Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten
14 juli 2023
Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.
Het doel van dit manuscript was om de geschiktheid te evalueren van de gelijktijdige kwantificering van Gamma H2AX en 53BP1 foci om de genomische schade geïnduceerd in menselijke perifere lymfocyten door bleomycine te beoordelen. Verschillende factoren kunnen dubbele strengbreuken veroorzaken. Cellen zijn dus voorzien van verschillende reparatiemechanismen, waarbij zowel Gamma H2AX als 53 Binding Protein 1 betrokken zijn, die samen kunnen lokaliseren in de buurt van de dubbele strengsbreuk.
Voeg na het verzamelen van volbloedmonsters 300 microliter monster toe aan een buis met 4,7 milliliter volledig medium. Voeg vervolgens vijf microgram per milliliter bleomycinesulfaat eindconcentratie toe. Stel voor elk monster een negatief besturingselement in.
Zet de buis twee uur lang in een thermostaat op 37 graden Celsius. Centrifugemonsters bij 540 G gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens vijf milliliter hypotone oplossing toe aan de pellet.
Voeg vervolgens 400 microliter prefixatieve oplossing toe om hemolyse te veroorzaken. Centrifugeer monsters bij 540 G gedurende vijf minuten en resuspensie pellet vervolgens in vijf milliliter methanol bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten om de cellen te fixeren. Centrifugeer monsters bij 540 G gedurende vijf minuten en resuspensie pellet vervolgens in vijf milliliter fixatieve oplossing.
Herhaal deze stap nogmaals. Centrifugeer opnieuw op 540 G gedurende vijf minuten en streef dan naar het supernatant dat voldoende oplossing overlaat om de pellet te resuspenderen. Laat de geresuspendeerde celkorrel op de glaasjes vallen.
Bereid de twee oplossingen die de anti-Gamma H2AX en de anti-53BP1 primaire antilichamen bevatten, opgelost in een blokkerende oplossing. Was vervolgens de dia's twee keer in PBS 1X. Bewaar de dia's vervolgens gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing.
Voeg aan elke dia 10 microliter van elk van de twee oplossingen toe die de primaire antilichamen bevatten die zijn opgelost in een blokkerende oplossing. Bedek de dia's met parafilm. Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.
Voer na de incubatie drie wasbeurten uit in PBS 1X gedurende vijf minuten. Bereid de twee oplossingen met de secundaire antilichamen DyLight 488 en Alexa Fluor 568 opgelost in een blokkerende oplossing. Voeg vervolgens aan elke dia 10 microliter van elk van de twee oplossingen toe die de secundaire antilichamen bevatten die zijn opgelost in een blokkerende oplossing.
Bedek de dia's met parafilm en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Voer na deze tweede incubatie drie wasbeurten uit in PBS 1X gedurende vijf minuten. Voeg 2,5 microliter Antifade-oplossing met DAPI toe aan de afdekstroken voor montage om vlekken op de kernen tegen te gaan.
Om foci kinetisch te beoordelen, is de procedure dezelfde als nu beschreven. De laatste fase is observatie en kwantificering van foci. Menselijke lymfocyten zonder Gamma H2AX en 53BP1 foci worden getoond in A, in B, en in C, menselijke lymfocyten met verschillende hoeveelheden Gamma H2AX en 53BP1 foci worden getoond.
Er wordt een laag niveau van foci co-lokalisatie waargenomen. Zoals verwacht wordt een zeer hogere frequentie van zowel Gamma H2AX als 53BP1 foci waargenomen tussen onbehandelde onbehandelde cellen. Ook wordt een groot verschil waargenomen in het aantal foci van de twee markers.
Het tijdsverloop van Gamma H2AX en 53BP1 foci in de loop van de tijd vertoonde een ander gedrag, hoewel ze bijdragen aan dezelfde functie. Gamma H2AX en 53BP1 foci analyse heeft de mogelijkheid om de cellulaire respons te evalueren in zowel blootstelling als pathologische contexten. Gamma H2AX en 53BP1 dubbele immunofluorescentie kunnen echter leiden tot onderschatting van de werkelijke frequentie van de gebeurtenis.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode om de vorming en het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genomica
Achtergrond
- Dubbelstrengsbreuken kunnen door verschillende factoren worden geïnduceerd.
