Name: Een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang. Dit model helpt onderzoekers de mechanismen van endocardiale fibroelastose te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) en Single Ventricle Expansion Fund (to I.F.) en een Marietta Blau-beurs van de OeAD-GmbH uit fondsen van het Oostenrijkse federale ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Onderzoek BMBWFC (aan G.G.).

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council. 2011. Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren: achtste editie. De dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Boston Children's Hospital.
Voorafgaand aan de operatie worden alle chirurgische instrumenten met stoom geautoclaveerd en wordt de gemodificeerde Krebs-Henseleit-buffer, met een eindconcentratie van 22 mmol/L KCl, bereid als een cardioplegische oplossing (tabel 1). De oplossing wordt gefilterd gesteriliseerd en een nacht bij 4 °C bewaard. Een chirurgische microscoop (12,5x) is vereist voor de heterotope neonatale harttransplantatieprocedure bij ratten.
1. Voorbereiding en anesthesie
<ol><li>Gebruik mannelijke/vrouwelijke Lewis-ratten met een gewicht van ongeveer 150 g (5-6 weken oud) als ontvangers.</li>
	<li>Scheer om te beginnen de buik van de rat royaal met een scheermes.</li>
	<li>Plaats de rat in een isofluraankamer en zet de zuurstofstroom aan met 2 l/min met 2% isofluraan totdat het dier goed verdoofd is maar nog steeds spontaan ademt. Injecteer 45 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine intraperitoneaal (IP), evenals 300 E/kg heparine. Bevestig de juiste verdoving met een teenknijptest. OPMERKING: Houd de spontane ademhaling en hartslag zorgvuldig in de gaten door palpatie van de borstkas om gedurende het hele proces een stabiele hemodynamische status te garanderen.</li>
	<li>Plaats voor intubatie de rat op een schuine plank (Figuur 1), zet de voortanden vast met een touwtje en plaats het hoofd naar de chirurg gericht.</li>
	<li>Plaats het licht aan de buitenkant van de nek op het gebied van de stembanden, pak de tong met twee vingers vast en duw deze lichtjes omhoog en naar links om optimaal zicht te bieden voor intubatie. Gebruik een canule van 18 G, 2 inch voor een rat van 100-150 g. Zet de intratracheale slang vast met tape. OPMERKING: Chirurgische loups met een vergroting van 3.5x worden aanbevolen voor intubatie.</li>
	<li>Sluit de intubatiecanule aan op de ventilator voor kleine dieren en pas de instellingen aan volgens de instructies van de fabrikant op basis van de grootte van het dier. NOTITIE: Gebruik de volgende instellingen voor een rat van 150 g: volumemodus; ademhalingsfrequentie, 55/min; ademvolume, 1,3 ml 50 % I/E-verhouding, maar dit kan indien nodig worden aangepast. Zorg voor een goede bilaterale en gelijkmatige beweging van de borstkas en dien isofluraan continu toe met 0,5%-2% via het beademingsapparaat.</li>
	<li>Plaats de rat op een verwarmingskussen (om de normale lichaamstemperatuur te behouden) in rugligging met de staart naar de chirurg gericht. Steriliseer de buik driemaal afwisselend met een betadine-oplossing en 70% ethanol. Dien oogglijmiddel toe en bedek de rat met een steriel chirurgisch laken, waarbij de buik onbedekt blijft.</li>
</ol>2. Chirurgische voorbereiding en heterotope transplantatie van het neonatale donorhart bij de ontvangende rat
<ol><li>Voer een laparotomie op de middellijn uit met een scalpel met 15 mesjes voor de incisie in de huid en gebruik een schaar om de voorste buikwand te openen, gevolgd door stompe belichting van de retroperitoneale abdominale aorta en inferieure vena cava (IVC) met wattenstaafjes.</li>
	<li>Mobiliseer de darmen (inclusief de dalende dikke darm) en plaats ze in de richting van het rechter bovenste kwadrant. Bedek de darmen met warm, in zout gedrenkt gaas. Gebruik retractors om een optimale belichting van de IVC en de abdominale aorta te garanderen.</li>
