Name: Magnetische fluorescerende kralen-gebaseerde dual-reporter flow-analyse van PDL1-Vaxx peptidevaccin-geïnduceerde antilichaamblokkade van de PD-1/PD-L1-interactie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer hoe magnetische fluorescerende kralen worden gebruikt om de antilichaamblokkade van PD-1/PD-L1-interacties te analyseren bij het PDL1-Vaxx peptidevaccin. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Sherry Dunbar PhD, MBA van Luminex Corporation (Austin, TX) voor onderzoeksondersteuning en Matthew Silverman PhD van Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) voor wetenschappelijke en schrijfhulp. Dit werk werd ondersteund door onderscheidingen aan Pravin T. P. Kaumaya van de National Institutes of Health (R21 CA13508 en R01 CA84356) en Imugene Ltd, Sydney, Australië (OSU 900600, GR110567 en GR124326).

Stroomanalyse van PDL1-VAXX-antilichaamblokkade met behulp van magnetische fluorescerende kralen

<ol><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines%3A+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1%2C+PD-L1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335(2022).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB%2Fc+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+%28cynomolgus+monkeys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566(2022).</li>
<li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab%3A+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li>
<li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paradigm+shift%3A+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types%3A+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li>
<li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA%3A+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li>
<li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li>
<li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+HER-2%2Fneu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li>
<li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric%2C+human+epidermal+growth+factor+receptor+2%2C+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and%2For+recurrent+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li>
<li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li>
<li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab%2Fpertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+%28B-Vaxx%29+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437(2020).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+%28PDL1-Vaxx%29+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+%28synergizes%29+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+%28B-Vaxx%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691(2022).</li>
<li>Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022).</li>
<li>MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%22">Estimation of cell number by hemocytometry counting</a>. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019).</li>
</ol>

Pravin T.P. Kaumaya is een consultant voor Imugene, Ltd.