- Cellen beschikken over meerdere herstelmechanismen voor DNA-schade.
- γH2AX en 53BP1 zijn sleutelproteïnen die betrokken zijn bij DNA-herstel.
- Colokalisatie van deze proteïnen vindt plaats nabij dubbelstrengsbreuken.
Doel van de studie
- Om de geschiktheid van gelijktijdige kwantificering van γH2AX- en 53BP1-foci te evalueren.
- Om genomische schade in menselijke perifere lymfocyten te beoordelen.
- Om de effecten van bleomycine op de DNA-integriteit te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Volledige bloedmonsters worden afgenomen van menselijke proefpersonen.
- De monsters worden behandeld met bleomycinesulfaat.
- Negatieve controles worden opgezet ter vergelijking.
- De detectie van γH2AX- en 53BP1-foci wordt uitgevoerd in interfasekernen.
Belangrijkste resultaten
- Simultane detectie van γH2AX- en 53BP1-foci is haalbaar.
- Behandeling met bleomycine leidt tot meetbare DNA-schade.
- Kwantificering van foci correleert met de mate van genomische schade.
- De resultaten ondersteunen het gebruik van deze methode voor het beoordelen van DNA-reparatiemechanismen.
Conclusies
- Het protocol beoordeelt effectief de vorming en het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken.
- Gelijktijdige detectie van γH2AX en 53BP1 biedt waardevolle inzichten.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse studies naar DNA-schade en -herstel.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve detectie van de DNA-dubbelstrengsbreuk-markers (DSB) γH2AX en 53BP1 in menselijke lymfocyten maakt een nauwkeurige beoordeling van genomische schade en reparatiekinetiek mogelijk. Deze dubbele immunofluorescentiebenadering versterkt het voorspellend vertrouwen bij vroege genotoxiciteitsscreening en mechanische risicoanalyse voor kandidaatverbindingen. Het integreren van deze resultaten in de ontdekkingsfase ondersteunt risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen en translationele continuïteit.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van DNA-schaderesponspaden in menselijke cellen mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoanalyse door de inductie van DSB en de reparatiekinetiek te kwantificeren.
- Faciliteert functionele validatie van targets die betrokken zijn bij genoomstabiliteit.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor genotoxiciteitsrisico's in lead-verbindingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd systeem voor het kwantificeren van DNA-schademarkers in primaire menselijke cellen.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve read-outs mogelijk voor door verbindingen geïnduceerde DSB's.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays voor high-content screening van DNA-schade-modulatoren.
- Faciliteert een betrouwbare evaluatie van veiligheidsprofielen van verbindingen in vroege screenings.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt de kwantificering van DNA-schademerkers af met translationele biomarkerstrategieën.
- Ondersteunt de continuïteit van in vitro ontdekking naar preklinische veiligheidsbeoordeling.
- Maakt een risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling mogelijk van kandidaten met gunstige DNA-reparatieprofielen.
- Biedt mechanisch inzicht in cellulaire responsen die relevant zijn voor ziekte en therapie.
Integratie van pijplijn & workflow
Deze methode voor dubbele immunofluorescentie bevindt zich in het continuüm van vroege ontdekking naar preklinisch onderzoek en maakt een hypothesegestuurde beoordeling van DNA-schade en -herstel in menselijke lymfocyten mogelijk.
- Discovery Biology: Kwantificeert DSB-markerfoci om de betrokkenheid van DNA-reparatiepaden en biologische risicovermindering te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor genotoxiciteitsprofielanalyse van verbindingen.
- Analytics: Biedt tijdreeksmetingen van γH2AX- en 53BP1-foci voor vergelijkende analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische biomarkerstrategieën voor de DNA-schaderespons.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor de beoordeling van DNA-schade in verschillende discovery-programma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de beoordeling van DNA-schade.
- Operationele waarde: Standardiseert de kwantificering van DSB-markers voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium voor genotoxiciteit.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van DNA-reparatieprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Toegang tot gevalideerde antilichamen en fluorescentie-beeldvormingsinfrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie van monsterbereiding en kwantificeringsprotocollen tussen verschillende teams is vereist.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende celtypen of modelsystemen.
- Potentiële onderschatting van de werkelijke DSB-frequentie vanwege beperkingen in de co-lokalisatie van markers.
