Name: Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren met behulp van sub-mitochondriale vesikelvorming en dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze techniek helpt onderzoekers de rol van CQD1 en het MICOS-complex te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.E.H. erkent de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projectnummer 413985647, voor financiële steun. De auteurs danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians Universiteit, München, voor zijn genereuze en uitgebreide steun. We zijn Walter Neupert dankbaar voor zijn wetenschappelijke inbreng, nuttige discussies en voortdurende inspiratie. J.F. bedankt de Graduate School Life Science Munich (LSM) voor de steun.

1. Buffers en voorraadoplossingen
<ol><li>Maak een oplossing van 1 M 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) in gedeïoniseerd water, pH 7,4. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 500 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in gedeïoniseerd water, pH 8.0. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid 2,4 M sorbitol in gedeïoniseerd water. Na het autoclaveren bij kamertemperatuur bewaren.</li>
	<li>Bereid 2,5 M sacharose in gedeïoniseerd water. Na het autoclaveren bij kamertemperatuur bewaren.</li>
	<li>Bereid 200 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in isopropanol. Bewaren bij -20 °C. LET OP: PMSF is giftig bij inslikken en veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel. Adem het stof niet in en draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.</li>
	<li>Bereid 72% trichloorazijnzuur (TCA) in gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C. LET OP: TCA kan irritatie van de luchtwegen, ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Adem het stof niet in en draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.</li>
	<li>Bereid de SM-buffer voor: 20 mM MOPS en 0,6 M sorbitol, pH 7,4.</li>
	<li>Bereid de zwellingsbuffer voor: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF en proteaseremmercocktail, pH 7,4.</li>
	<li>Bereid de sucrosegradiëntbuffers voor: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M en 1,3 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4. OPMERKING: Alle buffers kunnen worden opgeslagen bij 4 °C; het wordt echter aanbevolen om de sucrosehoudende buffers op te slaan bij -20 °C om schimmelgroei te voorkomen. De proteaseremmers moeten voor gebruik vers worden toegevoegd.</li>
</ol>2. Generatie van submitochondriale blaasjes
<ol><li>Isoleer ruwe gistmitochondriën vers volgens vastgestelde protocollen34,35. OPMERKING: Voor dit experiment werden mitochondriën geïsoleerd uit Saccharomyces cerevisiae. Het genereren van gradiëntzuivere mitochondriën zonder andere organellen is niet nodig.</li>
	<li>Resuspendeer 10 mg vers geïsoleerde mitochondriën in 1,6 ml SM-buffer (4 °C) door te pipetteren (Figuur 2, stap 1).</li>
	<li>Breng de mitochondriale suspensie over in een voorgekoelde erlenmeyer van 100 ml.</li>
	<li>Voeg langzaam 16 ml zwelbuffer toe met behulp van een glazen pipet van 20 ml. Breng tijdens de toevoeging constant mild roeren op ijs aan. Deze osmotische behandeling resulteert in wateropname in de matrixruimte. De zwelling van het mitochondriale binnenmembraan zal het buitenmembraan verstoren. Beide membranen blijven echter in contact op de contactplaatsen9 (Figuur 2, stap 2).</li>
	<li>Incubeer de monsters onder constant mild roeren gedurende 30 minuten op ijs.</li>