	<li>Voer een stompe dissectie uit van de infrarenale IVC en de abdominale aorta in de richting van de bifurcatie. Leg alle infrarenale vertakkingsslagaders en aders (bijv. inferieure mesenteriale slagader en lymfeklierslagaders) vast met een 10-0 nylon hechtdraad. OPMERKING: Er is een grote variabiliteit in de anatomie van deze zijtakken. Bewaak de hartslag en hartslag van de aorta visueel wanneer er geen andere hemodynamische monitoring beschikbaar is. Beoordeel elke 15 minuten de juiste diepte van de anesthesie door middel van een teenknijptest. Pas de isofluraanconcentratie dienovereenkomstig aan.</li>
	<li>Nadat het donorhart is geoogst bij een neonatale rat, levert u het uitgesneden hart in steriele omstandigheden af in een operatiebassin met Krebs-Henseleit-buffer op het operatieveld. Spoel het donorhart met tussenpozen met een ijskoude cardioplegische oplossing. OPMERKING: Wanneer een tweede chirurg beschikbaar is, moet het hart tegelijkertijd worden voorbereid, aangezien een tweede chirurg de totale anesthesietijd van het ontvangende dier en de ischemietijd van het donorhart verkort. Als er geen tweede chirurg beschikbaar is, bedek dan de buik van de ontvanger met warme zoutoplossing en houd het dier in de gaten tijdens de oogstprocedure.</li>
	<li>Breng vier kleine atraumatische vasculaire klemmen aan op de distale en proximale segmenten van de infrarenale aorta en IVC. Sluit indien nodig tijdelijk een ongunstig niervat af met een 7-0 zijden hechting en laat de hechting na de procedure los. Plaats een 10-0 nylon hechting verticaal op de voorwand van de aorta om de aortomie te vergemakkelijken. Voer een aortotomie uit met twee kleine horizontale sneden (wigvormig) met een microschaar door de hechting iets omhoog te trekken. OPMERKING: Om eventuele bloedstolsels te verwijderen, wordt het spoelen van het aortalumen met gehepariniseerde zoutoplossing aanbevolen.</li>
	<li>Plaats het donorhart aan de linkerkant (vanuit het perspectief van het dier) van de aorta en zet de infrarenale aorta van de ontvanger en de opgaande aorta van de donor van begin tot zij vast op de 12 uur en 6 uur posities van de aortomie met hechtingen. Ga verder met de derde en vierde hechting op de 3 uur en 9 uur posities, waarbij u het hart na de derde hechting voorzichtig naar de rechterkant van de aorta draait. Voltooi de arteriële anastomose door één tot twee hechtingen toe te voegen aan elke tussenruimte. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de stijgende aorta van de donor of de abdominale aorta van de ontvanger niet met een tang aanraakt bij het creëren van de anastomose om weefselbeschadiging te voorkomen.</li>
	<li>Draai de rat tegen de klok in, met het hoofd naar de linkerhand van de chirurg gericht. Verplaats de aorta van de donor naar de linkerkant van de abdominale aorta om optimaal zicht op de IVC mogelijk te maken.</li>
	<li>Voer een venotomie uit op de IVC, iets proximaal van de aorta-anastomose, met behulp van een 11-mesje voor punctie en een microschaar voor een adequate aanpassing van de grootte aan de diameter van de longstam van de donor. Spoel opnieuw het intracavale lumen met gehepariniseerde zoutoplossing.</li>
	<li>Begin met de veneuze anastomose tussen de IVC van de ontvanger en de longstam van de donor, wat het beste kan worden bereikt door onderbroken 11-0 nylon hechtingen op de achterwand van het vat te plaatsen, beginnend bij de 12 uur en 6 uur posities (gerelateerd aan de IVC), en plaats vervolgens een continue 11-0 nylon hechting op de voorwand (van de 6 uur naar de 12 uur positie).</li>
	<li>Bedek de anastomosen met kleine reepjes van een resorbeerbare gelatinespons en verwijder de microvasculaire klemmen die distaal beginnen. Gebruik een wattenstaafje om de sponzen lichtjes samen te drukken om een optimale hemostase te verkrijgen.</li>
