Name: Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer hoe u patiënt-specifieke podocyten genereert uit huidbiopten via episomale reprogrammering naar hiPSCs. Deze methode biedt een verbeterd ex vivo model voor onderzoek naar nierziekten en gepersonaliseerde geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Friedrich-Alexander Universiteit Erlangen-Nürnberg met het subsidienummer M4-IZKF-F009 gegeven aan Janina Müller-Deile, en door Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) onder de projectnaam STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, subsidienummer 01GM2202D gegeven aan Janina Müller-Deile. We bedanken Annalena Kraus voor de steun bij het maken van SEM-beelden.

Huidbiopten gebruiken om van de patiënt afgeleide podocyten te genereren

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit op celcultuur gebaseerde protocol combineert de episomale herprogrammering van menselijke dermale fibroblasten in patiëntspecifieke hiPSC's en daaropvolgende differentiatie in hiPSC-afgeleide podocyten. Dit stelt ons in staat om mutatiegerelateerde veranderingen van podocyten van patiënten met genetische glomerulaire ziekte met betrekking tot podocytenbeschadiging te bestuderen. Het protocol om dermale fibroblasten te herprogrammeren met een integratievrije methode door elektroporatie is aangepast aan het gepubliceerde werk van Bang et al.32 en Okita et al.33. Het protocol om podocyten te onderscheiden van hiPSC's is aangepast van het gepubliceerde protocol van Musah et al.28,34,35. Er zijn al publicaties beschikbaar die de generatie van podocyten uit hiPSC'sbeschrijven 27,34,35. Het protocol dat hier wordt aangeboden, is echter geoptimaliseerd en goedkoper met betrekking tot de differentiatie van hiPSC's in podocyten. Vergeleken met het gepubliceerde protocol van Musah et al., hebben we dit protocol getest op verschillende coatingreagentia, zoals vitronectine, laminine silk-511 en opgeloste keldermembraanmatrix. De concentraties van vitronectine en laminine zijde-511 konden worden verlaagd tot 2,5 μg/ml in plaats van 5 μg/ml 28,34,35. Bovendien was het mogelijk om de concentraties van BMP7 en activine A-twee zeer dure groeifactoren met 50% te verlagen, van 100 ng / ml tot 50 ng / ml.
Dit maakt goedkopere differentiatie mogelijk. Nefron-voorlopercellen vanaf dag 7 waren nog steeds aan het vermenigvuldigen en de mogelijkheid van bevriezing was eerder aangetoond. We breidden deze cellen uit na het ontdooien en vóór de uiteindelijke differentiatie in basismedium met Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) en B27 gedurende enkele dagen, waardoor de kosten nog verder daalden. Naast de differentiatiestappen beschrijft dit protocol de uitgroei van fibroblasten uit huidbiopten met daaropvolgende generatie patiëntspecifieke hiPSC's via episomale herprogrammering. De combinatie van deze twee methoden maakt het genereren van patiëntspecifieke podocyten mogelijk. Daarom wordt hier een compleet stapsgewijs protocol gegeven om patiëntspecifieke hiPSC-afgeleide podocyten te genereren die niet eerder in zo'n detail zijn beschreven.
Omdat het algemene protocol verschillende celtypen bevat, is het cruciaal om de gegenereerde celtypen in verschillende stappen te karakteriseren. Cellen zijn gedurende een langere periode in cultuur, dus kwaliteitscontrole moet op verschillende passages worden uitgevoerd. Bij het werken met hiPSC's is dagelijkse voeding en celgedrag en morfologiemonitoring noodzakelijk. De steriliteit van de differentiatiemedia moet worden gewaarborgd door filtersterilisatie door een filter van 0,2 μm. Het hele protocol, van huidbiopsie tot hiPSC-afgeleide podocyten, duurt enkele maanden, maar het is mogelijk om de cellen in verschillende stadia van het proces te bevriezen. Fibroblasten, geselecteerde hiPSC-klonen en proliferatieve nefronvoorlopercellen na 7 dagen in nefron-voorloperdifferentiatiemedium kunnen worden ingevroren en een werkende celbank kan worden gegenereerd.
Hoewel van hiPSC afgeleide gezonde podocyten een duidelijk netwerk van primaire en secundaire voetprocessen ontwikkelen (figuur 5A, B) en typische podocytspecifieke marker uitdrukken (figuur 6A-C), zijn karakteristieke spleetmembranen, zoals in vivo gezien, moeilijk na te bootsen in klassieke tweedimensionale celcultuurmodellen. Bovendien is intercellulaire communicatie met andere glomerulaire celtypen niet mogelijk in deze monocultuursetting.
Vanwege hun terminale gedifferentieerde toestand en gebrek aan proliferatiecapaciteit is het moeilijk om podocyten ex vivo te bestuderen. Met behulp van voorwaardelijk vereeuwigende primaire podocyten is het mogelijk om deze beperking te overwinnen door het inbrengen van een thermosensitieve schakelaar, resulterend in een celkweekmodel waarbij cellen prolifereren bij 33 °C en differentiëren bij 37 °C13,14. Hoewel deze ciPodocyten een hoog potentieel hebben voor podocytenonderzoek, zijn er beperkingen, zoals het ontbreken van markerexpressie, gededifferentieerde morfologie en het niet vormen van voetprocessen15,16.
De differentiatie van podocyten van van de patiënt afgeleide somatische cellen maakt het mogelijk om zieke podocyten te genereren en te vergelijken met gezonde controlecellen ex vivo. Dit stelt ons in staat om podocytenschade te bestuderen als gevolg van mutaties in podocyt-specifieke genen. Bovendien heeft het werken met hiPSC's het potentieel voor het creëren van driedimensionale celkweekziektemodellen, of beter gezegd organoïden43,44. Co-cultuur van hiPSC-afgeleide podocyten met andere glomerulaire cellen, zoals glomerulaire endotheelcellen of mesangiale cellen, kan leiden tot nieuwe inzichten met betrekking tot intercellulaire communicatie in gezondheid en glomerulaire ziekte.
Bovendien kan de karakterisering en behandeling van de patiëntspecifieke podocyten ex vivo worden uitgevoerd in high-throughput analyse. De geïndividualiseerde aanpak opent de mogelijkheid om nieuwe therapeutische doelen voor specifieke mutaties te onderzoeken en in de toekomst geïndividualiseerde geneeskunde uit te voeren.