	<li>Voeg langzaam 5 ml 2,5 M sucrose-oplossing toe met behulp van een glazen pipet van 5 ml om de sacharoseconcentratie in de monsters te verhogen tot ongeveer 0,55 M. Deze osmotische behandeling resulteert in een wateruitvloeiing uit de matrix36. De krimp van het binnenmembraan is bedoeld om de afstand tot de resterende fragmenten van het buitenmembraan te maximaliseren. Dit verkleint de kans op het genereren van kunstmatige hybride blaasjes van binnen- en buitenmembranen door middel van sonicatie (Figuur 2, stap 3).</li>
	<li>Incubeer de monsters onder licht roeren gedurende 15 minuten op ijs.</li>
	<li>Onderwerp de mitochondriën aan sonicatie om submitochondriale membraanblaasjes te genereren (Figuur 2, stap 4).<ol><li>Breng de mitochondriale suspensie over naar een voorgekoelde rozetcel.</li>
		<li>Sonificeer de mitochondriale suspensie met een amplitude van 10% gedurende 30 s terwijl de rozetcel wordt gekoeld in een ijsbad.</li>
		<li>Laat de suspensie 30 s rusten in een ijsbad.</li>
		<li>Herhaal stap 2.8.2 en stap 2.8.3 nog drie keer. NOTITIE: De sonicatiecondities zijn afhankelijk van de gebruikte sonicator. Optimalisatie zal nodig zijn voor individuele machines. Sonicatie die te hard is, zal leiden tot de kunstmatige vorming van blaasjes die bestaan uit mitochondriale binnen- en buitenmembranen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Scheiding van submitochondriale blaasjes
<ol><li>Scheid de gegenereerde blaasjes van de resterende intacte mitochondriën door centrifugatie bij 20.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. De intacte mitochondriën zullen pelleteren terwijl de blaasjes in het bovenliggende blijven.</li>
	<li>Concentreer het blaasjesmengsel.<ol><li>Breng het supernatans over in verse ultracentrifugatiebuizen.</li>
		<li>Plaats een kussen van 0,3 ml 2,5 M sucroseoplossing op de bodem van de tube met behulp van een spuit van 1 ml die is uitgerust met een canule van 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Centrifugeer bij 118.000 x g gedurende 100 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Hier werd een zwenkbare bakrotor met een maximale radius van 153,1 mm gebruikt. De centrifugatieomstandigheden zijn sterk afhankelijk van de rotor en zullen moeten worden aangepast wanneer een andere rotor wordt gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>De blaasjes verschijnen na het centrifugeren als een schijf op de bovenkant van het sacharosekussen. Gooi ongeveer 90% van het supernatant weg. Oogst nu de geconcentreerde blaasjes door ze opnieuw te suspenderen in de resterende buffer, inclusief de 2,5 M sucrose, door op en neer te pipetteren. Breng de suspensie over naar een ijskoude Dounce-homogenisator.</li>
	<li>Homogeniseer de suspensie met minimaal 10 slagen met behulp van een polytetrafluorethyleen pottenbakker.</li>
	<li>Bereid de sucrosegradiënt voor.<ol><li>Voor een stapgradiënt van 11 ml met vijf stappen (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M en 0,8 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4), heeft elke laag 2,2 ml sucrose-oplossing. OPMERKING: Een refractometer wordt aanbevolen om de sucroseconcentraties te meten en aan te passen; Het is echter niet essentieel. Breng 10 μL van de buffer aan op de refractometer en detecteer de respectievelijke brekingsindices. De berekening van de sacharoseconcentratie is als volgt: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1,3333 vertegenwoordigt de brekingsindex van water. 0,048403 is een sucrose-specifieke conversie-index die wordt verkregen uit de lineaire schaling van de molaire brekingscoquiviteit ten opzichte van de sucroseconcentratie in waterige oplossingen 37.</li>