Het doel van checkpoint-gerelateerde kankerimmunotherapie is om de interactie tussen checkpoint-eiwitten en hun belangrijke liganden in de overleving en progressie van tumoren te verstoren2. Deze onderzoeksgroep is actief bezig met de ontwikkeling van nieuwe PD-1- en PD-L1-vaccins die een antilichaamrespons opwekken die zich richt op het PD-1/PD-L1-checkpoint 3,8,13,14 en deze onderbreekt. Eerder werden twee variaties van enzymgekoppelde immunosorbenttests (ELISA's) uitgevoerd om de effecten van anti-PDL1-peptide-antilichamen op de remming van de recombinante PD1/PD-L1-interactie te evalueren14. (1) In de eerste variant werd rhPD-L1 gecoat op een microtiterplaat en vervolgens werd de plaat geïncubeerd met verdunde anti-PDL1-vaccinkandidaat-geïnduceerde antilichamen. De remming van de recombinante PD-1/PD-L1-interactie door de antilichamen werd vervolgens geëvalueerd door gebiotinyleerd rhPD-1 toe te voegen en de binding aan het geïmmobiliseerde rhPD-L1 te kwantificeren met behulp van een streptavidine-mierikswortelperoxidaseconjugaat en een colorimetrisch substraat. We hebben dit gedefinieerd als de directe blokkadetest. (2) In de tweede variant werd PD-1 op de microtiterplaat gecoat. Gebiotinyleerd rhPD-L1 werd gepre-geïncubeerd met elk van de anti-PLD1 kandidaat-geïnduceerde polyklonale antilichamen in afzonderlijke reactiebuisjes. De rhPDL1/anti-PDL1-mengsels werden vervolgens toegevoegd aan de plaatputjes met geïmmobiliseerd rhPD-1 en mochten reageren. Elke rhPDL1 die reageerde met de geïmmobiliseerde rhPD-1 in aanwezigheid van de mogelijk blokkerende PDL1-Vaxx-geïnduceerde antilichamen werd gedetecteerd met daaropvolgende streptavidin-HRP en colorimetrische substraatincubatie. We hebben dit gedefinieerd als de omgekeerde blokkadetest.
De omgekeerde blokkade van de recombinante PD-1/PD-L1-interactie door anti-PDL1-peptide-antilichamen vertoonde remming van het signaal (d.w.z. PD-1/PD-L1-blokkade) op een antilichaamconcentratie-afhankelijke manier14, terwijl de directe blokkadebenadering geen consistente resultaten opleverde (niet getoond). De op kralen gebaseerde blokkadetest met dubbele verslaggever is ontwikkeld om de ELISA-resultaten te verifiëren en om de blokkade van de PD-1/PD-L1-interactie in een vloeistoffase te onderzoeken, waardoor de mogelijke sterische hinder/bindende problemen met de beschikbaarheid van epitoop die gepaard gaan met het immobiliseren van recombinante eiwitten op putbodems worden geëlimineerd. De microsferenanalyse was direct gecorreleerd met de ELISA-blokkeringsresultaten met behulp van de omgekeerde blokkadetest (Figuur 2). Bovendien kunnen op fluorescentie gebaseerde immunoassays een verbeterde testgevoeligheid en een breder dynamisch bereik bieden in vergelijking met colorimetrische ELISA's18, en verder maakt de op gemultiplexte kralen gebaseerde assay de gelijktijdige prestaties van twee onafhankelijke immunoassays binnen een enkele reactie mogelijk. De sulfo-NHS en EDC die werden gebruikt voor de covalente koppeling van de microsferen aan rhPD-1 kunnen hebben geleid tot de prestatieverschillen die zijn waargenomen tussen de directe blokkade- en omgekeerde blokkade-assays en de waargenomen verschillen in gevoeligheid tussen de ELISA- en Luminex-bead-gebaseerde recombinante PD-1/PD-L1-interactieassays. Verder onderzoek op chemisch en moleculair niveau is gerechtvaardigd om de mogelijke mechanismen te bestuderen die verantwoordelijk zijn voor deze verschillen.
Zowel ELISA14 als de op kralen gebaseerde assays tonen aan dat PDL1-Vaxx-geïnduceerde anti-PDL1-antilichamen de vorming van PD1/PD-L1-checkpointcomplexen kunnen remmen. De op peptiden gebaseerde PDL1-Vaxx induceert met succes anti-PDL1-antilichamen die de PD-1/PD-L1-interactie kunnen blokkeren. Deze benadering kan dienen als een nieuwe therapeutische strategie voor de behandeling van kanker, zoals ondersteund door preklinische dierstudies 3,13,14. Geplande klinische onderzoeken zullen de werkzaamheid van de PDL1-Vaxx bepalen voor checkpoint-immunotherapie en ziektebestrijding bij kankerpatiënten.