Podocyten zijn gespecialiseerde, post-mitotische renale epitheelcellen die de glomerulaire filtratiebarrière van de nier vormen, samen met het glomerulaire keldermembraan (GBM), glomerulaire endotheelcellen en glycocalyx. Fenotypisch bestaan podocyten uit een cellichaam en primaire, microtubule-aangedreven membraanextensies, evenals secundaire extensies die voetprocessen 1,2 worden genoemd. De glomerulaire filtratiebarrière die urine uit het bloed filtert, is gebouwd van fenestrated endotheel, GBM en een gespecialiseerd type intercellulaire junctie die naburige podocytenvoetprocessen verbindt, het spleetmembraan van podoctyes3 genoemd. Onder gezonde omstandigheden worden eiwitten groter dan albumine vastgehouden van de filtratiebarrière vanwege hun grootte en lading4.
Mutaties in cytoskelet- of podocyt-specifieke genen, evenals circulerende factoren die podocytensignaleringsroutes beïnvloeden, zijn bekend om podocyten-effacement, loslating of apoptose te induceren, resulterend in proteïnurie en glomerulaire sclerose. Met name cytoskeletale herschikking, veranderingen in podocytenpolariteit of schade aan voetprocessen met een geassocieerd verlies van spleetverbindingen zijn cruciaal5. Vanwege hun terminaal gedifferentieerde status kunnen podocyten nauwelijks worden vervangen na het loskoppelen van de GBM. Als podocyten echter aan de GBM zijn bevestigd, kunnen ze nog steeds herstellen van uitwissen en interdigiterende voetprocessen hervormen 6,7,8. Verder begrip van de gebeurtenissen die leiden tot schade aan podocyten bij verschillende glomerulaire aandoeningen kan nieuwe therapeutische doelen bieden die zullen helpen bij het ontwikkelen van behandelingen voor deze ziekten. Podocytenschade is een kenmerk van verschillende glomerulaire ziekten, waaronder focale segmentale glomerulosclerose (FSGS), diabetische nefropathie, minimale veranderingsziekte en vliezige glomerulonefropathie, waarvoor betrouwbare podocyte ex vivo modellen nodig zijn om de pathologische mechanismen en mogelijke behandelingsbenaderingen voor deze ziekten te bestuderen 9,10. Podocyten kunnen ex vivo worden bestudeerd door klassieke primaire celkweek op basis van de isolatie van glomeruli door differentiële zeven11. Vanwege de terminaal gedifferentieerde toestand met beperkte proliferatiecapaciteit gebruiken de meeste onderzoekers echter muis- of menselijke ciPodocytencellijnen die temperatuurgevoelige varianten van het SV40 grote T-antigeen tot expressie brengen. Als alternatief worden ciPodocyten geïsoleerd uit transgene muizen met het SV40 Tag onsterfelijke gen 1,12.
CiPodocyten prolifereren bij 33 °C, maar komen tot groeistilstand en beginnen te differentiëren bij 37 °C13,14. Er moet rekening mee worden gehouden dat experimentele gegevens die met deze cellen zijn verkregen, met enige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd, omdat de cellen worden gegenereerd met behulp van een onnatuurlijke geninbrenging15. Omdat deze cellen een vereeuwigend gen herbergen, is de cellulaire fysiologie veranderd vanwege de voortdurende proliferatie12. Podocytencellijnen die door deze benadering worden gegenereerd, zijn onlangs in twijfel getrokken, omdat ciPodocyten van muizen, mensen en ratten minder dan 5% van synaptopopodie en nefrine op eiwitniveau tot expressie brengen, evenals NPHS1 en NPHS2 op mRNA-niveau in vergelijking met glomerulaire expressie16. Bovendien drukken de meeste podocytencellijnen geen nefrine17,18 uit. Chittiprol et al. beschreven ook een significant verschil in celmotiliteit en reacties op puromycine en doxorubicine in ciPodocyten16. Podocyten kunnen worden gevonden in urine na loslating van de GBM bij verschillende glomerulaire ziekten 19,20,21,22. Levensvatbare urinaire podocyten kunnen ex vivo worden gekweekt gedurende maximaal 2-3 weken, maar de meeste cellen ondergaan apoptose23,24. Interessant is dat podocyten niet alleen worden aangetroffen in de urine van patiënten met glomerulaire ziekte, maar ook in de urine van gezonde proefpersonen, hoogstwaarschijnlijk wanneer ze senescent-again zijn met een beperkt potentieel van replicatie in cultuur24. Bovendien is het van de urine afgeleide podocytenaantal beperkt en dedifferentiëren de cellen in cultuur, vertonen ze minder voetprocessen, veranderen ze van morfologie en hebben ze vooral een beperkte proliferatiecapaciteit. De expressie van podocyt-specifieke genen is afwezig, verdwijnt binnen enkele weken of varieert tussen deze celklonen. Sommige cellen die positief waren voor de podocyt-specifieke marker drukten samen de marker van tubulaire epitheelcellen of myofibroblasten en mesangiale cellen uit, wat dedifferentiatie en / of transdifferentiatie van de gekweekte urinaire podocyten suggereert24,25.
