Name: Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Leer dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten voor DNA-schadebeoordeling. Deze methode evalueert genoomschade door bleomycine en helpt bij het begrijpen van DNA-herstelmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de volbloeddonoren en al het gezondheidspersoneel dat de bloedmonsters heeft genomen dankbaar.

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Pisa en geïnformeerde en ondertekende toestemming werd verkregen van elke donor.
1. Vorming van γH2AX en 53BP1 foci
<ol><li>Bereiding van monsters en mutagene behandeling<ol><li>Verzamel volbloedmonsters door venapunctie van gezonde volwassen personen in bloedafnamebuizen (bijv. Vacutainer) die lithiumheparine als anticoagulans bevatten.</li>
		<li>Om een goede bewaring van het bloedmonster te garanderen, start u de procedure binnen 24 uur na de bemonstering.</li>
		<li>Voeg 300 μL van het monster toe aan een buis met 4,7 ml volledig medium (0,5% penicilline-streptomycine, 0,75% fytohemagglutinine, 10% FBS eerder geïnactiveerd, 88,75% RPMI 1640).</li>
		<li>Voeg vervolgens bleomycinesulfaat toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 μg / ml. LET OP: Bleomycinesulfaat is een mutageen. Vermijd huidcontact en inademing. Bereid de oplossing en voeg het monster toe onder een kap.</li>
		<li>Stel voor elk monster een negatieve controle in (afwezigheid van mutageen).</li>
		<li>Plaats de buis in een thermostaat op 37 °C gedurende 2 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixatie<ol><li>Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet met vortex.</li>
		<li>Voeg 5 ml hypotone oplossing (2,87 g KCl opgelost in 500 ml gedeïoniseerd water) en 400 μl prefixatieve oplossing (5:3 azijnzuur: methanol) toe om hemolyse van rode bloedcellen te veroorzaken.</li>
		<li>Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 5 ml methanol bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten om de cellen te fixeren.</li>
		<li>U kunt de cellen ook bewaren bij -20 °C tot gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia's voorbereiding<ol><li>Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 5 ml van een 3:1 methanol: azijnzuuroplossing. Herhaal deze stappen nog een keer.</li>
		<li>Centrifugeer de oplossing aan het einde opnieuw op 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Zuig het supernatant opnieuw op en laat voldoende oplossing (0,5 ml) achter om de pellet te resuspenderen, pipetteer krachtig, laat de geresuspendeerde celpellet op de dia's vallen en droog aan de lucht. Bewaar de dia's bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescentie OPMERKING: Immunofluorescentie is een immunologische methode voor het identificeren van specifieke celdoelen met behulp van een primair antilichaam dat het doelwit zelf bindt en een fluorescerend secundair antilichaam dat het primaire bindt en waarmee het doelwit11 kan worden gelokaliseerd. In dit geval worden een muis monoklonale anti-53BP1 (1:50) en een konijn polyklonale anti-γH2AX (1:50) gebruikt als primaire antilichamen, terwijl AlexaFluor568 anti-muis (1:400) en DyLight488 anti-konijn (1:200) worden gebruikt als secundaire antilichamen, respectievelijk.<ol><li>Was de dia's twee keer in 50 ml 1x PBS gedurende 5 minuten in een couplin pot (16 dia's rug-aan-rug).</li>
		<li>Bewaar ze vervolgens gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml gedeïoniseerd water, 300 μl Triton-X).</li>
		<li>Voeg aan elke dia 10 μL van elk van de twee oplossingen toe die de primaire antilichamen bevatten die in de blokkerende oplossing zijn opgelost. Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer een nacht bij 4 °C.</li>
		<li>Voer na incubatie drie wasbeurten uit in 1x PBS gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg aan elke dia 10 μL van elk van de twee oplossingen toe die de secundaire antilichamen bevatten die in de blokkerende oplossing zijn opgelost. Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voer drie wasbeurten uit in 1x PBS gedurende 5 min.</li>
		<li>Voeg vóór de montage 2,5 μL antifade-oplossing met DAPI toe aan de dekletters om de kernen tegen te gaan. OPMERKING: Om de focikinetiek te beoordelen, is de procedure dezelfde als beschreven van 1,1 tot 1,4, waarbij wordt opgemerkt dat celoogst en de dubbele immunofluorescentie worden uitgevoerd op 0 h, na 2 uur na de behandeling met bleomycine en vervolgens, na het verwijderen van de mutagene stof, op 4 h, 6 h en 24 h na de behandeling.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse door een fluorescentiemicroscoop
OPMERKING: "Fluorescentiemicroscoop" verwijst naar elke microscoop die fluorescentie gebruikt om een afbeelding te genereren. Het monster wordt verlicht met licht van een specifieke golflengte (of golflengten) dat wordt geabsorbeerd door de fluoroforen, waardoor ze licht van langere golflengtenuitzenden 12. AlexaFluor568 en DyLight 488 absorberen licht van ongeveer 568 en 488 nm en zenden licht uit van respectievelijk 603 en 520 nm. Ze zijn dus zichtbaar als rode of groene fluorescentie met behulp van respectievelijk een TRITC- of een FITC-filter.
<ol><li>Scoor de aanwezigheid van foci in elke dia onder een 100x onderdompelingsdoel (figuur 1).</li>
	<li>Scoor 200 kernen per dia en tel het aantal γH2AX/53BP1 foci in elke kern.</li>
	<li>Express-resultaten in termen van het gemiddelde aantal foci per totaal gescoorde kernen. Deze omvatten zowel γH2AX/53BP1 positieve (met ten minste één fluorescentiesignaal) als negatieve (geen fluorescentiesignaal) kernen.</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
<li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li>
<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Immunofluorescentieanalyse van γH2AX en 53BP1 foci is een geschikte methode voor het beoordelen van genomische schade in interfasekernen van een celsysteem. Deze procedure heeft verschillende kritieke punten die de uitkomst van de experimenten kunnen beïnvloeden, voornamelijk de middelen die worden gebruikt bij fixatie en permeabilisatie, het type antilichamen en hun verdunningsfactoren en de concentratie van het mutagene beeld.
Het behoud van eiwitintegriteit is van fundamenteel belang, omdat...