In de T-cellen, B-cellen en intracellulaire controlepunten van het immuunsysteem reguleren signaalroutes de immuunactiviteiten. Sommige kankercellen beschermen zichzelf tegen immuunaanvallen door checkpoint-doelen te stimuleren, die de immuunfunctie remmen en neoplastische overleving en proliferatie bevorderen. Oncologische immunotherapie door remming van checkpoints maakt gebruik van antilichamen om de signaleringscontrolepunten aan te pakken en te blokkeren en zo de antineoplastische functies van het immuunsysteem te herstellen 1,2,3. Zeer effectieve antikankertherapieën omvatten momenteel de monoklonale antilichamen nivolumab, die zich richten op geprogrammeerd doodseiwit 1 (PD-1)4, en atezolizumab, dat zich richt op geprogrammeerd doodligand 1 (PD-L1)5. Deze aanpak heeft groot klinisch succes aangetoond bij de behandeling van kankerpatiënten. Het klinische nut van de huidige strategieën voor het remmen van checkpoints wordt echter beperkt door bijwerkingen en resistentie tegen behandeling, vooral bij therapie met één middel6. Een combinatie van immunotherapie en effectievere therapeutische strategieën met een lagere toxiciteit is dringend nodig bij de behandeling van kanker 1,3,6.
In de afgelopen 30 jaar heeft het laboratorium van Dr. Kaumaya peptide-kankervaccins en peptide-nabootsende middelen ontwikkeld voor kankertherapie, waarvan sommige in lopendeklinische onderzoeken 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . B-Vaxx met HER-2 combinatie-immunotherapie heeft bijvoorbeeld in klinische onderzoeken voordelen voor de patiënt aangetoond tegen gemetastaseerde en/of recidiverende solide tumoren12. De nieuwste kankervaccins van het laboratorium zijn PD1-Vaxx 2,13 en PDL1-Vaxx14, die grote voordelen hebben aangetoond in preklinische studies, vooral bij combinatiebehandeling. De PD1-Vaxx heeft klinische proeven met dosisescalatie voltooid in de VS en Australië. De PD1-Vaxx zal worden gecombineerd met atezolizumab in de fase 1b-studie die in mei 2023 van start gaat. Dit rapport richt zich op het evalueren van het vermogen van PDL1-Vaxx-geïnduceerde antilichamen om de PD-1/PD-L1-interactie te blokkeren.
Het PDL1-Vaxx-kankervaccin is een nieuw B-celpeptide-epitoopvaccin met PD-L1-aminozuren 130-147 gekoppeld aan het promiscue T-cel-mazelenvirusfusie (MVF)-peptide via een GPSL-peptidelinker. Preklinische studies hebben aangetoond dat PDL1-Vaxx zeer immunogeen is in het stimuleren van de productie van antilichamen tegen kanker in verschillende diermodellen, de overleving verlengt en de tumorlastvermindert14. Deze antilichamen die tegen het PD-L1-peptide worden gegenereerd, kunnen met succes de PD1/PD-L1-interactie blokkeren, wat resulteert in antineoplastische activiteit. Dit rapport introduceert een test die de blokkade van PD1/PD-L1-complexvorming analyseert door PDL1-Vaxx-geïnduceerde antilichamen met behulp van een op magnetische kralen gebaseerd formaat met een dual-reporter-uitlezing op een flowcytometrie-instrument.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activeringsbuffer: 0,1 M NaH2PO4, pH 6,2</td><td>Millipore/Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Analyse-/Wasbuffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05 % (v/v) Tween-20; 0,05% NaN3)</td><td>Millipore/Sigma</td><td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td><td></td></tr><tr><td>Koppelingsbuffer: 50 mM 2-morfolinoethaansulfonzuur (MES), pH 5,0</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Koppelingsreagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride (EDC)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>77149</td><td></td></tr><tr><td>xMAP-antilichaamkoppelingskit (indien gewenst), inclusief:</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>EDC, 10 mg&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sNHS-oplossing, 250 &micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activerings-/koppelingsbuffer: 0,1 M 2-morfolinoethaansulfonzuur (MES), pH 6,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasbuffer: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05 % (v/v) Tween-20; 0,05% NaN3 (PBS-TBN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentatie en aanvullende laboratoriumbenodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX (instrument met dubbele reporter)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate met ronde bodem en lage eiwitbinding</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>07-200-761</td><td></td></tr><tr><td>Luminex Magnetic Plate Separator (of vergelijkbaar)&nbsp;</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>Luminex Magnetic Tube Separator (of vergelijkbaar)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>CN-0288-01</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex Microspheres (magnetisch, fluorescerend, kralen met een diameter van 6,5 &micro;m)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>MC-1**** (variërend per kralenlabel)</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind microcentrifugebuizen</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Peptiden, antilichamen &amp; detectie reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atezolizumab (gehumaniseerd anti-PDL1 IgG1 monoklonaal antilichaam), positieve controle</td><td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td><td>n/a (receptplichtige medicijnen)</td><td></td></tr><tr><td>Gebiotinileerd recombinant humaan PDL1&nbsp;</td><td>Sino Biological (Wayne, PA)</td><td>10084-H49H-B</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421-geconjugeerd donkey anti-human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421-geconjugeerd donkey anti-konijn IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td><td>711-675-152</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan PD-1 (poly-histidine getagd)</td><td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td><td>PD1-H5256&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-geconjugeerd R-fycoerytrine (SAPE)</td><td>Agilent (Santa Clara, CA)</td><td>PJRS34-1</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab (Herceptin, gehumaniseerd anti-HER2 monoklonaal antilichaam), negatieve controle</td><td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td><td>n/a (receptplichtige medicijnen)</td><td></td></tr></tbody></table>

magnetische fluorescerende kralen-gebaseerde dual-reporter flow-analyse van pdl1-vaxx peptidevaccin-geïnduceerde antilichaamblokkade van de pd-1/pd-l1-interactie