	<li>Observeer hoe de kransslagaders van het transplantaat zich vullen op het moment dat de distale microvasculaire klemmen worden losgelaten en zorg ervoor dat het donorhart onmiddellijk begint te kloppen wanneer de proximale klem wordt losgelaten. OPMERKING: De levensvatbaarheid van het transplantaat kan intraoperatief worden gescoord van 0 tot 4 volgens een gewijzigde Stanford-score19 om een adequate transplantaatfunctie te bevestigen.</li>
	<li>Plaats de darmen terug in de buik door ervoor te zorgen dat de arteriële en veneuze anastomose niet wordt vervormd.</li>
	<li>Dien meloxicam (1 mg/kg) en ethiqa XR (0,65 mg/kg) subcutaan toe terwijl het dier volledig onder narcose is om postoperatieve analgesie vast te stellen. Sluit vervolgens de buikwand met een continue 5-0 resorbeerbare vicrylhechting voordat u de huid intracutaan sluit met een 6-0 resorbeerbare vicrylhechting. OPMERKING: Richtlijnen met betrekking tot veelvoorkomende fouten en het oplossen van problemen worden weergegeven in Tabel 2.</li>
</ol>3. Oogsten van het neonatale donorhart
<ol><li>Plaats de neonatale donorrat in een kamer die is geïnfuseerd met isofluraan (2%) voor sedatie. Dien ketamine (75 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) en heparine (300 E/kg) intraperitoneaal toe.</li>
	<li>Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen en plaats de rat in rugligging met de staart naar u toe gericht. Steriliseer de gehele thorax en buikwand driemaal afwisselend met betadine en 70% ethanol. Bedek de rat met een steriel chirurgisch laken.</li>
	<li>Verwijder met een 12,5x chirurgische microscoop de gehele voorste thoracale wand door te beginnen met een horizontale incisie met een scalpel met 15 mesjes bij de xyfoïde, gevolgd door verticale incisies lateraal tot aan de oksels aan beide zijden met een schaar. De voorste thoracale wand kan dan worden verwijderd door verder te gaan met een andere horizontale incisie direct onder de nek.</li>
	<li>Ontleed de IVC, rechter en linker vena cavae superior en longvaten met een schaar, en omcirkel en ligate vervolgens alle bloedvaten met een 7-0 zijden hechtdraad. Dien 3 ml ijskoude, kaliumrijke Krebs-Henseleit-oplossing toe aan de rechter boezem door de IVC aan te prikken met een naald van 30 G en het middenrif lichtjes naar beneden te duwen met een pincet.</li>
	<li>Knip de IVC, SVC's, longvaten en aorta met een schaar. Doorsnijd de longslagaders zo ver mogelijk en de aorta distaal van de brachiocephalische stam om de juiste lengte te garanderen met behulp van een scalpel met 11 mesjes.</li>
	<li>Scheid de longstam en de aorta ascendens met een microschaar en spoel het hart met een ijskoude cardioplegische oplossing met een spuit van 3 ml.</li>
</ol>4. Herstel van de ontvanger en controle van het transplantaat
<ol><li>Geef de rat na de operatie ruim de tijd om wakker te worden, wat meestal gebeurt in een tijdsbestek van 15 minuten, en laat hem herstellen op een verwarmingskussen. OPMERKING: Er zijn geen antibiotica nodig vanwege het zeer lage risico op infectie en om het experimentele model niet in gevaar te brengen, en er wordt geen beperking tot voedsel of water toegepast.</li>
	<li>Controleer na transplantatie dagelijks de transplantaatfunctie door palpatie van het getransplanteerde hart, maar bedenk dat dit soms moeilijk te beoordelen kan zijn vanwege de darmoverlay. OPMERKING: Abdominale echocardiografie kan de levensvatbaarheid van het transplantaat nauwkeuriger meten. Voor echocardiografie verdooft u de rat lichtjes met isofluraan (1-2%) ingeademd door een neuskegel en plaatst u deze op een verwarmingskussen. Echocardiografie wordt meestal uitgevoerd op postoperatieve dag (POD) 1, POD 7 en POD 14. Om de hartslag en contractiliteit te kunnen beoordelen, kan men gemakkelijk lange- en korte-asbeelden verkrijgen (Figuur 2A, B). Om de anastomosen te evalueren, gebruikt u Doppler-echocardiografie (Figuur 3A) en bevestigt u de vorming van EFE-weefsel zoals gezien als een echoheldere endocardiale laag in de linkerventrikelholte (Figuur 3B, C).</li>
</ol>

