De cellulaire distributie van een optogenetisch eiwit in kaart brengen met behulp van een lichtstimulatieraster

Ons lab onderzoekt ruimtelijke en temporele regulatie van cyclisch AMP om te begrijpen welke omstandigheden specifieke stroomafwaartse gebeurtenissen veroorzaken. Om subcellulaire activering en remming van cyclische AMP-signalering effectief na te bootsen, karakteriseren we de distributie van een optogenetisch hulpmiddel genaamd bPAC-nanoluciferase. Om de validiteit van de huidige cyclische AMP-signaleringsmodellen te testen, hebben we tools ontwikkeld om cyclische AMP-signalering van subcellulaire compartimenten in levende cellen te evalueren, na te bootsen en te blokkeren.

Dit protocol kan worden gebruikt om de distributie en functie van optogenetische instrumenten op een systematische manier te stimuleren en te evalueren. Welnu, ons doel was om te testen of het focuslichtproces optogenetische eiwitten in specifieke celzones nauwkeurig kan activeren, waardoor de impact op omliggende eiwitten wordt vermeden. Deze methode zal van vitaal belang zijn voor het bestuderen van eiwitten met diffuse verdelingen of als het beoogde effect is om lokale verhogingen van cyclisch AMP of andere signaalmoleculen te genereren.

In optogenetische experimenten omvat de typische benadering het stimuleren van een heel veld met cellen of soms kleinere aangewezen gebieden. De selectie van dit gebied en deze intensiteit is echter vaak willekeurig. Onze systematische aanpak stelt onderzoekers in staat om nauwkeurigere experimenten uit te voeren, waardoor patronen van signaalroutes kunnen worden nagebootst.

Gebruik voor deze studie cellen die samen zijn getransfecteerd met een nucleair gerichte cyclische AMP-sensor en een optogenetisch nucleair gericht eiwit, NLS-bPAC-nanoluciferase. Kweek en manipuleer de cellen die de nucleaire bPAC tot expressie brengen in een donkere omgeving. Gebruik een rode safelight-lamp om blootstelling aan golflengten van minder dan 500 nanometer te voorkomen.

Voer de beeldvormingsexperimenten uit in een gemotoriseerde microscoop met twee dekken die is uitgerust met een multi-LED-lichtmotor, een emissiefilterwiel, een gemotoriseerde XY-trap, een ORCA-Fusion digitale CMOS-camera en een olieobjectief met een vergroting van 100x met een numerieke opening van 1,4. Gebruik digitale microscopiesoftware om afbeeldingen vast te leggen. Deze opstelling is in staat om cellen te stimuleren en tegelijkertijd FRET-metingen uit te voeren door gebruik te maken van een onafhankelijk lichtpad dat is uitgerust met een ZT458rdc dichroïsch filter.

Nadat u het UGA-42 Geosystem en de LDI-7-lasers hebt ingeschakeld, schakelt u de microscoop in om deze op de juiste manier in te stellen voor het verkrijgen van gegevens met de H208 FRET-sensor. Open vervolgens achtereenvolgens de beeldvormingssoftware en de SysCon-software die de microscoop bestuurt. Als u het systeem voor elk gebruik wilt kalibreren, navigeert u naar het cameravenster en selecteert u het tabblad Kalibratie.

Stel de lasergolflengte in die compatibel is met het optogenetische eiwit. Kies 445 nanometer om bPAC-nanoluciferase te stimuleren. Selecteer het tabblad Camera en klik op Acquisitie starten om de acquisitie vanuit de beeldbewerkingssoftware te starten.

Selecteer opnieuw het tabblad Kalibratie. Klik op de knop Kalibratie starten. Selecteer in de vervolgkeuzelijst die verschijnt de juiste kalibratiemodus.

Volg de kalibratiestappen die door de fabrikant zijn aangegeven. Wijzig indien nodig de instellingen van de beeldvormingssoftware om de juiste kalibratie uit te voeren. Zorg ervoor dat de kalibratie wordt uitgevoerd op een celvrij deel van het monster.

Verkrijg vervolgens met behulp van de beeldvormingssoftware één fluorescentiebeeld. Fluorescerende cellen verschijnen in het Image Viewer-venster. Plaats de cel die wordt gestimuleerd met behulp van de microscoopbediening XY binnen het invloedsgebied, bij voorkeur in het midden.