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

De remming van checkpointreceptoren (PD-1, PD-L1 en CTLA-4) met monoklonale antilichamen heeft een groot voordeel aangetoond in klinische onderzoeken voor de behandeling van kankerpatiënten en is een steunpilaar geworden in moderne kankerimmunotherapie. Slechts een subgroep van patiënten reageert echter op immunotherapie met checkpoint monoklonale antilichamen. Daarom is het dringend noodzakelijk om nieuwe therapeutische strategieën tegen kanker te ontwikkelen. Er is een nieuw B-cel peptide-epitoop PDL1 (geprogrammeerd doodligand 1) kankervaccin ontwikkeld, met aminozuren 130-147 gekoppeld aan het MVF-peptide ("promiscue" T-cel mazelenvirusfusie-eiwit) via een GPSL-linker. Preklinische tests hebben aangetoond dat dit PDL1-vaccin (PDL1-Vaxx) effectief zeer immunogene antilichamen bij dieren stimuleert. Dieren geïmmuniseerd met PDL1-Vaxx vertonen een verminderde tumorlast en verlengde overlevingspercentages in verschillende dierkankermodellen. De werkingsmechanismen geven aan dat door het vaccin opgewekte antilichamen de proliferatie van tumorcellen remmen, apoptose induceren en de PD-1/PD-L1-interactie blokkeren. Dit manuscript introduceert een op magnetische kralen gebaseerde test die gebruik maakt van een dual-reporter flow-analysesysteem om de PD-1/PD-L1-interactie en de blokkade ervan door de anti-PDL1-antilichamen die tegen de PDL1-Vaxx zijn opgewekt, te evalueren.

De test was in staat om de remming van de PD-1/PD-L1-interactie nauwkeurig te kwantificeren door vier unieke polyklonale antilichamen, gegenereerd tegen de rhPD-L1-vaccinpeptiden, die worden onderzocht als potentiële kankertherapeutische middelen. Het schema van deze test is weergegeven in figuur 1. De hoeveelheid gebiotinyleerd rhPD-L1 die zich bond aan rhPD-1-geconjugeerde kralen en de remming van deze binding door de vier PLD1-Vaxx-geïnduceerde antilichaamkandidaten werd gemeten in Reporter Channel 1 met behulp van een streptavidine-PE-detectiereagens dat rhPD-L1 direct bond (Figuur 2).
Alle vier de polyklonale anti-PDL1-peptide-antilichamen blokkeerden de rhPD-L1-interactie met PD-1 die in verschillende mate op microsferen was geïmmobiliseerd. Het percentage remming van de verschillende anti-PDL1-peptide-antilichamen varieerde van 48% tot 74% bij de maximaal geteste concentratie van 1.000 μg/ml. Het positieve controle monoklonaal antilichaam atezolizumab bereikte 92% blokkade van de PD-1/PD-L1-interactie bij de maximaal geteste concentratie14 van 4 μg/ml (Figuur 2). Alle experimentele PDL1-Vaxx-antilichamen vertoonden concentratieafhankelijke remming van rhPD-L1-binding aan rhPD-1-geconjugeerde kralen in vergelijking met trastuzumab, het negatieve controle-antilichaam waarvan niet werd verwacht dat het interageerde met het PD-1/PD-L1-systeem.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figuur 2: Blokkade van rhPD-L1 interactie met rhPD-1 gekoppeld aan magnetische kralen door anti-PDL1-peptide antilichamen, zoals aangetoond door een nieuwe fluorescerende korrel-gebaseerde immunoassay. Recombinant humaan PD-1 werd gekoppeld aan magnetische microsferen en de kralen werden vervolgens geïncubeerd met gebiotinyleerd rhPD-L1 dat vooraf was geïncubeerd met verschillende anti-PDL1-peptide-antilichamen. Een streptavidine-fycoerythrine-detectiereagens werd gebruikt om de biotine te binden en zo de relatieve hoeveelheid rhPD-L1 te beoordelen die beschikbaar was om aan PD-1 te binden. Polyklonale antilichamen die bij konijnen werden gekweekt tegen de PDL1-peptidevaccins (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] en anti-PDL1[130]) werden getest op remmende activiteit en vertoonden 48%-74% blokkade van recombinante PD-1/PD-L1-interacties bij de hoogste geteste concentratie. Atezolizumab (een ander anti-PDL1 monoklonaal antilichaam) werd gebruikt als positieve controle. Het niet-verwante commerciële monoklonale antilichaam trastuzumab (anti-HER2) werd gebruikt als negatieve controle. Deze figuur is een bewerking van Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figuur 3: Vergelijkende binding van verschillende PDL1-Vaxx-geïnduceerde antilichamen aan rhPD-L1 gecomplexeerd met rhPD1-gecoate magnetische kralen. Briljant violet 421-geconjugeerd secundair detectie-antilichaam werd gebruikt om de binding van verschillende polyklonale anti-PDL1-peptide-antilichamen van konijnen aan rhPD-L1 te vergelijken via rhPD-1-gecoate kralen. Het BV421 blauwe fluorescentiesignaal werd opgenomen in Reporter Channel 2 van het dual-reporter instrument; dit signaal correleert met de relatieve bindingsefficiëntie van de experimentele anti-PDL1-peptide-antilichamen. Trastezumab (anti-HER2), een monoklonaal antilichaam dat zich richt op een ander controlepunt dan PD-1/PD-L1, werd gebruikt als negatieve controle. MFI vertegenwoordigt de gemiddelde mediane fluorescentie-intensiteit van de kraal, die werd gemeten in dubbele reactieputjes per conditie. Deze figuur is een bewerking van Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De relatieve mogelijkheden van de vier experimentele PDL1-Vaxx-geïnduceerde kandidaat-antilichamen om rhPD-L1 te binden werden vergeleken met behulp van een afzonderlijk detectiesysteem (BV421-geconjugeerd anti-konijn IgG) dat werd geëvalueerd op het tweede reporterkanaal van het instrument. Deze resultaten gaven aan dat alle vier de polyklonale anti-PDL1-peptide-antilichamen zich op een concentratie-afhankelijke manier aan rhPD-L1 bonden14 (Figuur 3). Het anti-PDL1(130)-antilichaam vertoonde het hoogste rhPDL1-bindingssignaal van de vier PDL1-Vaxx-geïnduceerde antilichaamkandidaten.