In vivo harttransplantatie om de overgang van endotheel naar mesenchymaal te bestuderen

<ol><li>Lurie, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+concepts+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiology+in+the+Young%22%5BJournal%5D)">Changing concepts of endocardial fibroelastosis.</a> Cardiology in the Young. 20 (2), 115-123 (2010).</li>
<li>Crucean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+hypoplastic+left+heart+syndrome+from+a+developmental+and+morphological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138(2017).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+fibroelastosis+is+caused+by+aberrant+endothelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition.</a> Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Illigens, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+prevents+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy.</a> Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 565-577 (2018).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+A+novel+mechanism+of+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis.</a> American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).</li>
<li>Johnson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+as+a+cause+of+endocardial+fibroelastosis+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+Archives+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy.</a> AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).</li>
<li>Shimada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distention+of+the+immature+left+ventricle+triggers+development+of+endocardial+fibroelastosis%3A+An+animal+model+of+endocardial+fibroelastosis+introducing+morphopathological+features+of+evolving+fetal+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome.</a> Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).</li>
<li>Weixler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+disturbances+and+the+development+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).</li>
<li>Purevjav, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulette+mutations+are+associated+with+dilated+cardiomyopathy+and+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).</li>
<li>Friehs, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">An animal model of endocardial fibroelastosis.</a> Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).</li>
<li>Emani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staged+left+ventricular+recruitment+after+single-ventricle+palliation+in+patients+with+borderline+left+heart+hypoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).</li>
<li>Hickey, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+left+ventricular+outflow+tract+obstruction%3A+The+disproportionate+impact+of+biventricular+repair+in+borderline+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).</li>
<li>Oh, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+flow+conditions+promote+endocardial+fibroelastosis+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%2C+which+is+responsive+to+losartan+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment.</a> JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).</li>
<li>Blanchard, J. M., Pollak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+perfusion+and+storage+of+heterotopic+heart+transplants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice.</a> Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).</li>
<li>Kokudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+is+required+for+TGFbeta-induced+endothelial-mesenchymal+transition+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A mouse model of endocardial fibroelastosis.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).</li>
<li>Kovacic, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+to+mesenchymal+transition+in+cardiovascular+disease%3A+JACC+state-of-the-art+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).</li>
<li>Derynck, R., Zhang, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad-dependent+and+Smad-independent+pathways+in+TGF-beta+family+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling.</a> Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+design%2C+execution%2C+and+reporting+of+animal+atherosclerosis+studies%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).</li>
</ol>

Dit diermodel van heterotope transplantatie van een neonataal donorrattenhart in de buik van de ontvanger creëert de mogelijkheid om EndMT-afgeleide fibrose te bestuderen door middel van gedetailleerde histologische weefselevaluatie, regulerende signaalroutes te identificeren en behandelingsopties te testen. Aangezien EndMT het onderliggende mechanisme is voor fibrotische hartziekten, heeft dit model grote waarde op het gebied van pediatrische hartchirurgie en daarbuiten. In dit model kunnen veel factoren de uitkomst van...