Voordat u met het eigenlijke experiment begint, gebruikt u de Click-And-Fire-modus om snel het reactievermogen van een individuele cel te evalueren. Pas in het tijdlijnvenster de celstimulatieparameters aan, inclusief de lichtbron, duur en intensiteit van de stimulus. Klik in het venster Afbeeldingsviewer ongeveer op het midden van de cel en evalueer het antwoord.

Selecteer in het Image Viewer-venster het ronde pictogram in de werkbalk aan de linkerkant en klik in het vervolgkeuzemenu op Gevuld om gevulde cirkelvormige stimulatieobjecten te tekenen. Herhaal deze stap om meerdere identieke cirkels te maken en deze gelijkmatig te verdelen, zodat een homogene dekking van het gehele te stimuleren cytoplasma van de te stimuleren cel wordt gegarandeerd. Klik in het venster Afbeeldingsviewer op het pictogram van de muisaanwijzer aan de linkerkant en klik vervolgens met de rechtermuisknop op een van de stimulatieobjecten om de eigenschappen ervan te controleren en te bewerken.

U kunt ook alle getekende stimulatieobjecten selecteren en vervolgens met de rechtermuisknop klikken om de eigenschappen van alle geselecteerde stimulatieobjecten samen te bewerken. Klik in het subvenster Weergave op de knop Uitlijnen op raster. Dit raster kan helpen om de afstand en uitlijning van de cirkels gelijkmatig te houden om een goede matrix of array te vormen.

Pas bovendien de eigenschappen van het raster aan met de knop Raster instellen. Verdeel de stimulatie-objecten gelijkmatig met behulp van het rooster. Voeg indien nodig meer stimulatie-objecten toe om de hele cel te bedekken.

Zorg ervoor dat ze allemaal dezelfde eigenschappen hebben. Elk stimulatieobject dat eerder in het Image Viewer-venster is gemaakt, is aanwezig in het tijdlijnvenster, waar men een andere set eigenschappen kan bewerken, waaronder starttijd, duur, vertraging, intensiteit en meer. Om de stimulatieobjecten goed te visualiseren, vouwt u eerst het tijdlijnvenster uit.

Nu kan men de tijdelijke eigenschappen van stimulatie-objecten zien in het tijdlijnvenster. Selecteer alle stimulatieobjecten en bewerk hun vertraging en duur in het subvenster Objecttiming. Configureer in het subvenster Lichtbron de golflengten en intensiteiten van het object.

Zorg voor identieke golflengte en intensiteit voor iedereen. Om te voorkomen dat het effect van twee of meer stimulaties wordt opgelegd, stelt u voor elk object verschillende starttijden in of varieert u de vertraging tussen beide, afhankelijk van het verwachte resultaat. Wijzig vervolgens in het tijdlijnvenster de volgorde waarin elk stimulatieobject indien nodig wordt geactiveerd.

Configureer de volgorde van stimulaties in een regelmatig of willekeurig patroon, afhankelijk van het experiment. Nadat u de sequentie naar het systeem hebt geüpload, configureert u het aantal sequentiecycli of -runs die het systeem zal uitvoeren in het subvenster Sequentie. Om de fluorescentieveranderingen van de gestimuleerde cel te meten, plaatst u de interessegebieden in de beeldvormingssoftware op de gewenste posities.

Begin met het verkrijgen van fluorescentiebeelden. Druk ten slotte op Play bij het UGA-42-venster om de cellen te stimuleren. Observeer de daadwerkelijke stimulatiestralen die ook door de camera kunnen worden vastgelegd en hun correlatie met de stimulatieobjecten.

Let alleen op de verandering in intensiteit van het groene spoor, dat de toename van de cyclische AMP-concentratie weergeeft die door de sensor is gemeten. Dit gebeurt met name wanneer de bundel een deel van de cel bereikt met de minimale hoeveelheid bPAC-nanoluciferase. De YFP-fluorescentie van H208 werd gebruikt om de positie van de kern te bepalen.

Een interessegebied dat de hele kern bestrijkt, werd gebruikt om veranderingen in de FRET-ratio van de H208-sensor te meten als gevolg van stimulatie op de aangegeven blauwe vlekken. Hieruit bleek dat voorbijgaande verhogingen van cyclisch AMP alleen optraden wanneer blauw licht werd gericht op gebieden die de bPAC-nanoluciferase bevatten. Dit bevestigde dat het nucleair gerichte bPAC-nanoluciferase uitsluitend tot expressie kwam in het nucleaire compartiment van HC-1-cellen.