Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

Dit protocol beschrijft de methode van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. Dit protocol biedt een alternatief voor de huidige beeldvormings- en elektronenmicroscopietechnieken met superresolutie, met het voordeel dat het compatibel is met conventionele microscopen die in de meeste biologielaboratoria en in machinekernfaciliteiten worden aangetroffen. Het maakt gebruik van veelgebruikte technieken voor de meeste onderzoekslaboratoria om beelden te verkrijgen die driedimensionale reconstructie mogelijk maken.

Het protocol vergemakkelijkt de studie van structuren op nanoschaal in trypanosomatiden, waardoor een populatie cellen kan worden geïnspecteerd en het volledige volume van een interessante cel met hoge resolutie kan worden afgebeeld. Het is vooral nuttig voor wetenschapsspecifieke celtypen in voorbijgaande fasen van de celcyclus en differentiatie. Om nog meer resolutie te krijgen, zullen we de combinatie van ExM met superresolutie microscopische technieken gebruiken om resoluties onder de 20 nanometer te bereiken.

Begin met het bereiden van Trypanosoma cruzi epimastigote suspensie uit een logfasecultuur in LIT-medium aangevuld met 10%FCS. Centrifugeer de suspensie bij 5.000 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de pellet twee keer met PBS en suspendeer vervolgens opnieuw in 200 microliter PBS.

Plak de suspensie op een ronde afdekstrip van 12 millimeter bedekt met Poly-D-Lysine en incubeer deze 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u verknoping voorkomt. Verzamel het supernatans van een Vero-cel monolaag die vier dagen na infectie is geïnfecteerd met de trypomastigoten. Bepaal met behulp van een Neubauer-celtelkamer de concentratie van de trypomastigoten.

Centrifugeer de celsuspensie bij 7.000 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het spoelen en opnieuw suspenderen van de cellen in PBS, brengt u de celsuspensie over naar een met lysine gecoate dekglaasje en incubeert u het dekglaasje 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u cross-link voorkomt. Om amastigoten te verkrijgen van geïnfecteerde Vero-cellen, legt u een steriel rond dekglaasje van 12 millimeter op de bodem van een weefselkweekplaat met 24 putjes.

Bereid vervolgens een suspensie van Vero-cellen in DMEM aangevuld met 2% FCS en zaai 500 microliter van de suspensie in elk putje. Incubeer de plaat een nacht om de celbevestiging te garanderen. Was de cellen vervolgens twee keer met 500 microliter steriel PBS.

Voeg T.cruzi-trypomastigoten toe aan de cellen en incubeer zoals eerder gedurende zes uur. Begin met het toevoegen van 0,5 milliliter verknopingspreventieoplossing aan elk putje van een plaat met 24 putjes. Dompel vervolgens de 12 millimeter Poly-D-Lysine-gecoate dekglaasjes onder met aanhangende parasieten.

Nadat u de lege putjes met water hebt gevuld om verdamping te verminderen, sluit u de plaat af met een afdichtingsfilm en broedt u op. Om de monsters te geleren, zet u eerst een vochtige kamer in een petrischaal in elkaar door een afdichtingsfilm op tissuepapier te plaatsen. Maak het tissuepapier vervolgens nat met water en incubeer het gedurende 20 minuten bij min 20 graden Celsius om het af te koelen.

Leg de koele, vochtige kamer op ijs. Zuig vervolgens met een pasteurpipet van drie milliliter de verknopingspreventieoplossing op uit de putjes van de plaat met 24 putjes. Gebruik nu een pincet om de dekglaasjes te verwijderen en plaats ze op het tissuepapier met de parasieten naar boven gericht.

Neem 90 microliter monomere oplossing in een tube en voeg elk vijf microliter ontdooide TEMED en APS toe. Draai het mengsel gedurende twee tot drie seconden. Pipetteer 35 microliter van dit mengsel over de afdichtingsfilm voor elke dekglaasje en gebruik onmiddellijk een pincet om de dekglaasjes over de druppel te plaatsen met de parasieten naar beneden gericht.