Checkpointremmers zijn belangrijke doelwitten bij het ontwikkelen van therapieën voor de strijd tegen kanker. Dit rapport introduceert een nieuw PDL1-peptide-gebaseerd kankervaccin, PDL1-Vaxx, dat neutraliserende polyklonale antilichaamproductie induceert die de vorming van PD-1/PDL1-complex blokkeert. Dit werk beschrijft ook de ontwikkeling en het testen van een op fluorescerende kralen gebaseerde test voor het analyseren van deze activiteit.

Magnetische fluorescerende kralen-gebaseerde dual-reporter flow-analyse van PDL1-Vaxx peptidevaccin-geïnduceerde antilichaamblokkade van de PD-1/PD-L1-interactie

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Ons project onder leiding van professor Pravin Kaumaya is gericht op het ontwikkelen van B-cel epitooppeptidevaccins die kunnen worden gebruikt om het immuunsysteem te stimuleren om de kanker beter te bestrijden. Wij zijn van mening dat peptidevaccins die gericht zijn op immuuncontrolepunten zelfs kunnen worden gecombineerd met andere therapieën om de resultaten voor de patiënt te verbeteren. We wilden het blokkerende vermogen van onze anti-PD-L1-antilichamen testen in een traditionele microbead-assay waarbij menselijk recombinant PD-L1-eiwit werd gebonden aan MagPlex-korrels.We ontdekten dat, zodra de PD-L1 aan de kralen was gebonden, ze een lage bindingscapaciteit hadden voor het PD-1-ligand. Dit verhinderde ons om deze manier van testen te blokkeren. Wanneer het binden van eiwit aan kralen de binding aan ligand of antilichamen remt, is voorbehandeling met de testantilichamen in oplossing een optie, waarbij later ligandgecoate korrels worden toegevoegd aan het doelblokkermengsel.Hun interactie kan worden onderzocht. Dit kan een ander pad zijn om dezelfde doelwit-ligand-bindende interactie te bestuderen We hebben B-Vaxx-, PD1-Vaxx-, PDL1-Vaxx- en CTLA4-Vaxx-kankervaccins ontwikkeld. Deze vaccins richten zich op HER2 en verschillende immuuncheckpointmarkers zijn betrokken bij verschillende vormen van kanker.B-Vaxx en PD1-Vaxx zijn in lopende klinische onderzoeken in Australië en de VS. We hopen dat onze immuuncheckpointvaccins meer patiënten ten goede zullen komen. In eerdere experimenten met microsferen ontdekten we dat PD-1 goed interageerde met zijn ligand PD-L1. Daarom hebben we het protocol opnieuw ontworpen, waarbij we de anti-PD-L1-peptide-antilichamen vooraf binden aan gebiotinyleerd PD-L1-eiwit voordat de PD-1-gelabelde MagPlex-kralen worden toegevoegd.Hierdoor konden we onze antilichamen testen op hun vermogen om PD-1/PD-L1-interactie te blokkeren. We zullen ons blijven richten op combinatie-immunotherapieën die behandelingsresistentie overwinnen. We willen ook effectievere combinatietherapieën onderzoeken die de tumorgroei beter remmen, metastase voorkomen en de overlevingskansen van patiënten verlengen.

