Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen
2 juni 2023
Waterstofperoxide (H2O2) is zowel een bron van oxidatieve schade als een signaalmolecuul. Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale H 2 O2kan worden gemeten met behulp van mitochondriën-gerichte HyPer7 (mtHyPer7), een genetisch gecodeerde ratiometrische biosensor, in levende gist. Het beschrijft hoe beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd en kwantitatieve cellulaire en subcellulaire analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software.
Mitochondriën zijn organellen in cellen die energiemobilisatie, centraal metabolisme, productie van vitale macromoleculen, calciumopslag en signaaltransductie vergemakkelijken. Als gevolg hiervan spelen ze een cruciale rol bij de cellulaire functie, fitheid en levensduurcontrole. Ons onderzoek richt zich op het onderzoeken van de impact van mitochondriën op veroudering met behulp van de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae als modelorganisme.
Beeldvorming van levende cellen is ons beste hulpmiddel om variatie in de mitochondriale functie te observeren. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van een genetisch gecodeerde metrische spectrale verschuivende biosensor genaamd mitochondriaal HyPer7. mtHyPer7 detecteert waterstofperoxide, een reactieve zuurstofsoort, die cellulaire bestanddelen kan beschadigen, maar ook functioneert als een signaalmolecuul in mitochondriën van levende cellen.
mtHyPer7 heeft een hoge affiniteit voor waterstofperoxide en een lage gevoeligheid voor pH. Het is geïntegreerd in het gistgenoom, wat resulteert in een stabiele en consistente expressie in gistcelpopulaties. Ten slotte is het kwantitatief gericht op mitochondriën en heeft het geen detecteerbaar effect op de cellulaire of mitochondriale functie of fitheid.
Biosensoren zoals mtHyPer7 zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van de mitochondriale functie bij subcellulaire resolutie, voor het vinden van mechanismen die ten grondslag liggen aan de mitochondriale kwaliteitscontrole en voor het onderzoeken hoe dat proces de celconditie, voeding en levensduur beïnvloedt. De mtHyPer7-kleuring zorgt voor consistente arbeid in tegenstelling tot organische kleurstoffen die worden gebruikt voor de detectie van reactieve zuurstofsoorten. Vergeleken met FRET-gebaseerde sensoren is mtHyPer7 compacter en vermijdt het problemen zoals cross-excitatie en bleed through, evenals de precieze positionering en de oriëntatievereisten voor FRET.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de mitochondriale functie in de knopdijsgist Saccharomyces cerevisiae, met focus op de rol van waterstofperoxide (H2O2) als zowel een beschadigend agens als een signaalmolecuul. Met behulp van een genetisch gecodeerde ratiometrische biosensor, mtHyPer7, beschrijven de onderzoekers een methode om mitochondriale H2O2 kwantitatief te meten in levende cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Mitochondriale functie
- Oxidatieve stress
- Aging in gist
Achtergrond
- Mitochondria zijn essentieel voor cellulaire energieproductie en signalering.
- H2O2 kan oxidatieve schade veroorzaken maar werkt ook in signaalroutes.
- Mitochondriale fitheid is gekoppeld aan cellevensduur en gezondheid.
Gebruikte methoden
- Live cel beeldvorming met mtHyPer7 biosensor
- Modelorganisme: Saccharomyces cerevisiae
- Fluorescentie microscopie voor kwantitatieve analyse
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van mitochondriale H2O2 niveaus in levende gistcellen.
- Optimale omstandigheden voor beeldvorming en beeldanalyse vastgesteld.
- Aangetoond dat mtHyPer7 de cellulaire functie of fitheid niet beïnvloedt.
Conclusies
- Deze studie toont een betrouwbare methode voor het meten van mitochondriale H2O2 en de implicaties hiervan voor cellulaire gezondheid.
- Het draagt bij aan het begrip van mitochondriale kwaliteitscontrole en de effecten ervan op veroudering.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of mitochondrial hydrogen peroxide in live yeast cells enables precise interrogation of mitochondrial redox status, a key determinant in cellular health and disease modeling. The mtHyPer7 biosensor provides robust, reproducible readouts for oxidative stress, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. This capability enhances predictive confidence for mitochondrial function studies relevant to aging, metabolic disorders, and cellular quality control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial H2O2 to clarify redox-driven mechanisms.
- Supports functional validation of mitochondrial quality control pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing signaling from damaging oxidative events.
- Provides stable, genome-integrated biosensor expression for consistent biological interrogation.
Screening & Assay Development
- Delivers quantitative, ratiometric outputs suitable for assay standardization and reproducibility.
- Prepares validated yeast models for compound screening targeting mitochondrial redox modulation.
- Enables high-content imaging workflows with robust signal stability and minimal background interference.
- Supports scalable, platform-ready readouts for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial redox measurements with disease-relevant phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of mitochondrial-targeted interventions.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement decisions in mitochondrial research portfolios.
- Facilitates biomarker development for oxidative stress and mitochondrial dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
The mtHyPer7 imaging workflow integrates from early discovery through assay development and preclinical research, supporting hypothesis-driven studies and translational continuity.
- Discovery Biology: Quantitative biosensor imaging enables hypothesis testing of mitochondrial redox mechanisms and pathway mapping.
- Screening: Ratiometric outputs and stable expression support reproducible, scalable assay development for compound screening.
- Analytics: Enables robust statistical comparison of mitochondrial H2O2 levels across conditions and cell populations.
- Translational Research: Provides disease-relevant, quantitative endpoints for preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Genome-integrated biosensor lines and open-source analysis scripts facilitate cross-project and cross-team adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in mitochondrial research programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative fluorescence analysis.
- Needs access to spinning-disk confocal microscopy and compatible analysis software (e.g., Fiji/ImageJ).
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and analysis scripts for reproducibility.
- Adaptable to other biosensors and model systems with protocol optimization.
- Dependent on consistent genome integration and expression for reliable outputs.
