Methoden voor elektroporatie en transformatie bevestiging in Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 juni 2023
Hier presenteren we protocollen voor het werken met Limosilactobacillus reuteri DSM20016, met details over groei, plasmidetransformatie, kolonie-PCR, fluorescerende reporter-eiwitmeting en beperkte plasmide mini-prep, evenals veelvoorkomende problemen en probleemoplossing. Deze protocollen maken het mogelijk om reportereiwitten in DSM20016 te meten, of bevestiging via kolonie-PCR als er geen reporter bij betrokken is.
L.Reuteri, en specifiek de stam, DSM20016 is een robuuste, natuurlijke menselijke darm commensaal, met grote belofte voor therapeutische levering en ziektedetectie in het hele maagdarmkanaal. Dit werk zal helpen DSM20016 te positioneren als een synthetisch biologisch chassis voor dat soort toepassingen. Lactobacillen hebben geen specifiek modelorganisme.
Voorkeurssoorten bestaan wel, maar ze worden meestal gekozen met een voorkeur voor bepaalde onderzoeksdoelen. De variatie binnen de bacteriële familie heeft geleid tot gefragmenteerde protocollen, sommige met iteraties van wijzigingen die teruggaan tot publicaties. Het is heel moeilijk voor mensen die beginnen om precies te filteren wat wel en niet nuttig is.
Eén paper voor de transformatie van DSM20016 bestaat wel, maar het is niet modern. Moderne protocollen voor andere Lactobacillales-familieleden bestaan, maar ze zijn niet DSM20016. Hier streven we ernaar om een eenvoudig te gebruiken, gecentraliseerde, gemoderniseerde, complete set protocollen voor DSM20016 elektroporatie te bieden.
Deze protocolset biedt een aanzienlijke modernisering ten opzichte van eerdere DSM20016 verkenningsprotocol en verduidelijkt enkele hangende draden, evenals het benadrukken van delen die voorheen minder duidelijk waren. De protocolset is ook compleet, en specifiek voor DSM20016, een stam waarvoor andere niet-DSM20016 protocollen niet volledig compatibel zijn. Een van onze belangrijkste doelen is het gebruik van microben als goedkope sensoren en toedieningssystemen.
We werken samen met darmziekte-experts om DSM20016 te gebruiken om de omstandigheden in het maagdarmkanaal te detecteren en therapieën te leveren als dat nodig is.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het werken met Limosilactobacillus reuteri DSM20016, een robuuste commensaal van de menselijke darm. De protocollen omvatten groei, plasmidentransformatie, kolonie-PCR en de meting van fluorescerende reporter-eiwitten.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Synthetische Biologie
- Maagdarmgezondheid
Achtergrond
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 is een natuurlijke commensaal van de menselijke darmflora.
- Deze stam is veelbelovend voor therapeutische toediening en ziekteonderzoek.
- Protocollen op dit gebied zijn vaak versnipperd en moeilijk hanteerbaar.
- Onderzoeksdoelstellingen kunnen de keuze van de bacteriële soort beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om heldere protocollen te bieden voor het werken met DSM20016.
- Om de meting van reportereiwitten en bevestiging via kolonie-PCR te vergemakkelijken.
- Om veelvoorkomende problemen en probleemoplossing in de protocollen te behandelen.
Gebruikte methoden
- Groei van Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Plasmidtransformatietechnieken.
- Kolonie-PCR voor bevestiging van genetische modificaties.
- Meting van fluorescente reportereiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle groeiprocedures en transformatieprotocollen zijn vastgesteld.
- Kolonie-PCR bevestigde de aanwezigheid van de gewenste genetische constructen.
- Fluorescerende reportereiwitten zijn effectief gemeten.
- Richtlijnen voor probleemoplossing zijn verstrekt voor veelvoorkomende problemen.
Conclusies
- De protocollen verbeteren de bruikbaarheid van DSM20016 in onderzoek.
- Ze bieden een basis voor toekomstige toepassingen in de synthetische biologie.
- Duidelijke richtlijnen helpen onderzoekers bij het navigeren door gefragmenteerde literatuur.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Gecentraliseerde, stam-specifieke protocollen voor elektroporatie en transformatiebevestiging voor Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vullen een kritisch gat in de ontwikkeling van synthetische biologie-chassis voor toepassingen gericht op de darmen. Gestandaardiseerde workflows verminderen ambiguïteit en maken reproduceerbare engineering van commensale microben mogelijk voor therapeutische aflevering en ziekte-detectie. Dit positioneert DSM20016 als een betrouwbaar platform voor vroegtijdige biofarmaceutische R&D gericht op gastro-intestinale gezondheid.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt robuuste genetische manipulatie van DSM20016 mogelijk voor functionele analyse van targets.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de haalbaarheid van transformatie in een belangrijke commensale stam te verduidelijken.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de selectie van stammen voor synthetische biologie-pipelines.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gevalideerde protocollen voor het prepareren van DSM20016 als een screeningsklaar chassis.
- Standaardiseert transformatie en reportermeting voor reproduceerbare assay-outputs.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van genetisch gemodificeerde constructen in een ziekte-relevant systeem mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt genetisch gemodificeerde DSM20016 uit met translationele doelen voor therapeutische toediening gericht op de darm.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in gastro-intestinale modellen.
- Vermindert het risico bij het verder brengen van gemodificeerde commensalen naar translationele studies.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze protocollen integreren op het grensvlak van vroege ontdekking en assay-ontwikkeling, waardoor een gestroomlijnde overgang mogelijk wordt gemaakt van genetische manipulatie naar functionele screening in DSM20016.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-engineering in een commensaal chassis.
- Screening: Levert reproduceerbare transformatie en kwantitatieve reporter-uitlezingen voor downstream-workflows.
- Analytics: Maakt meting van de transformatie-efficiëntie en reporter-expressie mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Biedt een basis voor de preklinische evaluatie van genetisch gemodificeerde stammen in darm-relevante contexten.
- Enterprise Reuse: Vestigt DSM20016 als een herbruikbaar, gestandaardiseerd platform voor R&D in de synthetische biologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij commensale engineering.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare protocollen voor stammanipulatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie in vroegtijdige programma's voor het darmmicrobioom.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van engineered microbiële therapieën mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microbiële genetica en electroporatietechnieken.
- Toegang tot electroporatieapparatuur en plaatlezers is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de adoptie van het protocol en het oplossen van problemen.
- Aanpassing voor andere Lactobacillales-stammen kan noodzakelijk zijn vanwege genotypische variatie.
- De compatibiliteit van het protocol is specifiek voor DSM20016 en is mogelijk niet algemeen toepasbaar op andere stammen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