Endocardiale fibroelastose (EFE), gedefinieerd door de ophoping van collageen en elastische vezels in het subendocardiale weefsel, presenteert zich als een parelachtig of ondoorzichtig verdikt endocardium; EFE ondergaat de meest actieve groei tijdens de foetale periode en de vroege kindertijd1. In een autopsiestudie werd 70% van de gevallen met hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS) geassocieerd met de aanwezigheid van EFE2.
Cellen die markers voor fibroblasten tot expressie brengen, zijn de belangrijkste celpopulatie in EFE, maar deze cellen brengen tegelijkertijd ook endocardiale endotheliale markers tot expressie, wat een indicatie is van de oorsprong van deze EFE-cellen. Onze groep heeft eerder vastgesteld dat het onderliggende mechanisme van EFE-vorming een fenotypische verandering van endocardiale endotheelcellen naar fibroblasten inhoudt door middel van endotheel-naar-mesenchymale overgang (EndMT)3. EndMT kan worden gedetecteerd met behulp van immunohistochemische dubbele kleuring voor endotheelmarkers zoals cluster of differentiation (CD) 31 of vasculaire endotheliale (VE)-cadherine (CD144) en fibroblastmarkers (bijv. alfa-gladde spieractine, α-SMA). Verder hebben we eerder ook de regulerende rol van de TGF-ß-route in dit proces vastgesteld met activering van de transcriptiefactoren SLUG, SNAIL en TWIST3.
EndMT is een fysiologisch proces dat optreedt tijdens de embryonale cardiale ontwikkeling en leidt tot de vorming van de septa en kleppen van endocardiale kussens4, maar het veroorzaakt ook orgaanfibrose bij hartfalen, nierfibrose of kanker en speelt een sleutelrol bij vasculaire atherosclerose 5,6,7,8. EndMT bij hartfibrose wordt voornamelijk gereguleerd via de TGF-β-route, zoals wij en anderen hebben gemeld 3,9. Er zijn verschillende stimuli beschreven om EndMT te induceren: ontsteking10, hypoxie11, mechanische veranderingen 12 en stroomstoornissen, waaronder veranderingen van de intracavitaire bloedstroom 13, en EndMT kan ook een gevolg zijn van een genetische ziekte 14.
Dit diermodel is ontwikkeld met behulp van de belangrijkste componenten van cardiale EFE-ontwikkeling, namelijk onvolwassenheid en veranderingen van de intracavitaire bloedstroom, met name stroomstagnatie. Onvolwassenheid werd vervuld door neonatale rattenharten als donoren te gebruiken, aangezien bekend is dat neonatale ratten direct na de geboorte onvolwassen zijn. Heterotope harttransplantatie bood de mogelijkheid van intracavitaire stroombeperking15.
Vanuit klinisch oogpunt maakt dit diermodel het mogelijk om de impact van EndMT op de groeiende linker hartkamer (LV) beter te onderzoeken. De groeibeperking die wordt opgelegd aan het foetale en neonatale hart door EndMT-geïnduceerde EFE-formatie16 sluit patiënten met obstructies van het linkerventrikeluitstroomkanaal (LVOTO) uit, zoals congenitale kritische aortastenose en hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS), uit van curatief anatomisch biventriculair chirurgisch herstel17. Dit diermodel vergemakkelijkt de studie van de cellulaire mechanismen en regulatie van weefselvorming via EndMT en maakt het mogelijk om farmacologische behandelingsopties te testen 3,18.
Transabdominale echocardiografie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid, contractiliteit en doorgankelijkheid van het transplantaat van de anastomosen te controleren. Na euthanasie kan EFE-vorming binnen 3 dagen na transplantatie macroscopisch worden waargenomen. EFE-weefsel vertoont dezelfde histopathologische kenmerken als menselijk EFE-weefsel van patiënten met LVOTO.
Daarom kan dit diermodel, hoewel ontwikkeld voor pediatrisch gebruik in het spectrum van HLHS, worden toegepast bij het bestuderen van verschillende ziekten op basis van het moleculaire mechanisme van EndMT.

