis door de klep van een rubberen dop die is verbonden met de orgelkamer.</li>
		<li>Plaats de galwegcanule in een vooraf voorbereide microbuis van 0,5 ml met een klein gaatje in het deksel.</li>
		<li>Plaats de microbuis op klei buiten de orgelkamer.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Pas het debiet aan volgens de PV-druk
<ol><li>Zet de peristaltische pomp aan vanaf 1 ml/min.</li>
	<li>Controleer de poortaderdrukmeting om het debiet aan te passen.</li>
	<li>Houd de poortaderdruk in het fysiologische bereik tussen 7 - 10 mmHg door het debiet aan te passen. OPMERKING: Het nominale debiet kan enigszins variëren, afhankelijk van het gebruik en de positionering van buizen.</li>
</ol>5. Monsterverzameling
<ol><li>Verkrijg inlaatperfuaatmonsters uit de poortaderinstroombuis en uitlaatperfusaatmonsters uit de orgelkamer met intervallen van 3 uur.</li>
	<li>Verzamel monsters van alle leverkwabben voor histologische analyse aan het einde van de perfusieperiode van 12 uur.</li>
</ol>

Er zijn geen financiële belangenconflicten bekend te maken.

Kritieke stappen in het protocol De twee cruciale stappen bij leverexplantatie zijn de cannulatie van de poortader (PV) en de daaropvolgende cannulatie van het galkanaal (BD). Deze stappen zijn van het grootste belang voor het succesvol ophalen van organen en de daaropvolgende perfusie- of transplantatieprocedures.
Uitdagingen en oplossingen PV-cannulatie brengt drie uitdagingen met zich mee: letsel van de vaatwand, verplaatsing van de katheter en uitvoe...

Levertransplantatie vertegenwoordigt de gouden standaardbehandeling voor personen met een leverziekte in het eindstadium. Helaas overtreft de vraag naar donororganen het beschikbare aanbod, wat leidt tot een aanzienlijk tekort. In 2021 stonden ongeveer 24.936 patiënten op de wachtlijst voor een levertransplantatie, terwijl slechts 9.234 transplantaties succesvol werden uitgevoerd1. Het aanzienlijke verschil tussen vraag en aanbod van levertransplantaten benadrukt de dringende noodzaak om alternatieve strategieën te onderzoeken om de donorpool te verbreden en de toegankelijkheid van levertransplantaten te verbeteren. Een manier om de donorpool uit te breiden is het gebruik van marginale donoren2. Marginale donoren zijn mensen met gevorderde leeftijd, matige of ernstige steatose. Hoewel de transplantatie van marginale organen gunstige resultaten kan opleveren, blijven de algemene resultaten suboptimaal. Als gevolg hiervan is de ontwikkeling van therapeutische strategieën gericht op het verbeteren van de functie van marginale donoren momenteel aan de gang 3,4.
Een van de strategieën is om machineperfusie te gebruiken, met name normotherme zuurstofrijke machineperfusie, om de functie van deze marginale organen te verbeteren5. Er is echter nog steeds een beperkt begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gunstige effecten van normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Muizen, met hun overvloedige beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen, dienen als waardevolle modellen voor het onderzoeken van moleculaire routes. Bijvoorbeeld, het belang van autofagie pathways bij het verminderen van hepatische ischemie-reperfusie letsel is in toenemende mate erkend 6,7. Een belangrijke moleculaire route in de hepatische ischemie-reperfusie schade is de miR-20b-5p/ATG7 pathway8. Momenteel zijn er een aantal ATG knock-out en voorwaardelijke knock-out muizenstammen beschikbaar, maar geen overeenkomstige rattenstammen9.
Op basis van deze achtergrond was het doel om een geminiaturiseerd NEVLP-platform voor muizenlevertransplantaten te genereren. Dit platform zou de verkenning en evaluatie van potentiële genetisch gemodificeerde strategieën vergemakkelijken die gericht zijn op het verbeteren van de functionaliteit van de lever van de donor. Bovendien was het essentieel dat het systeem geschikt was voor langdurige perfusie, waardoor de ex vivo behandeling van de lever mogelijk werd, gewoonlijk "orgaanreparatie" genoemd.
Gezien de beperkte beschikbaarheid van relevante in vitro gegevens over leverperfusie bij muizen, richtte het literatuuronderzoek zich op studies uitgevoerd bij ratten. Een systematische zoektocht van literatuur van 2010 tot 2022 werd uitgevoerd met behulp van trefwoorden zoals "normotherme leverperfusie", "ex vivo of in vitro" en "ratten". Deze zoektocht was gericht op het identificeren van optimale omstandigheden bij knaagdieren, waardoor we de meest geschikte aanpak konden bepalen.
Het perfusiesysteem bestaat uit een afgesloten glazen bufferreservoir met watermantel, een peristaltische rollenpomp, een oxygenator, een bellenvanger, een warmtewisselaar, een orgelkamer en een gesloten cyclusbuizensysteem (figuur 1). Het systeem zorgt voor een nauwkeurige handhaving van een constante perfusietemperatuur van 37 °C met behulp van een speciale thermostatische machine. De peristaltische rollenpomp drijft de stroom van het perfusaat door het hele circuit aan. Het perfusiecircuit begint bij het geïsoleerde wateromhulde reservoir. Vervolgens wordt het perfusaat door de oxygenator geleid, die een gasmengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide uit een speciale gasfles ontvangt. Na oxygenatie passeert het perfusaat de bellenvanger, waarbij eventuele ingesloten bellen door de peristaltische pomp terug naar het reservoir worden geleid. Het resterende perfusaat stroomt door de warmtewisselaar en komt in de orgelkamer, van waaruit het terugkeert naar het reservoir.
Hier rapporteren we onze ervaringen met het opzetten van een NEVLP voor muizenlevers en delen we de veelbelovende resultaten van een proefexperiment uitgevoerd met behulp van het zuurstofrijke medium zonder zuurstofdragers.