Incubeer de vochtige kamer vijf minuten op ijs en vervolgens een uur bij 37 graden Celsius. Begin met het pipetteren van twee milliliter denaturatieoplossing in elk putje van een plaat met zes putjes. Breng de gellificeerde dekglaasjes met de parasieten van Trypanosoma cruzi over in de denaturatieoplossing en incubeer ze met zacht roeren.

Om het loslaten van de gel te bevorderen. Breng de gel met behulp van een metalen spatel voorzichtig over in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met één milliliter denaturatieoplossing. Incubeer de buis met een beveiligde dop op een verwarmingsblok.

Gebruik een P1000-pipet om de denaturatieoplossing uit de microcentrifugebuisjes op te zuigen. Breng de gel met een metalen spatel over in een petrischaaltje met 10 milliliter ultrapuur water en laat het 30 minuten intrekken. Gebruik een pasteurpipet voor eenmalig gebruik van drie milliliter om het ultrazuivere water in het schaaltje te vervangen en laat de gel een nacht ondergedompeld bij kamertemperatuur.

Meet de volgende dag de geldiameter met een schuifmaat om de uitzetting te berekenen. De monsters waren zichtbaar als een vlakke en doorschijnende gel die 4 tot 4,5 keer uitzette in water. Begin met de fluorescerende etikettering door de geëxpandeerde gelcirkels met de parasieten te wassen met PBS.

Gebruik een scheermesje om de cirkels in het midden in vierkanten van 10 bij 10 millimeter te snijden. Breng nu elk vierkant over naar een plaat met 12 putjes en incubeer het in 500 microliter van het primaire antilichaam verdund in 2%PBS en BSA, met schudden. Incubeer vervolgens de gelvierkanten in een plaat met zes putjes met twee milliliter PBS met 0,1% polysorbaat 20 gedurende 10 minuten, met schudden.

Nadat de gel is overgebracht naar een plaat met 12 putjes, voegt u 500 microliter secundair antilichaam toe in PBS met DAPI en 10 microgram per milliliter NHS-ester geconjugeerd aan de gewenste fluorofoor. Incubeer de gel gedurende 2,5 uur bij 37 graden Celsius onder zacht roeren. Na het driemaal wassen van de gel in PBS-polysorbaat 20 zoals eerder, breng de gel over in een petrischaaltje met ultrapuur water en incubeer gedurende 30 minuten.

Plaats een vierkant van 10 bij 10 millimeter van het geëxpandeerde gelstuk op een bodemschaal van 35 millimeter. Controleer de oriëntatie van de parasieten bij een vergroting van 10 of 20X. Beeld de monsters af in een confocale microscoop met een 63x olie-immersieobjectief, met een numerieke opening van 1,4.

Verkrijg Z-stacks, de breedte van elke Z-stap en empirisch bepaalde belichtingstijd per pixel, verkrijg vervolgens de signaalintensiteit en optimalisatie van acquisitietijden met behulp van de scanzoom voor effectieve vergroting, indien gewenst. Open de Z-stack met behulp van beeldverwerkingssoftware en groepeer de gestapelde afbeeldingen met behulp van de groep Z-projectoptie voor elk kanaal. Selecteer vervolgens de projectie met maximale intensiteit.

Voeg afbeeldingen samen met behulp van de tool Kanalen samenvoegen. Selecteer de kleur van elk kanaal en voeg de schaalbalk toe met behulp van de tool Schaalbalk in de verwerkingssoftware. De primaire expansie zorgde voor een effectieve resolutie van 70 nanometer, terwijl de secundaire expansie expansiefactoren van ongeveer 4,5 vertoonde.

Het kleuren van alle drie de in vitro levenscyclusstadia van T.cruzi met cytoskeletmarkers toonde de lokalisatie van het microtubulaire korset en flagellaire axoneem van het eiwit. Chromatinecondensatie werd duidelijk onderscheiden wanneer het werd gekleurd met DAPI. Immunolokalisatie van alfa-tubulinemarkers overlapte met pan-proteoomlabeling in epimastigoten toonde aan dat het basale lichaam gekleurd met anti-alfa-tubuline en FITC zich had gedeeld.

Pan-proteoometikettering hielp bij het identificeren van verschillende parasitaire structuren in alle fasen van de levenscyclus.