<table><tbody><tr><td>Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000</td><td>CWE, Inc.</td><td>12-03100</td><td>kleine dierventilator</td></tr><tr><td>aSMA</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>Antilichaam voor immunohistologie</td></tr><tr><td>Axio observer Z1&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>invers microscoop</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;Solution</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>367618150092</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-80069</td><td>Antilichaam voor immunohistologie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Antilichaam voor immunohistologie</td></tr><tr><td>DemeLON Nylon black 10-0</td><td>DemeTECH</td><td>NL76100065F0P</td><td>10-0 Nylon draad</td></tr><tr><td>ETFE IV Catheter, 18G x 2</td><td>TERUMO SURFLO</td><td>SR-OX1851CA</td><td>intubatiecanule</td></tr><tr><td>Micro Clip 8mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6471</td><td>microvasculaire klemmen</td></tr><tr><td>Nylon black monofilament 11-0</td><td>SURGICAL SPECIALTIES CORP</td><td>AA0130</td><td>11-0 Nylon</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Inbeddingsmedium voor ingevroren weefselmonster</td></tr><tr><td>p-SMAD2/3</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-110155</td><td>Antilichaam voor immunohistologie</td></tr><tr><td>Rodent, Tilting WorkStand</td><td>Hallowell EMC.</td><td>000A3467</td><td>schuine plank voor intubatie</td></tr><tr><td>Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9201231</td><td>Zijdedraad</td></tr><tr><td>Slug/Snail</td><td>Abcam</td><td>ab180714</td><td>Antilichaam voor immunohistologie</td></tr><tr><td>Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>5-0 Vicryl</td></tr><tr><td>Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"</td><td>Ethicon</td><td>J492G</td><td>6-0 Vicryl</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab231227</td><td>Antilichaam voor immunohistologie</td></tr><tr><td>Zeiss OPMI 6-SFR</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Chirurgisch microscoop</td></tr><tr><td>Zen, Blue Edition, 3.6</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td><td>invers microscoopsoftware</td></tr></tbody></table>

een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang

A Neonatal Heterotopic Rat Heart Transplantation Model for the Study of Endothelial-to-Mesenchymal Transition