<table><tbody><tr><td>0.5 ml Micro Tube PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr Rubber Cannula</td><td>Vygon</td><td>Sample Cannula</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L Micro Syringe</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr Rubber Cannula</td><td>Vygon</td><td>Sample Cannula</td><td></td></tr><tr><td>24 G Butterfly Cannula</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 G Butterfly Cannula</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 G Hypodermic Needle</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Syringe Pump</td><td>Braun</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>Arterial Clip</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable Moist Chamber</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>Big Cotton Applicator&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0.3 mg / ml)</td><td>Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX OPA solution (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum(500 ml)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gas Mixture (95 % oxygen &amp; 5 % carbon dioxide)</td><td>House Supply</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Heating Circulating Baths</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 5000 (I.E. /5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>Insulin(100 IE / ml)</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Oxygenator</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgery Microscope&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Retractor Set&nbsp;</td><td>Carfil Quality</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>Hamamatsu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)&nbsp;</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Extension Tube (30 cm)</td><td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishc 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer Simulator</td><td>UTAH Medical Products</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>Reusable Blood Pressure Transducers</td><td>AD Instruments</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S &amp; T Vessel Cannulation Forceps</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Small Cotton Applicator</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Straight Forceps 10 cm&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Suture Tying Forceps</td><td>Fine Science Instruments</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 50ml Original Perfusor</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Cannula</td><td>Unique Medical, Japan</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary Saline (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>Water Jacketed Reservoir&nbsp; 2 L</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