Onlangs is de generatie van ciPodocyt-cellijnen afgeleid van de urine van patiënten en gezonde vrijwilligers door transductie met een thermogevoelig SV40 groot T-antigeen en hTERT beschreven26. mRNA-expressie voor synaptopodia, nestine en CD2-geassocieerd eiwit werd gedetecteerd, maar podocine-mRNA was afwezig in alle klonen. Naast de problemen met urinaire podocyten bevatten deze cellen ook het ingebrachte onsterfelijke gen, wat resulteert in de hierboven besproken nadelen.
Daarentegen hebben door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) een enorm vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in meerdere celtypen onder de juiste omstandigheden. Het is al eerder aangetoond dat hiPSC's kunnen dienen als een bijna onbeperkte bron van podocyten27,28.
Hier wordt een tweestapsprotocol beschreven om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten van huidponsbiopten met daaropvolgende episomale herprogrammering in hiPSC's en een laatste differentiatie in hiPSC-afgeleide podocyten (figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Figuur 1: Protocol om patiëntspecifieke hiPSC-afgeleide podocyten te genereren. Grafisch overzicht van het protocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten van een huidbiopsie door herprogrammering in hiPSC's en differentiatie in podocyten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Als eerste stap werden somatische dermale fibroblasten ontgroeid uit een huidponsbiopsie en geherprogrammeerd tot hiPSC's met behulp van een integratievrije methode door elektroporatie met plasmiden die de transcriptiefactoren OCT3/4, KLF4, SOX2 en c-MYC 29,30,31 tot expressie brachten. Opkomende hiPSC-kolonies werden vervolgens geselecteerd en uitgebreid. Differentiatie begon met de inductie van de mesodermale afstamming door activering van de WNT-signaleringsroute, gevolgd door de generatie van nefronvoorlopercellen die nog steeds in staat waren om zich te vermenigvuldigen. Ten slotte werden de cellen gedifferentieerd tot podocyten. In deze procedure hebben we eerder gepubliceerde protocollen voor episomale herprogrammering voor het genereren van hiPSC's door Bang et al.32 en Okita et al.33 gewijzigd en gecombineerd, evenals een protocol voor de differentiatie van hiPSC's in podocyten door Musah et al.28,34,35.
Inderdaad, podocyten gegenereerd door ons protocol hadden een fenotype dat dichter bij podocyten in vivo lag, met betrekking tot de ontwikkeling van een duidelijk netwerk van primaire en secundaire voetprocessen en de expressie van podocyt-specifieke markers, zoals synaptopode, podocine en nefrine. Met het gebruik van hiPSC-afgeleide podocyten wordt de genetische achtergrond van de patiënt behouden tijdens herprogrammering en differentiatie. Dit maakt patiëntspecifieke podocytenziektemodellering mogelijk en de ontdekking van potentiële therapeutische stoffen ex vivo in een bijna onbeperkt celnummer. Bovendien is dit protocol minimaal invasief, kostenefficiënt, ethisch aanvaardbaar en kan het nieuwe wegen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m steriele filter</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>voor sterilisatie van differentiatiemedium</td></tr><tr><td>all-trans retinoic acid</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>supplement voor differentiatie</td></tr><tr><td>B27 supplement (50 x), serumvrij</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>supplement voor serum-vrij differentiatiemedium</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>extra optie van extracellulair matrixreagens gebruikt in coatingoplossing om celcultuurplastics te coaten geschikt voor hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>celcultuurplastics geschikt voor fibroblastcultuur</td></tr><tr><td>CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>supplement voor differentiatie</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC qualified matrix&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>extra optie van extracellulair matrixreagens gebruikt in coatingoplossing om celcultuurplastics te coaten geschikt voor hiPSC-cultuur (geoplost basement membrane matrix)</td></tr><tr><td>countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>om cellen te tellen</td></tr><tr><td>countess II FL&nbsp; Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>om cellen te tellen</td></tr><tr><td>cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>cryovials