Endocardiale fibroelastose (EFE), gedefinieerd door accumulatie van subendocardiaal weefsel, heeft grote gevolgen voor de ontwikkeling van de linker hartkamer (LV) en sluit patiënten met congenitale kritische aortastenose en hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS) uit van curatief anatomisch biventriculair chirurgisch herstel. Chirurgische resectie is momenteel de enige beschikbare therapeutische optie, maar EFE komt vaak terug, soms met een nog meer infiltratief groeipatroon in het aangrenzende myocardium.
Om de onderliggende mechanismen van EFE beter te begrijpen en therapeutische strategieën te onderzoeken, werd een diermodel ontwikkeld dat geschikt is voor preklinische tests. Het diermodel houdt er rekening mee dat EFE een ziekte van het onvolgroeide hart is en geassocieerd is met stroomstoornissen, zoals ondersteund door klinische observaties. De heterotope harttransplantatie van neonatale donorharten van ratten vormt dus de basis voor dit model.
Een neonataal rattenhart wordt getransplanteerd in de buik van een adolescente rat en verbonden met de infrarenale aorta en inferieure vena cava van de ontvanger. Terwijl perfusie van de kransslagaders de levensvatbaarheid van het donorhart behoudt, induceert stroomstagnatie binnen de LV EFE-groei in het zeer onvolgroeide hart. Het onderliggende mechanisme van EFE-vorming is de overgang van endocardiale endotheelcellen naar mesenchymale cellen (EndMT), wat een goed beschreven mechanisme is van de vroege embryonale ontwikkeling van de kleppen en septa, maar ook de belangrijkste oorzaak van fibrose bij hartfalen. EFE-vorming kan binnen enkele dagen na transplantatie macroscopisch worden waargenomen. Transabdominale echocardiografie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid, contractiliteit en doorgankelijkheid van het transplantaat van de anastomosen te controleren. Na euthanasie wordt het EFE-weefsel geoogst en vertoont het dezelfde histopathologische kenmerken als menselijk EFE-weefsel van HLHS-patiënten.
Dit in vivo model maakt het mogelijk om de mechanismen van EFE-ontwikkeling in het hart te bestuderen en behandelingsopties te testen om deze pathologische weefselvorming te voorkomen en biedt de mogelijkheid voor een meer algemeen onderzoek van EndMT-geïnduceerde fibrose.

Levensvatbaarheid en afranseling van het transplantaat In dit werk werd de levensvatbaarheid van het transplantaat visueel beoordeeld nadat alle klemmen waren verwijderd en werd een geschatte reperfusietijd van 10-15 minuten toegestaan met een open buik voor observatie van het transplantaat. Hetzelfde scoresysteem om de levensvatbaarheid van het transplantaat objectief te verifiëren, werd gebruikt voor visuele beoordeling aan het einde van de operatie en voor de echocardiografie op POD 1, POD 7 en POD...

Dit werk presenteert een diermodel van endotheliale-naar-mesenchymale overgangsgeïnduceerde fibrose, zoals te zien is bij aangeboren hartafwijkingen zoals kritieke aortastenose of hypoplastisch linkerhartsyndroom, wat gedetailleerde histologische weefselevaluatie, de identificatie van regulerende signaalroutes en het testen van behandelingsopties mogelijk maakt.

Een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang

Endocardial fibroelastosis (EFE), defined by subendocardial tissue accumulation, has major impacts on the development of the left ventricle (LV) and ...

Endocardiale fibro-elastose belemmert de groei van het linkerventrikel en verhindert biventrikelchirurgisch herstel voor patiënten met congenitale kritische aortastenose en hypoplastisch linkerhartsyndroom. Hoewel chirurgische resectie momenteel de enige beschikbare behandelingsoptie is, komt EFE vaak terug. Daarom wilden we de mechanismen achter EFE onderzoeken en nieuwe therapeutische strategieën ontwikkelen met behulp van een diermodel.De belangrijkste ontwikkelingen op het gebied van EndMT-onderzoek zijn beperkt tot celkweekmodellen die inherente beperkingen hebben, en het onderzoek is belemmerd door een gebrek aan in vivo modellen. Onze groep heeft eerder vastgesteld dat het onderliggende mechanisme van EFE-vorming een fenotypische verandering van endocardiale endotheelcellen naar fibroblasten inhoudt, een proces dat endotheliale naar mesenchymale overgang wordt genoemd. Dit diermodel maakt een meer algemeen onderzoek mogelijk van EndMT-geïnduceerde fibrose in het hart, terwijl andere modellen zijn ontworpen om EndMT te induceren door middel van genetische modificaties, hypertensie of dieetbeperkingen.Omdat EFE vaak terugkeert na primaire resectie, soms met een nog meer infilt

a-neonatal-heterotopic-rat-heart-transplantation-model-for-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video toont de orthotope aorta transplantatie model als een eenvoudig model om de ontwikkeling van transplantatie vasculopathie (TVP) studie bij ratten.