normothermic ex vivo lever machine perfusie in muis

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd erytrocytenvrij NEVLP-systeem met behulp van muizenlevers. Ex vivo conservering van muizenlevers werd bereikt door gebruik te maken van gemodificeerde canules en technieken die waren aangepast aan conventionele commerciële ex vivo perfusieapparatuur. Het systeem werd gebruikt om de conserveringsresultaten na 12 uur perfusie te evalueren. C57BL / 6J-muizen dienden als leverdonoren en de levers werden geëxplanteerd door de poortader (PV) en galwegen (BD) te cannuleren en vervolgens het orgaan te spoelen met warme (37 ° C) gehepariniseerde zoutoplossing. Vervolgens werden de geëxplanteerde levers overgebracht naar de perfusiekamer en onderworpen aan normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Inlaat- en uitlaatperfuaatmonsters werden met tussenpozen van 3 uur verzameld voor perfuaatanalyse. Na voltooiing van de perfusie werden levermonsters verkregen voor histologische analyse, waarbij de morfologische integriteit werd beoordeeld met behulp van gemodificeerde Suzuki-Score door hematoxyline-eosine (HE) kleuring. De optimalisatie-experimenten leverden de volgende bevindingen op: (1) muizen met een gewicht van meer dan 30 g werden geschikter geacht voor het experiment vanwege de grotere omvang van hun galwegen (BD). (2) een 2 Fr (buitendiameter = 0,66 mm) polyurethaan canule was beter geschikt voor het cannuleren van de poortader (PV) in vergelijking met een polypropyleen canule. Dit werd toegeschreven aan de verbeterde grip van het polyurethaanmateriaal, wat resulteerde in minder slippen van de katheter tijdens de overdracht van het lichaam naar de orgaankamer. (3) voor cannulatie van de galwegen (BD) bleek een polyurethaancanule van 1 Fr (buitendiameter = 0,33 mm) effectiever te zijn in vergelijking met de polypropyleen UT - 03 (buitendiameter = 0,30 mm) canule. Met dit geoptimaliseerde protocol werden muizenlevers met succes bewaard voor een duur van 12 uur zonder significante impact op de histologische structuur. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring onthulde een goed bewaard gebleven morfologische architectuur van de lever, gekenmerkt door overwegend levensvatbare hepatocyten met duidelijk zichtbare kernen en milde verwijding van hepatische sinusoïden.

Vaststelling van de chirurgische procedure In totaal werden 17 dieren gebruikt voor dit experiment: 14 muizen werden gebruikt voor het optimaliseren van het orgaanverkrijgingsproces, inclusief cannulatie van de poortader (PV) en galwegen (BD), terwijl 3 muizen werden gebruikt om de procedure te valideren (tabel 1). Histologische resultaten (figuur 3) werden vergeleken om de identificatie van de optimale perfusieconditie te vergemakkelijken.
<p class="...

Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.

Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Normothermic Ex-Vivo levermachine perfusie in muis. Normothermische zuurstofrijke leverperfusie is een veelbelovende strategie om marginale organen te redden en is onlangs geïntroduceerd in de klinische praktijk. De onderliggende moleculaire mechanismen zijn echter niet goed begrepen.Een muismodel is nodig om de moleculaire routes verder te bestuderen, waarbij gebruik wordt gemaakt van genetisch gemodificeerde dieren, zoals transgene muizen, en daarom wordt gewacht op het opzetten van een normotherm zuurstofrijk machineperfusiesysteem voor muizenlevers. Hier is een schema van ons hele systeem. Ten eerste wordt het hele systeem op 37 graden Celsius bestuurd door een thermostatische regelaar via watercirculatie.Het perfusaat wordt door een peristaltische pomp uit het reservoir in een oxygenator gepompt. Er is een ononderbroken gasstroom van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide in de oxygenator. Het perfusaat gaat dan door een bellenvanger.Het perfusaat met luchtbellen wordt onder druk teruggepompt naar het reservoir. Het resterende perfusaat stroomt naar de orgelkamer waar de buis is verbonden met de poortader. Het perfusaat wordt vanuit de lever via de suprahepatische cava naar de orgaankamer afgevoerd.De perfusaatuitstroom uit de orgelkamer wordt door de peristaltische pomp terug naar het reservoir geleid. Een galdrainagebuis is verbonden met de orgaankamer om gal te verzamelen. Dit is onze operatietafel.Alle operaties worden onder een microscoop uitgevoerd. We handhaven semi-steriele bedrijfsomstandigheden gedurende de chirurgische procedure. Houd de Franse buiscanule vast met een tang.Prik de canulewand binnen met een naald van 30 G op een centimeter afstand van het uiteinde van de canule. Duw de naald door de canule totdat de punt van de naald zichtbaar wordt. Hier is een vergelijkingsfoto van 26G-katheter en zelfgemaakte canule; Beide zijn geschikt voor muisportaalcannulatie.Bereid 25 milliliter gehepariniseerde zoutoplossing met een eindconcentratie van 2.500 internationale eenheden per milliliter en plaats de spuit in de couveuse die is ingesteld op 40 graden Celsius. Hier zijn de belangrijkste componenten van het ex-vivo normotherme machineperfusiesysteem. De componenten omvatten voornamelijk de orgelkamer, thermostatische machine, rollenpomp, oxygenator en reservoir.Hier ziet u een gedetailleerde opstelling van onze orgelkamer. Kortom, het bestaat uit een orgaankamerlichaam, een druksensor, een warmtewisselaar en een bellenvanger. We zetten een perfusaatinlaat, een perfusaatuitlaat en een galafvoerpoort op.Dit is het ADI-monitoringsysteem dat we gebruiken om de poortaderdruk te bewaken. Het ADI-systeem bestaat uit een druksensor, een centrale controller en displays. Schakel LabChart-programma in voor drukbewaking.Kalibratie en nulstelling zijn vereist voor elk gebruik van de druksensor. Gebruik nul millimeter kwik en 20 millimeter kwik als markeringen om de druksensor te kalibreren voor de tweestapskalibratie. Op basis van de constante bewaking van de portaaldruk kunnen we de portaalfluraan aanpassen aan drukveranderingen.Bij gelijke volumes perfusaat naar het reservoir en de orgaankamer om het systeem voor te bereiden, moet speciale aandacht worden besteed aan het handhaven van de steriliteit tijdens het vulproces. Sluit de inductiekamer aan met een stopcontact. Draai zuurstof naar 0,5 liter per minuut.Draai isofluraan naar 3%Plaats het dier in de kamer totdat diepe anesthesie is bereikt. Gebruik een microspuit om een aan het lichaamsgewicht aangepaste dosis analgesie toe te passen. Hier zeven microliter buprenorfine.Nu beginnen we met de operatie. Maak een transversale incisie in de buikstreek van de muis. De huidincisie strekt zich uit tot de bilaterale oksellijn van het vlees aan beide zijden.Maak voorzichtig een longitudinale incisie langs de linea alba. Knip de buikspierlaag door met elektrocoagulatie en schaar. Plaats voorzichtig een stuk nat gaas om de lever te beschermen tegen elektrocoagulatie.Stel de buikholte van de muis volledig bloot. Beweeg de dunne darm voorzichtig uit de buikholte met een nat wattenstaafje om het hilum volledig bloot te leggen. Hier is een schematisch diagram van poortadercannulatie en galwegcannulatie.Kortom, we kiezen de juiste canule op basis van de grootte van de muis en we gebruiken 6-0 zijden hechting voor de fixatie van de canule. Maak het gemeenschappelijke galkanaal voorzichtig vrij met een fijne gebogen tang zonder tanden. De gemeenschappelijke galgang is zeer gemakkelijk