		<li>Voeg de hoogste sacharoseconcentratie toe aan de centrifugatiebuis en zet de buis op -20 °C. Wacht tot de laag volledig bevroren is voordat u de volgende aanbrengt. Ga dienovereenkomstig te werk totdat de laatste laag is toegevoegd en bewaar de gradiënten bij -20 °C. OPMERKING: Vergeet niet om de bevroren gradiënten over te brengen naar 4 °C bij het starten van het experiment om de gradiënten te laten ontdooien. Dit duurt ongeveer 3 uur. Voor het centrifugeren hier werd een zwenkbare emmerrotor met een capaciteit van 13,2 ml gebruikt. Wanneer een andere rotor wordt gebruikt, moeten de volumes van de hellingsstappen dienovereenkomstig worden aangepast.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet de sacharoseconcentratie van de monsters met behulp van een refractometer. Als er geen toegang is tot een refractometer, kan men ook aannemen dat de sacharoseconcentratie 2 M is. Deze veronderstelde sucroseconcentratie zal dan de basis vormen voor de volgende stap.</li>
	<li>Pas de sucroseconcentratie aan op 0,6 M door toevoeging van een geschikte hoeveelheid 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF en proteaseremmercocktail, pH 7,4. Als de sacharoseconcentratie wordt geschat op 2 M in plaats van te worden gemeten, wordt aanbevolen om te testen of de concentratie na aanpassing laag genoeg is. Breng een kleine hoeveelheid van het monster (ca. 50 μl) aan op 200 μl 0,8 M sacharose in een reageerbuis. Het monster moet bovenop de 0,8 M sacharose blijven.</li>
	<li>Laad de monsters (ongeveer 1 ml) bovenop de sucrosegradiënt (bewaar 10% voor later gebruik). Zorgvuldig pipetteren is belangrijk om verstoring van de gradiënt te voorkomen (Figuur 2, stap 5).</li>
	<li>Scheid de blaasjes door centrifugeren bij 200.000 x g en 4 °C gedurende 12 uur. Stel de centrifuge indien mogelijk in op langzame versnelling en vertraging om verstoring van de helling te voorkomen (Figuur 2, stap 6). OPMERKING: Hier werd een zwenkbare bakrotor met een maximale radius van 153,1 mm gebruikt. De centrifugatieomstandigheden zijn sterk afhankelijk van de rotor en zullen moeten worden aangepast wanneer een andere rotor wordt gebruikt.</li>
	<li>Oogst de gradiënt van boven naar beneden in fracties van 700 μL met behulp van een pipet van 1 ml. Dit resulteert in 17 breuken, wat een voldoende resolutie mogelijk maakt.</li>
</ol>4. Analyse van submitochondriale blaasjes
<ol><li>Concentreer de eiwitten door elke fractie te onderwerpen aan twee achtereenvolgens uitgevoerde TCA-precipitaties38 om de SDS-PAGE-monsters voor te bereiden.<ol><li>Voeg 200 μL 72% TCA toe aan de afzonderlijke fracties en meng tot de oplossing homogeen is. Incubeer de fracties gedurende 30 minuten op ijs en pelleteer de neergeslagen eiwitten door centrifugatie bij 20.000 x g en 4 °C gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg, voeg 500 μl 28 % TCA-oplossing toe, meng goed en herhaal de centrifugatiestap.</li>
		<li>Was de pellets met 1 ml aceton (-20°C) en centrifugeer gedurende 10 minuten op 20.000 x g en 4 °C. Gooi het supernatant weg en laat de pellets aan de lucht drogen. Resuspendeer de pellets in 60 μL SDS-monsterbuffer en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C. OPMERKING: Er zal een grote hoeveelheid sacharose achterblijven, vooral in de fracties met een hoge dichtheid, na de eerste TCA-precipitatie. Dit wordt verwijderd door de extra TCA-neerslag.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer 20 μL van elke fractie met SDS-PAGE39 en immunoblotting40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolatie van mitochondriale contactplaatsen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.