DNA-schade wordt continu geïnduceerd door agentia die endogeen kunnen zijn, zoals ROS gegenereerd door cellulair oxidatief metabolisme, of exogene, zowel chemicaliën als fysisch1. Een van de meest schadelijke laesies spelen dubbelstrengsbreuken (DSB's) een fundamentele rol bij het bijdragen aan genomische instabiliteit, omdat ze chromosoomafwijkingen veroorzaken die op hun beurt het carcinogeneseproces kunnen initiëren. Zo worden cellen voorzien van complexe en efficiënte mechanismen van DSB's die repareren2.
Wanneer een DSB optreedt, activeert de cel de DNA-schaderespons (DDR) waarbij, samen met het MRE11 / RAD50 / NBS1-complex, ATM- of ATR-kinasen worden gerekruteerd om andere eiwitten te activeren die de celcyclus vertragen of stoppen3. Een essentieel doelwit van deze kinasen is histon H2AX, dat wordt gefosforyleerd op Ser-139 binnen enkele megabases van de DSB's (namelijk γH2AX), waardoor de rekrutering van verschillende reparatiefactoren mogelijk is, zoals onder andere BRCA1 en p53-bindend eiwit 1 (53BP1)3. Later wordt één route tussen homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of enkelstrengsgloeiing (SSA) geactiveerd om de DSB's 4,5 te repareren. Daarom is 53BP1 betrokken bij het dicteren van de keuze tussen HR of NHEJ, voornamelijk het bevorderen van de activering van NHEJ in plaats van HR6. Bovendien kunnen zowel de gefosforyleerde vorm van H2AX-histon als 53BP1 foci vormen op de plaatsen van DSB's. Aangezien deze foci blijven bestaan totdat de integriteit van de dubbele streng is hersteld, wordt het beoordelen van het verschijnen/verdwijnen van γH2AX of 53BP1 foci binnen een tijdsinterval beschouwd als een nuttige methode om het optreden en herstel van DSB's in een celsysteemte evalueren 6,7. Volgens de hierboven beschreven moleculaire processen kan het echter nuttig zijn om, aangezien γH2AX en 53BP1-foci naar verwachting samen in de buurt van de DSB's zullen lokaliseren tijdens DDR8,9, tegelijkertijd de aanwezigheid van deze markers in een dubbele immunofluorescentie te detecteren.
Het doel van dit manuscript was dus om de geschiktheid te evalueren van de gelijktijdige kwantificering van γH2AX en 53BP1 foci om de genomische schade geïnduceerd in menselijke perifere lymfocyten door het radiomimetische middel bleomycine te beoordelen. Met behulp van dezelfde methodologie probeerden we ook de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB's af te bakenen volgens een eerder opgezette experimentele procedure10.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (&gamma;1)</td><td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1 secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bleomycin sulfaat (mutageen)</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin oplossing 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>antibiotica voor kweekmedium</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Fetaal Rundserum voor immunofluorescentie</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Geconjugeerd</td><td>Termofisher</td><td>#35552</td><td>&gamma;H2AX secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Muis anti-53BP1 monoklonaal antilichaam</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 primair antilichaam</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>P-histone H2AX (Ser139) konijnenantilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>#2577</td><td>&gamma;H2AX primair antilichaam</td></tr><tr><td>Phytohemagglutinine</td><td>Termofisher</td><td>R30852801</td><td>component van kweekmedium</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent met DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>#8961</td><td>Antifade oplossing met DAPI voor contrakleuring</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Nonionogene detergent voor permeabilisatie</td></tr></tbody></table>