beschadigd en breekt.Zodra het breekt, kan het niet meer worden gecannuleerd. Door de richting van de anatomische positie is een gebogen tang gemakkelijker te bedienen. Plaats twee 6-0 zijden hechtlus over het gemeenschappelijke galkanaal ter voorbereiding op de volgende stap.Prik voorzichtig door de galgang met een naald van 30G. Gebruik puntige gebogen tangen om de kleine gaatjes te vergroten, zodat het galwegcannulatie kan voeden. Gebruik een vaatcannulatietang over de galwegcanule en duw deze in het galkanaal. Notitie.Op het moment van cannulatie voel je de weerstand die gal met zich meebrengt. Als de kracht niet goed wordt gecontroleerd, wordt de canule uit de galwegen geduwd door de druk van de galuitstroom. Pas de diepte van de canule zorgvuldig aan.Als het te diep is, kan het de galwegen beschadigen en als het niet diep genoeg is, kan het uitglijden. Galstroom kan worden waargenomen in de canule na succesvolle cannulatie. Klem de poortader vast met een platte tang en maak het bindweefsel voorzichtig vrij met een gebogen tang.Trek hier niet hard aan, om geen scheuren van de poortader te veroorzaken. Zodra de poortader is beschadigd, is het moeilijk om de poortader te herstellen. Plaats twee 6-0 zijden hechtlus over de vrije poortader.Gebruik een arteriële clip om de distale poortader te sluiten. Prik heel voorzichtig de poortader door met een van de bovenstaande poortadercanules. De bloedstroom kan duidelijk worden waargenomen in de canule na een succesvolle punctie.Neem voorverwarmde heparine zoutoplossing uit de incubator. Verwijder alle luchtbellen. Bevestig de spuit met voorverwarmde heparinized zoutoplossing in de spuitpomp.Sluit de verlengbuis van de spuitpomp aan op de canule van de poortader. Stel de snelheid in op twee milliliter per minuut en begin met het spoelen van de lever. Verhoog isofluraan tot 5% en euthanaseer de muis met een overdosis isofluraaninhalatie.Observeer de kleur van de lever aan het einde van de spoelprocedure. Snijd de lever weg zodra de kleur homogeen geel is geworden. Breng de lever voorzichtig over in de orgaankamer met behulp van een petrischaaltje.Bewaar een kleine hoeveelheid zoutoplossing in de petrischaal om te voorkomen dat een lever wordt verpletterd. Notitie. Portaalader en galwegen kunnen tijdens deze procedure gemakkelijk worden gedraaid, wat de leverperfusie en galverzameling kan beïnvloeden. Infundeer langzaam normale zoutoplossing in de poortadercanule met een spuit om de luchtbellen in de canule te evacueren.Sluit de poortadercanule aan op de perfusate uitstroombuis in de orgelkamer. De galwegcanule van de muis wordt door een klep van de orgelkamer geleid, die wordt afgesloten met een rubberen dop. Vervolgens wordt de galbuis ingebracht in een vooraf voorbereide microbuis van 0,5 milliliter met een klein gaatje in het lood.Nadat alles is aangesloten, zet u de peristaltische pomp aan. Controleer de poortaderdrukmeting om het debiet aan te passen. Houd de poortaderdruk tussen zeven en 10 millimeter kwik door het debiet aan te passen. Notitie.Het nominale debiet kan enigszins variëren, afhankelijk van de leeftijd en de positionering van de buizen. Dit is de selectie van perfusaatmedium, perfusaatvolume en perfusiedruk op basis van een literatuuronderzoek van normotherme zuurstofrijke rattenlevermachineperfusiestudies. Dit is een stapsgewijze proef om het muisperfusiemodel vast te stellen.Er waren ongeveer 14 experimenten nodig om de meest geschikte katheters te selecteren. In onze handen is het gebruik van twee Franse rubberen katheters voor de poortader, samen met één Franse rubberen katheter voor het galkanaal, de beste combinatie om homogene perfusie te bereiken met alle katheters op hun plaats. pH-niveau en kaliumniveau waren stabiel gedurende 12 uur perfusie.pH-niveau varieerde van 7,26 tot 7,71 en kaliumniveau varieerde van 5,9 tot 6,8 millimol per liter. HE-kleuring laat zien dat na 12 uur perfusie de histologische integriteit van de muizenlever relatief goed bewaard was gebleven. Alles bij elkaar hebben we hier de succesvolle oprichting van een normotherm zuurstofrijk machineperfusiesysteem voor de muizenlever gedemonstreerd.Perfusie van een muizenlever gedurende 12 uur resulteerde in een goed behoud van de levermorfologie, hoewel niet in het hele orgaan. Verdere inspanningen zijn nodig om volledige homogene perfusie over een langere periode te bereiken. Zodra dit is bereikt, kan het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren worden overwogen, zoals het gebruik van IL-2-knock-out muizen om de rol van ontsteking te onderzoeken.