Mitochondriale subfractionering is een ingewikkeld experiment met verschillende zeer complexe stappen. Daarom hebben we ernaar gestreefd om onze gevestigde methode verder te verbeteren en, tot op zekere hoogte, te vereenvoudigen32. Hier waren de uitdagingen de behoefte aan gecompliceerde en zeer gespecialiseerde apparatuur, die vaak individuele constructies zijn, en het enorme tijd- en energieverbruik. Daartoe hebben we geprobeerd de pompen en individuele constructies die worden gebruikt voor het ...

Mitochondriën vervullen verschillende functies in eukaryoten, waarvan de meest bekende de productie van ATP door oxidatieve fosforylering is. Andere functies zijn onder meer de productie van ijzer-zwavelclusters, lipidensynthese en in hogere eukaryoten, Ca2+-signalering en de inductie van apoptose 1,2,3,4. Deze functies zijn onlosmakelijk verbonden met hun complexe ultrastructuur.
De mitochondriale ultrastructuur werd voor het eerst beschreven door elektronenmicroscopie5. Er werd aangetoond dat mitochondriën vrij complexe organellen zijn die uit twee membranen bestaan: het mitochondriale buitenmembraan en het mitochondriale binnenmembraan. Door deze membranen worden dus twee waterige compartimenten gevormd: de intermembraanruimte en de matrix. Het mitochondriale binnenmembraan kan nog verder worden onderverdeeld in verschillende secties. Het binnenste grensmembraan blijft in de nabijheid van het buitenste membraan en de cristae vormen invaginaties. Zogenaamde crista-juncties verbinden het binnenste grensmembraan en de cristae (Figuur 1). Bovendien onthullen elektronenmicrofoto's van osmotisch gekrompen mitochondriën dat er plaatsen bestaan waar de mitochondriale membranen nauw met elkaar verbonden zijn 6,7. Deze zogenaamde contactplaatsen worden gevormd door eiwitcomplexen die de twee membranen overspannen (Figuur 1). Er wordt gedacht dat deze interactieplaatsen essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van cellen vanwege hun belang voor de regulatie van mitochondriale dynamiek en overerving, evenals de overdracht van metabolieten en signalen tussen het cytosol en de matrix8.
Het MICOS-complex in het mitochondriale binnenmembraan is waarschijnlijk het best gekarakteriseerde en het meest veelzijdige contactplaatsvormende complex. MICOS werd in 2011 beschreven in gist en bestaat uit zes subeenheden 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 en Mic10. Deze vormen een complex van ongeveer 1,5 MDa dat zich lokaliseert op de crista-knooppunten 9,10,11. Het verwijderen van een van beide kernsubeenheden, Mic10 of Mic60, leidt tot de afwezigheid van dit complex 9,11, wat betekent dat deze twee subeenheden essentieel zijn voor de stabiliteit van MICOS. Interessant is dat MICOS niet slechts één, maar meerdere contactplaatsen vormt met verschillende mitochondriale buitenmembraaneiwitten en -complexen: het TOM-complex 11,12, het TOB/SAM-complex 9,12,13,14,15,16, het Fzo1-Ugo1-complex9,Por1 10, OM45 10 en Miro 17. Dit wijst er sterk op dat het MICOS-complex betrokken is bij verschillende mitochondriale processen, zoals eiwitimport, fosfolipidenmetabolisme en de vorming van de mitochondriale ultrastructuur18. De laatste functie is waarschijnlijk de belangrijkste functie van MICOS, aangezien de afwezigheid van het MICOS-complex geïnduceerd door de deletie van MIC10 of MIC60 leidt tot een abnormale mitochondriale ultrastructuur die vrijwel volledig geen regelmatige cristae heeft. In plaats daarvan hopen interne membraanblaasjes zonder verbinding met het binnenste grensmembraanzich op 19, 20. Belangrijk is dat MICOS in vorm en functie geconserveerd blijft van gist tot mens21. De associatie van mutaties in MICOS-subeenheden met ernstige ziekten bij de mens benadrukt ook het belang ervan voor hogere eukaryoten22,23. Hoewel MICOS zeer veelzijdig is, moeten er extra contactsites zijn (op basis van onze niet-gepubliceerde observaties). Er zijn inderdaad verschillende andere contactplaatsen geïdentificeerd, bijvoorbeeld de mitochondriale fusiemachines Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 of Mdm31-Por1, die betrokken zijn bij de biosynthese van het mitochondriaal-specifieke fosfolipide cardiolipine 27. Onlangs hebben we de methode verbeterd die ons heeft geleid tot de identificatie van MICOS om Cqd1 te identificeren als onderdeel van een nieuwe contactplaats gevormd met het buitenste membraancomplex Por1-Om1428. Interessant is dat deze contactplaats ook betrokken lijkt te zijn bij meerdere processen, zoals de homeostase van het mitochondriale membraan, het fosfolipidenmetabolisme en de distributie van co-enzym Q28,29.
Hier gebruikten we een variatie op de eerder beschreven fractionering van mitochondriën 9,30,31,32,33. Osmotische behandeling van mitochondriën leidt tot de verstoring van het mitochondriale buitenmembraan en tot een krimp van de matrixruimte, waardoor de twee membranen alleen dicht bij elkaar blijven op contactplaatsen. Dit maakt het mogelijk om blaasjes te genereren die uitsluitend bestaan uit mitochondriaal buitenmembraan of mitochondriaal binnenmembraan of op contactplaatsen van beide membranen door middel van milde sonicatie. Omdat het mitochondriale binnenmembraan een veel hogere eiwit-lipideverhouding heeft, vertonen mitochondriale binnenmembraanblaasjes een hogere dichtheid in vergelijking met mitochondriale buitenmembraanblaasjes. Het verschil in dichtheid kan worden gebruikt om de membraanblaasjes te scheiden door middel van sucrose opwaartse dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Zo hopen de mitochondriale buitenste membraanblaasjes zich op bij lage sucroseconcentraties, terwijl de mitochondriale binnenmembraanblaasjes worden verrijkt bij hoge sucroseconcentraties. De blaasjes die contactplaatsen bevatten, concentreren zich op intermediaire sacharoseconcentraties (figuur 2). Het volgende protocol beschrijft deze verbeterde methode, die minder gespecialiseerde apparatuur, tijd en energie vereist in vergelijking met onze eerder vastgestelde32, in detail en biedt een nuttig hulpmiddel voor de identificatie van mogelijke contactplaatseiwitten.