dubbele immunofluorescentie van γh2ax en 53bp1 in humane perifere lymfocyten

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Dubbele strengsbreuken (DSB's) zijn een van de ernstigste laesies die kunnen optreden in celkernen, en als ze niet worden gerepareerd, kunnen ze leiden tot ernstige resultaten, waaronder kanker. De cel is daarom voorzien van complexe mechanismen om DSB's te repareren, en deze routes omvatten histon H2AX in zijn gefosforyleerde vorm bij Ser-139 (namelijk γH2AX) en p53-bindend eiwit 1 (53BP1). Aangezien beide eiwitten foci kunnen vormen op de plaatsen van DSB's, wordt identificatie van deze markers beschouwd als een geschikte methode om zowel DSB's als hun kinetiek van reparatie te bestuderen. Volgens de moleculaire processen die leiden tot de vorming van γH2AX- en 53BP1-foci, zou het nuttiger kunnen zijn om hun co-lokalisatie in de buurt van de DSB's te onderzoeken om een alternatieve aanpak op te zetten die het mogelijk maakt DSB's te kwantificeren door de gelijktijdige detectie van twee DNA-schademarkers. Dit protocol heeft dus tot doel de genomische schade te beoordelen die in menselijke lymfocyten wordt veroorzaakt door het radiomimetische agens bleomycine door de aanwezigheid van γH2AX en 53BP1-foci in een dubbele immunofluorescentie. Met behulp van deze methodologie hebben we ook de variatie in het aantal γH2AX- en 53BP1-foci in de loop van de tijd afgebakend, als een voorlopige poging om de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB's te bestuderen.

Gegevens verkregen door de fluorescentiemicroscoopanalyse van perifere lymfocyten stellen ons in staat om drie hoofdaspecten te evalueren: de effectiviteit van bleomycinebehandeling bij het verhogen van het aantal γH2AX- en 53BP1-foci (en dus van DSB's) vanwege het mutagene effect, in welke mate beide foci co-gelokaliseerd zijn op de plaats van DSB's, en het tijdsverloop van γH2AX en 53BP1-foci om de reparatiekinetiek van bleomycine-geïnduceerde DSB's af te bakenen. Zoals verwacht werd een zeer hogere frequentie van zowe...