normothermic-ex-vivo-liver-machine-perfusion-in-mouse

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Marginale enten, zoals vette levers, enten van oudere donoren, of levers teruggehaald na hartdood (DCD) tolereren conventionele, koude statische opslag alleen slecht. We ontwikkelden een nieuw model van subnormothermic ex vivo lever perfusie voor het behoud, de beoordeling, en de reparatie van marginale lever transplantaties voorafgaand aan de transplantatie.

Techniek van Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusie voor de opslag, Assessment, en reparatie van Marginal Lever Enten

Hier presenteren we een protocol dat de geoxygeneerde ex situ machineperfusie van donorlevergrafts beschrijft. Dit artikel bevat een stap voor stap protocol om het levergraft voor machineperfusie te verkrijgen en voor te bereiden, de perfusie vloeistof voor te bereiden, de perfusiemachine te primen en de geoxygeneerde normotherme machineperfusie van het levergraft uit te voeren.

Ex Situ normothermische machineperfusie van donorlevers

We beschrijven een werkwijze voor ex vivo machine perfusie van menselijke lever transplantaten bij subnormothermic temperatuur (21 ° C).

Functionele menselijke lever behoud en herstel door middel van Subnormothermic Machine perfusie

Er is een belangrijke donor van lever tekort, en criteria voor lever donoren hebben uitgebreid. Normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) is ontwikkeld om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. Deze studie toont een model van de rat van NEVLP en test het vermogen van gepegyleerde-katalase, te verzachten lever behoud letsel.

Een kleine diermodel van Ex Vivo Normothermic lever perfusie

Normothermic ex situ hart perfusie (ESHP), behoudt het hart in een slaand, semi-fysiologische staat. Wanneer uitgevoerd in een werkmodus, biedt ESHP de mogelijkheid voor het uitvoeren van geavanceerde evaluaties van donor hart functie en orgel levensvatbaarheid. Hier beschrijven we onze methode voor de evaluatie van de myocardiale prestaties tijdens ESHP.

Normothermic Ex Situ hart perfusie in modus werken: beoordeling van cardiale functie en metabolisme

Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.

Oprichting van In Situ Closed Circuit Perfusie van onderbuikorganen en achterpoten bij muizen

Het protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het resectie van een intacte muizenlever voor metabolische studies door middel van poortaderperfusie.

Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis

Het varkensmodel van normotherme machineperfusie (NMP) in de lever, dat hier wordt beschreven, kan met succes worden gebruikt om NMP te bestuderen als een conserveringsstrategie, een hulpmiddel voor levensvatbaarheidsbeoordeling en een platform voor orgaanherstel. Het heeft een hoge translationele waarde, maar het is technisch uitdagend en arbeidsintensief.

Normothermische geïsoleerde leverperfusie bij varkens

Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.

Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen

Insulineklaring in de lever is van cruciaal belang voor het reguleren van de glucosehomeostase. Dit artikel beschrijft een gebruiksvriendelijke leverperfusieprocedure voor het direct evalueren van de insulineklaringssnelheid in de lever in situ bij muizen.

Beoordeling van insulineklaring bij muizen via in situ leverperfusie

Hier presenteren we een protocol voor een open-source, aanpasbaar normotherm ex vivo perfusiesysteem dat is ontworpen om de hoge kosten en beperkte flexibiliteit van bestaande platforms te overwinnen, waardoor een toegankelijker, kostenefficiënter en iteratiever gebruik in preklinisch biomedisch onderzoek mogelijk wordt.

Een open-source normothermisch perfusiesysteem ontworpen voor onderzoekswetenschappers

Leer normotherme ex vivo levermachineperfusie in muizen voor orgaanherstelonderzoek met behulp van een gecontroleerd systeem bij 37 graden. Deze methode ondersteunt studies naar moleculaire mechanismen en nieuwe perfusaatadditieven.

Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis

Meer video's verkennen