<table><tbody><tr><td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Abbe refractometer</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td>discontinued, any Abbe refractometer can be used</td></tr><tr><td>accu-jet pro Pipet Controller</td><td>Brandtech, USA</td><td>BR26320</td><td>discontinued, any pipet controller will suffice</td></tr><tr><td>Beaker 1000 mL</td><td>DWK Life Science, Germany</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>Branson&nbsp; Digital Sonifier W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti JXN-26</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth, Germany</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td><td>Roth, Germany</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td><td>Roth, Germany</td><td>X747.1</td><td></td></tr><tr><td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td><td>Hirschmann, Germany</td><td>1180170</td><td></td></tr><tr><td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td><td>Hirschmann, Germany</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>ice bath</td><td>neoLab, Germany</td><td>&nbsp;S12651</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer RCT basic</td><td>IKA-Werke GmbH, Germany</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td><td>Gerbu, Germany</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10005S</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Germany</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Serva, Germany</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td><td>Braun, Germany</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>stirring bar, 15 mm</td><td>VWR, USA</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Test tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td><td>VWR, USA</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td><td>VWR, USA</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid (TCA)</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>33731</td><td>discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondriën zijn aanwezig in vrijwel alle eukaryote cellen en vervullen essentiële functies die veel verder gaan dan energieproductie, bijvoorbeeld de synthese van ijzer-zwavelclusters, lipiden of eiwitten, Ca2+ -buffering en de inductie van apoptose. Evenzo resulteert mitochondriale disfunctie in ernstige ziekten bij de mens, zoals kanker, diabetes en neurodegeneratie. Om deze functies uit te voeren, moeten mitochondriën communiceren met de rest van de cel over hun omhulsel, dat uit twee membranen bestaat. Daarom moeten deze twee membranen constant op elkaar inwerken. Eiwitachtige contactplaatsen tussen de mitochondriale binnen- en buitenmembranen zijn in dit opzicht essentieel. Tot nu toe zijn er verschillende contactlocaties geïdentificeerd. In de hier beschreven methode worden Saccharomyces cerevisiae-mitochondriën gebruikt om contactplaatsen te isoleren en zo kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor contactplaatseiwitten. We gebruikten deze methode om het mitochondriale contactplaats en cristae organizing system (MICOS) -complex te identificeren, een van de belangrijkste contactplaatsvormende complexen in het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt geconserveerd van gist tot mens. Onlangs hebben we deze methode verder verbeterd om een nieuwe contactplaats te identificeren die bestaat uit Cqd1 en het Por1-Om14-complex.

Het is relatief eenvoudig om mitochondriale binnen- en buitenmembranen te scheiden. Het genereren en scheiden van blaasjes die de contactplaats bevatten, is echter veel moeilijker. Naar onze mening zijn twee stappen cruciaal en essentieel: de sonicatiecondities en de gebruikte gradiënt.
Gewoonlijk wordt aangenomen dat lineaire gradiënten een betere resolutie hebben in vergelijking met stapsgewijze gradiënten. Hun reproduceerbare productie is echter vervelend en vereist speciale apparatuur. Daa...

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

We willen de moleculaire functie van mitochondriale contactplaatsen begrijpen, waardoor de communicatie tussen de twee mitochondriale membranen mogelijk wordt. Dit is eigenlijk een voorwaarde om de functie voor mitochondriale biogenese en dus de levensvatbaarheid van cellen te begrijpen. We ontdekten een nieuwe contactplaats tussen het mitochondriale binnen- en buitenmembraan gecreëerd door Cqd1 en Om14-Por1.Onze gegevens suggereren dat deze site kan helpen bij het importeren van lipiden zoals fosfatidinezuur. Op basis van de identificatie van het MICOS-complex hebben we bijgedragen aan een beter begrip van hoe mitochondriale membraanarchitectuur wordt gegenereerd. Dit stelde ons in staat om een werkend model te ontwikkelen dat verklaart hoe de twee vormen van mitochondriale cristae, lamellaire en tubulaire cristae, worden gevormd.Ons onderzoek is in het verleden gedaan in gist. We zijn er echter van overtuigd dat de vorming van een correcte mitochondriale architectuur ook belangrijk is voor hogere eukaryoten. Dus de volgende stap in ons onderzoek is het analyseren van de rol van mitochondriale architectuurelementen in complexere modellen zoals primaire neuronen.

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is &lt;30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Mitochondriën zijn slechts een klein percentage van de plant cel, moeten ze voor een aantal studies worden gezuiverd. Mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van organen van de plant door homogenisering, gevolgd door de differentiaal- en dichtheid kleurovergang centrifugeren te verkrijgen van een hoogst gezuiverde mitochondriale fractie.

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

Leer een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren met behulp van sub-mitochondriale vesikelvorming en dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze techniek helpt onderzoekers de rol van CQD1 en het MICOS-complex te bestuderen.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Meer video's verkennen