voor het invriezen van cellen</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>voor fibroblast invriesmedium</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>basismedium voor differentiatie</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>basismedium voor fibroblastmedium</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>fase contrast microscoop</td></tr><tr><td>fetal bovine serum premium, inactivated (FCS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P301902</td><td>serum voor fibroblastmedium, fibroblast invriesmedium en podocyte onderhoudsmedium</td></tr><tr><td>fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 &micro;L capacity, sterile</td><td>Fisherbrand</td><td>FB104</td><td>cuvette gebruikt voor electroporation/episomale reprogrammering van fibroblasten (4mm gap)</td></tr><tr><td>fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>montagemedium met dapi</td></tr><tr><td>gauge needle (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>voor het scheiden van hiPSC-kolonies in kleine stukken</td></tr><tr><td>human Recombinant Activin A Protein</td><td>78001.1</td><td>Stem cell technologies</td><td>supplement voor differentiatie</td></tr><tr><td>human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>supplement voor differentiatie</td></tr><tr><td>human VEGF-165 Recombinant Protein</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>supplement voor differentiatie</td></tr><tr><td>insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>supplement voor podocyte onderhoudsmedium</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>voor steriliteitstest van hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>commercieel mycoplasma detectiekit</td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Diagonal GmbH &amp; Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>microtube 1.5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>basismedium voor serum-vrij hiPSC-cultuurmedium</td></tr><tr><td>nalgene freezing container Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>om optimale invriescondities te garanderen</td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>abcam</td><td>ab 7481</td><td>voor preincubatieoplossing en antilichaamverdunning</td></tr><tr><td>nunc 24 well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>celcultuurplastics geschikt voor hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>nunc 48 well plates&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>celcultuurplastics geschikt voor hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>nunc 6 well plates&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>celcultuurplastics geschikt voor hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>nunc EasYDish Dishes 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>celcultuurplastics geschikt voor hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>celcultuurplastics geschikt voor hiPSC-cultuur</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Cryopreservation Medium</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>serum-vrij cryopreserveringsmedium voor cryopreservering van hiPSC en nephron progenitor cellen</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>elektroporeringsmedium&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>plasmid voor episomale reprogrammering</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>plasmid voor episomale reprogrammering</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK plasmid</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>plasmid voor episomale reprogrammering</td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>om bacteriële contaminatie te voorkomen</td></tr><tr><td>plastic coverslips</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>voor immunofluorescente kleuringen van hiPSCs en hiPSC-afgeleide podocyten</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>commercieel paraformaldehyde (4 %) voor fixatie van cellen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>basismedium voor podocyte onderhoudsmedium</td></tr><tr><td>staining chamber StainTray Black lid</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>enzymatische cell detachment-oplossing gebruikt voor dissociatie van hiPSCs</td></tr><tr><td>steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>gebruikt voor wassen en coaten</td></tr><tr><td>steriele water</td><td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>syringe zonder naald 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>om differentiatiemedium sterie

generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocyten zijn epitheelcellen die zich op de urineplaats van de glomerulaire filtratiebarrière bevinden en die bijdragen aan de selectieve filterfunctie van de glomerulus. Mutaties in podocyt-specifieke genen kunnen focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) veroorzaken, en podocyten worden ook beïnvloed in veel andere primaire en secundaire nefropathieën. Vanwege hun gedifferentieerde aard zijn primaire celkweekmodellen beperkt voor podocyten. Daarom worden gewoonlijk voorwaardelijk vereeuwigde cellen gebruikt. Deze voorwaardelijk vereeuwigde podocyten (ciPodocyten) hebben echter verschillende beperkingen: de cellen kunnen in cultuur dedifferentiëren, vooral wanneer ze confluentie bereiken, en verschillende podocyt-specifieke markers worden slechts licht of helemaal niet uitgedrukt. Dit brengt het gebruik van ciPodocyten en hun toepasbaarheid voor fysiologisch, pathofysiologisch en klinisch bereik in twijfel. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van menselijke podocyten - inclusief patiëntspecifieke podocyten - uit een huidponsbiopsie door episomale herprogrammering van dermale fibroblasten in hiPSC's en daaropvolgende differentiatie in podocyten. Deze podocyten lijken veel beter op in vivo podocyten in termen van morfologische kenmerken, zoals de ontwikkeling van voetprocessen en de expressie van de podocyt-specifieke marker. Ten slotte, maar belangrijk, houden deze cellen de mutaties van patiënten in stand, wat resulteert in een verbeterd ex vivo model om podocytenziekten en potentiële therapeutische stoffen te bestuderen in een geïndividualiseerde benadering.