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Het doel van dit manuscript was om de geschiktheid te evalueren van de gelijktijdige kwantificering van Gamma H2AX en 53BP1 foci om de genomische schade geïnduceerd in menselijke perifere lymfocyten door bleomycine te beoordelen. Verschillende factoren kunnen dubbele strengbreuken veroorzaken. Cellen zijn dus voorzien van verschillende reparatiemechanismen, waarbij zowel Gamma H2AX als 53 Binding Protein 1 betrokken zijn, die samen kunnen lokaliseren in de buurt van de dubbele strengsbreuk.Voeg na het verzamelen van volbloedmonsters 300 microliter monster toe aan een buis met 4,7 milliliter volledig medium. Voeg vervolgens vijf microgram per milliliter bleomycinesulfaat eindconcentratie toe. Stel voor elk monster een negatief besturingselement in.Zet de buis twee uur lang in een thermostaat op 37 graden Celsius. Centrifugemonsters bij 540 G gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens vijf milliliter hypotone oplossing toe aan de pellet.Voeg vervolgens 400 microliter prefixatieve oplossing toe om hemolyse te veroorzaken. Centrifugeer monsters bij 540 G gedurende vijf minuten en resuspensie pellet vervolgens in vijf milliliter methanol bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten om de cellen te fixeren. Centrifugeer monsters bij 540 G gedurende vijf minuten en resuspensie pellet vervolgens in vijf milliliter fixatieve oplossing.Herhaal deze stap nogmaals. Centrifugeer opnieuw op 540 G gedurende vijf minuten en streef dan naar het supernatant dat voldoende oplossing overlaat om de pellet te resuspenderen. Laat de geresuspendeerde celkorrel op de glaasjes vallen.Bereid de twee oplossingen die de anti-Gamma H2AX en de anti-53BP1 primaire antilichamen bevatten, opgelost in een blokkerende oplossing. Was vervolgens de dia's twee keer in PBS 1X. Bewaar de dia's vervolgens gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing.Voeg aan elke dia 10 microliter van elk van de twee oplossingen toe die de primaire antilichamen bevatten die zijn opgelost in een blokkerende oplossing. Bedek de dia's met parafilm. Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.Voer na de incubatie drie wasbeurten uit in PBS 1X gedurende vijf minuten. Bereid de twee oplossingen met de secundaire antilichamen DyLight 488 en Alexa Fluor 568 opgelost in een blokkerende oplossing. Voeg vervolgens aan elke dia 10 microliter van elk van de twee oplossingen toe die de secundaire antilichamen bevatten die zijn opgelost in een blokkerende oplossing.Bedek de dia's met parafilm en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Voer na deze tweede incubatie drie wasbeurten uit in PBS 1X gedurende vijf minuten. Voeg 2,5 microliter Antifade-oplossing met DAPI toe aan de afdekstroken voor montage om vlekken op de kernen tegen te gaan.Om foci kinetisch te beoordelen, is de procedure dezelfde als nu beschreven. De laatste fase is observatie en kwantificering van foci. Menselijke lymfocyten zonder Gamma H2AX en 53BP1 foci worden getoond in A, in B, en in C, menselijke lymfocyten met verschillende hoeveelheden Gamma H2AX en 53BP1 foci worden getoond.Er wordt een laag niveau van foci co-lokalisatie waargenomen. Zoals verwacht wordt een zeer hogere frequentie van zowel Gamma H2AX als 53BP1 foci waargenomen tussen onbehandelde onbehandelde cellen. Ook wordt een groot verschil waargenomen in het aantal foci van de twee markers.Het tijdsverloop van Gamma H2AX en 53BP1 foci in de loop van de tijd vertoonde een ander gedrag, hoewel ze bijdragen aan dezelfde functie. Gamma H2AX en 53BP1 foci analyse heeft de mogelijkheid om de cellulaire respons te evalueren in zowel blootstelling als pathologische contexten. Gamma H2AX en 53BP1 dubbele immunofluorescentie kunnen echter leiden tot onderschatting van de werkelijke frequentie van de gebeurtenis.

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

In this video, we describe the immunofluorescence microscopy technique to detect specific DNA damage response proteins localized at the sites of DNA double-strand breaks in human mononuclear cells. The proteins are recognized by specific primary antibodies, which in turn bind to fluorophore-tagged secondary antibodies that fluoresce during microscopic visualization, enabling visualization of the proteins as distinct fluorescent foci within the cell nuclei.

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.

Een geautomatiseerde microscopische scoringsmethode voor de γ-H2AX foci assay in menselijke perifere bloedlymfocyten

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Leer dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten voor DNA-schadebeoordeling. Deze methode evalueert genoomschade door bleomycine en helpt bij het begrijpen van DNA-herstelmechanismen.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Meer video's verkennen