magnetic-fluorescent-bead-based-dual-reporter-flow-analysis-pdl1-vaxx

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, we demonstrate a technique to perform the co-immunoprecipitation of GFP-tagged wild-type and mutated PD-1 proteins using beads coated with anti-GFP antibodies. The bead-bound PD-1-GFP proteins are incubated with SHP2 proteins that interact with PD-1, enabling the identification of specific structural motifs in PD-1 that play a critical role in SHP2 interaction.

Immunoprecipitation Assay to Study Enzyme Receptor Interactions in Transfected Cells

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Hier presenteren we een protocol voor co-immunoprecipitation en een op-kraal enzymatische activiteit assay gelijktijdig het bestuderen van de bijdrage van specifieke proteïne domeinen van plasmamembraan receptoren aan zowel de enzym werving en de enzymactiviteit.

Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

We ontwikkelden een eenvoudige flow cytometrie test voor de evaluatie van de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen, waarbij slechts een druppel perifeer bloed van kankerpatiënten.

Monitoring PD-1-Blocking Antilichamen gebonden aan T-cellen afgeleid van een druppel perifeer bloed

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Dit protocol beschrijft een blokkadetest voor PD-1/PD-L1-remmers met behulp van oppervlakteplasmonresonantietechnologie. Het maakt gebruik van een immobilisatiestrategie in twee stappen en een op maat gemaakt buffersysteem om responseenheden nauwkeurig te meten, waardoor de beoordeling van blokkadesnelheden voor verbindingen of biologische geneesmiddelen wordt vergemakkelijkt. Bovendien ondersteunt het de high-throughput identificatie van PD-1/PD-L1-remmers.

Identificatie van PD-1/PD-L1-remmers met Surface Plasmon Resonance-technologie

Selectief gemerkte fluorescerende GnRH-I, -II en -III derivaten betrouwbare middelen voor het opsporen en kwantificeren van de cellulaire opname. Dit manuscript introduceert experimenten te visualiseren, kwantificeren en te vergelijken de opname efficiëntie van deze GnRH conjugaten in diverse cellijnen.

In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

Low-veld (L-band, 1,2 GHz) elektron paramagnetisch resonantie met behulp van oplosbare nitroxyl en trityl sondes is voor beoordeling van fysiologisch belangrijke parameters in de communicatie van de tumor in muismodellen van borstkanker aangetoond.

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

Het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige genomic DNA van tumor weefsels is een essentiële eerste stap voor het analyseren van de genetische veranderingen met behulp van de volgende generatie sequencing. In dit artikel presenteren we een eenvoudige en snelle methode om tumorcellen te verrijken en te verkrijgen intact DNA touch Impressum cytologie specimens.

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

Leer hoe magnetische fluorescerende kralen worden gebruikt om de antilichaamblokkade van PD-1/PD-L1-interacties te analyseren bij het PDL1-Vaxx peptidevaccin. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van immunologisch onderzoek.

Magnetische fluorescerende kralen-gebaseerde dual-reporter flow-analyse van PDL1-Vaxx peptidevaccin-geïnduceerde antilichaamblokkade van de PD-1/PD-L1-interactie (Video) | JoVE Journal

Magnetische fluorescerende kralen-gebaseerde dual-reporter flow-analyse van PDL1-Vaxx peptidevaccin-geïnduceerde antilichaamblokkade van de PD-1/PD-L1-interactie

Meer video's verkennen