Met dit stapsgewijze protocol dat episomale herprogrammering en differentiatie combineert, is het mogelijk om podocyten te genereren die de mutatie van een patiënt in een podocytenrelevant gen dragen. Dit maakt de analyse van ziektespecifieke podocytenveranderingen ex vivo mogelijk. De genetische achtergrond van de patiënt blijft tijdens het protocol behouden tijdens alle verschillende celstadia. Bovendien kan de beperking van onvoldoende celaantal terminaal gedifferentieerde niet-prolifererende podocyten worden overwonnen door hiPSC-afgeleide podocyten te gebruiken. Hoewel het enkele maanden duurt voordat hiPSC-podocyten worden gegenereerd uit ontgroeide dermale fibroblasten via herprogrammering in hiPSC's en daaropvolgende differentiatie in podocyten, is het mogelijk om cellen te bevriezen in drie verschillende stappen van het protocol (figuur 2). Invriezen is mogelijk voor fibroblasten, hiPSC's en nefronvoorlopercellen na differentiatie in nefronvoorloperdifferentiatiemedium gedurende 7 dagen. Daarom is het genereren van werkende celbanken en grootschalige experimenten mogelijk.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Figuur 2: Individuele stappen van het protocol door een fasecontrastmicroscoop. (A) Ontgroeide dermale fibroblasten. B) hiPSC-kolonievorming na herprogrammering. (C) Geselecteerde hiPSC-cultuur. (D) Mesodermcellen na 2 dagen differentiatie. (E) Nefronvoorlopercellen na 14 dagen differentiatie in nefron voorloperdifferentiatiemedium. (F) Terminale gedifferentieerde hiPSC-afgeleide podocyten. Schaalstaven vertegenwoordigen 300 μm (A,B,D-F) en 150 μm (C). De sneeuwvlok markeert mogelijke vriesstappen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Omdat de gegenereerde hiPSC-afgeleide podocyten een lang protocol doorlopen met drastische veranderingen met betrekking tot celtype en morfologie, is celkarakterisering verplicht. Celmorfologie, zoals grootte en celvorm, evenals groeigedrag, kan worden gevolgd met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Fibroblasten vertonen een lang spindelachtig fenotype met een grootte van 150 μm tot 300 μm (figuur 2A). Na herprogrammering ontstaan kolonies met 50 μm kleine hiPSC's. Deze kolonies vertonen verschillende grenzen en hiPSC's onderscheiden met een hoge kern-tot-lichaam verhouding en verhoogde proliferatiesnelheid (figuur 2C). Aangezien podocyten terminaal gedifferentieerde cellen zijn, neemt de proliferatiesnelheid af met progressieve differentiatie en verandert de celmorfologie in 300 μm grote stervormige podocyten met prominente voetprocessen (figuur 2F).
Confluentie is een kritiek punt van hiPSC-cultuur en spontane differentiatie kan optreden wanneer kolonies te dicht worden (figuur 3). Deze kolonies moeten worden verwijderd voordat ze passeren door de aangetaste delen van de kweekschaal te schrapen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Figuur 3: Voorbeelden van hiPSC's van verschillende kwaliteit. Fasecontrastbeelden van succesvol (A) geherprogrammeerde hiPSC-kolonies en (B) geselecteerde hiPSC's, evenals (C) spontane differentiatie, (D,E) niet-hiPSC-kolonies en (F) een te dichte hiPSC-cultuur. Schaalbalken vertegenwoordigen 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De verschillende celtypen van dit protocol moeten worden gevalideerd met betrekking tot de expressie van een specifieke marker. Na herprogrammering herwinnen hiPSC's pluripotentiecapaciteit en drukken ze proliferatie- en pluripotentiemarkers uit zoals SSEA4, OCT3/4 en Ki67 (figuur 4)38,39,40. Het is bekend dat herprogrammering, evenals de langdurige cultuur van hiPSC's en differentiatie, kan leiden tot een abnormaal karyotype, of liever mutaties kan induceren41. Daarom moet de genetische achtergrond van de gekweekte cellen in de loop van de tijd en bij verschillende passages worden gecontroleerd door g-banding en whole exome sequencing.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Figuur 4: Karakterisering van gegenereerde hiPSC's door immunofluorescentiekleuring. Karakterisering van gegenereerde hiPSC's door kleuring voor (A) de proliferatieve marker Ki67, evenals de pluripotentiemarkers (B) OCT3/4 en (C) SSEA4. Schaalstaven vertegenwoordigen 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Morfologisch gezien lijken hiPSC-afgeleide podocyten stervormig en drukken ze een duidelijk netwerk van lange primaire en secundaire voetprocessen uit in vergelijking met ciPodocyten (figuur 5). HiPSC-afgeleide podocyten drukken podocyt-specifieke markereiwitten zoals synaptopopoline, nefrine en podocine uit (figuur 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Figuur 5: Morfologie van hiPSC-afgeleide podocyten in vergelijking met ciPodocyten. Vergelijking van (A,B) hiPSC-afgeleide podocyten van een gezonde donor met (C,D) ciPodocyten met betrekking tot celmorfologie en filopodia met behulp van een fasecontrastmicroscoop (A,C) en scanningelektronenmicroscoop (B,D). Schaalstaven vertegenwoordigen 150 μm (A,C) en 20 μm (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Daarom maakt de vergelijking van hiPSC-afgeleide podocyten, niet alleen van gezonde donoren, maar ook van patiënten met mutaties in podocyt-specifieke genen, een geïndividualiseerde karakterisering van de mutatie van de patiënt ex vivo mogelijk.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Figuur 6: Karakterisering van een podocyt-specifieke marker in hiPSC-afgeleide podocyten en ciPodocyten. Vergelijking van (A-C) hiPSC-afgeleide podocyten van een gezonde donor met (D-F) ciPodocyten met betrekking tot podocyt-specifieke markereiwitten synaptopopodie (A,D), nefrine (B,E) en podocine (C,F). Schaalbalken vertegenwoordigen 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1. Samenstelling van alle celkweekmedia en -oplossingen die in het onderzoek zijn gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit manuscript beschrijft een tweestapsprotocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten via episomale herprogrammering in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en daaropvolgende differentiatie in podocyten.

Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

We beschrijven een protocol voor het genereren van menselijke podocyten door episomale herprogrammering van dermale fibroblasten in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze cellen lijken veel beter op in vivo podocyten dan vereeuwigde podocyten in termen van podocytenvoedselprocessen en expressie van podocytspecifieke marker. Podocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen.Daarom vermenigvuldigen deze cellen zich niet langer en is de primaire podocytenanalyse in celkweek beperkt. Hoewel het probleem van het beperkte celaantal werd overwonnen door voorwaardelijk vereeuwigde podocyten te gebruiken, vertonen deze podocyten een gededifferentieerd fenotype en gedrag, dat hun gebruik in fundamenteel onderzoek in twijfel trekt. Met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen podocyten in vitro worden gegenereerd in een bijna onbeperkt celaantal met typische podocytenmorfologie, inclusief verschillende voedselprocessen en expressie van podocytspecifieke marker.Bij het gebruik van de patiëntspecifieke stamcellen om te differentiëren in podocyten, is het mogelijk om de ziektespecifieke veranderingen van de cel ex vivo te bestuderen. In het geval dat de eerste huidbiopsie werd genomen van een patiënt met een genetische podocytenziekte. Podocyten gegenereerd met ons protocol zijn gepersonaliseerde zieke cellen die de mutatie van de patiënt dragen.Deze cellen vertegenwoordigen dus een verbeterd ex vivo model om podocytenziekten en potentiële therapeutische stoffen te bestuderen in een geïndividualiseerde benadering.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the protocol to derive human kidney podocytes from induced pluripotent stem cells through cell differentiation under defined chemical conditions. The generated podocytes can be used for nephrotoxicity testing and disease modeling.

Deriving Human Kidney Podocytes from Induced Pluripotent Stem Cells: A Procedure for Directed Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Stem Cells

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier wordt een chemisch gedefinieerd protocol gepresenteerd voor de afleiding van menselijke nierpodocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen met een hoge efficiëntie (&gt;90%) en onafhankelijk van genetische manipulaties of subpopulatieselectie. Dit protocol produceert het gewenste celtype binnen 26 dagen en kan nuttig zijn voor nefrotoxiciteitstests en ziektemodellering.

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Hier wordt een protocol gepresenteerd om een gepersonaliseerd orgaan-op-een-chip-systeem te ontwikkelen dat de structuur en functie van de nierglomerulaire filtratiebarrière samenvat door genetisch gematchte epitheel- en vasculaire endotheelcellen te integreren die zijn gedifferentieerd van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit bio-technische systeem kan nierprecisiegeneeskunde en aanverwante toepassingen bevorderen.

Isogene nierglomeruluschip ontworpen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel aggitation het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op nerual weefsel wordt uitgelegd.

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Leer hoe u patiënt-specifieke podocyten genereert uit huidbiopten via episomale reprogrammering naar hiPSCs. Deze methode biedt een verbeterd ex vivo model voor onderzoek naar nierziekten en gepersonaliseerde geneeskunde.

Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Meer video's verkennen