Orthotope Aorta Transplantatie: Een Rat Model voor de ontwikkeling van chronische vasculopathie Study

Het murine cervicale harttransplantatie model is geschikt voor immunologische en ischemie-reperfusie schade studies. We pasten de procedure met een niet-hechtingsmanchet techniek en uitgevoerd meer dan 1000 succesvolle transplantaties met deze benadering.  Hierin geven we meer details van deze techniek om de video te vullen.

Muizen Baarmoederhalskanker harttransplantatie Model met een aangepaste manchet Techniek

Om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neotissue vorming en stenose ontwikkeling in tissue engineered hartkleppen begrijpen, een muizenmodel van heterotopische hartklep transplantatie werd ontwikkeld. Een pulmonale hartklep werd getransplanteerd naar ontvanger via de heterotopische harttransplantatie techniek.

Transplantatie van Pulmonary Valve een muis model van Heterotope Heart Transplantation

We beschrijven een model van heterotopische buikharttransplantatie bij ratten, wat wijzigingen van de huidige strategieën impliceert, die leiden tot een vereenvoudigde chirurgische aanpak. Daarnaast beschrijven we een nieuw afstotingsmodel door in-ear injectie van vitale hartspiercellen, waardoor verdere transplantatie immunologische analyses bij ratten mogelijk zijn.

Een immunologisch model voor heterotopische hart- en hartspierceltransplantatie bij ratten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de transplantatie van aortaklepblaadjes onder de niercapsule om de studie van alloreactiviteit van hartkleppen mogelijk te maken.

Een vereenvoudigd model voor heterotopische hartkleptransplantatie bij knaagdieren

Het huidige protocol beschrijft aortacantnulatie en retrograde perfusie van het ex-vivo neonatale muizenhart.  Een tweepersoonsstrategie, met behulp van een ontleedmicroscoop en een stompe kleine naald, maakt betrouwbare cannulatie mogelijk. Kwantificering van longitudinale contractiele spanning wordt bereikt met behulp van een krachttransducer die is verbonden met de top van de linker ventrikel.

Aangepaste techniek voor het gebruik van neonatale muizenharten in het Langendorff-preparaat

In het huidige protocol wordt een muisharttransplantatiemodel gebruikt voor het onderzoeken van het mechanisme van cardiale allograftafstoting. In dit heterotope harttransplantatiemodel wordt de operatie-efficiëntie verbeterd en wordt de overleving van harttransplantaten verzekerd door een cervicale end-to-end anastomose van hartimplantatie met behulp van een gemodificeerde Cuff-techniek.

Een aangepaste manchettechniek voor muis cervicaal heterotopisch harttransplantatiemodel

Deze studie toont een reproduceerbare heterotope abdominale harttransplantatietechniek bij ratten die beginners kunnen leren en uitvoeren. Bovendien wordt een nieuw aorta-regurgitatiemodel bij ratten gegenereerd door heterotope abdominale harttransplantatie uit te voeren en de aortaklep van de donor te beschadigen met behulp van een geleidedraad na het oogsten.

Gemodificeerde heterotope abdominale harttransplantatie en een nieuw aorta-regurgitatiemodel bij ratten

Hier presenteren we een beoordelingsprotocol van een heterotopisch geïmplanteerd hart na normotherm ex situ behoud in het rattenmodel.

Rattenmodel van Normothermische ex-situ perfuseerde heterotope harttransplantatie

Dit protocol presenteert een vereenvoudigde, end-to-side hechtingsanastomosetechniek voor muis-cervicale harttransplantatie, en biedt een robuust en reproduceerbaar model voor het bestuderen van transplantatie-immunologie.

Cervicale heterotopische muisharttransplantatie met behulp van end-to-side anastomosetechniek om transplantatie-immunologie te bestuderen

Leer een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang. Dit model helpt onderzoekers de mechanismen van endocardiale fibroelastose te begrijpen.

Een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang

Meer video's verkennen