Name: In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer endotheelceldifferentiatie uit menselijke iPS-cellen met mechanische stimulatie op een microfluïdische chip. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mechanobiologie en vasculaire ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Research Advanced Grant 2021 van de European Hematology Association, de Global Research Award 2021 van de American Society of Hematology en het Internal Strategy Support Fund ISSF3, gefinancierd door de Welcome Trust en de Universiteit van Edinburgh. We danken Fiona Rossi van de Flow Cytometry Facility voor haar ondersteuning bij de flowcytometrie-analyse. Ten behoeve van open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.

Differentiatie en mechanische stimulatie van hiPSC-afgeleide endotheelcellen

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+before+birth%3A+clues+from+gene+knockouts+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li>
<li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li>
<li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+endothelial+differentiation%3A+Tissue-specific+ECs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li>
<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Het protocol dat we hier beschrijven, maakt het mogelijk om mechanosensitieve endotheelcellen te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen en hun reactie op mechanische stimulatie te bestuderen die wordt gemedieerd door gecontroleerde schuifspanning. Dit protocol is volledig gebaseerd op cytokines en volledig compatibel met GMP-reagentia voor mogelijke vertaling in de productie van cellen voor celtherapie.
De afleiding van hiPSC's biedt wetenschappers een instrumenteel model voor de vroege stadia van embryonale ontwikkeling dat de studie van processen mogelijk maakt die anders moeilijk in vivo te bestuderen zijn. In feite worden menselijke embryonale weefsels die beschikbaar zijn voor onderzoek verzameld uit embryo's die niet circuleren, en dit kan een aanzienlijke invloed hebben op de moleculaire handtekening die wordt gecontroleerd door mechanische signalen. De hier beschreven aanpak maakt live-imaging en real-time studie van de celrespons op schuifspanning mogelijk. De combinatie van hiPSC's met fluïdica biedt een studiemodel dat de beperkte beschikbaarheid en de ontoegankelijkheid van de zich ontwikkelende foetale weefsels overwint wanneer de start van de bloedsomloop de oprichting van het cardiovasculaire en bloedsysteem remodelleert en regelt 3,9,10,25.
Een beperking van het protocol is dat de endotheelcellen die van dit protocol zijn afgeleid, mogelijk niet de verschillende identiteiten weerspiegelen van verschillende endotheelcellen die aanwezig zijn in de zich ontwikkelende weefsels. Om deze beperking te overwinnen, kan een specifieke combinatie van cytokinen nodig zijn tijdens het differentiatieproces voorafgaand aan de fluïdische stimulatie om de gewenste identiteit of weefselspecifiek fenotype26 te verkrijgen. De isolatie van endotheliale subsets kan worden verkregen met behulp van een meer verfijnd immunofenotype tijdens de isolatiestap. Dit protocol isoleert endotheelcellen alleen op basis van de expressie van CD34, waardoor kolomisolatie mogelijk is in plaats van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS); Dit vermindert celdood en het risico op besmetting. Bovendien is dit protocol specifiek ontworpen om de rol van schuifspanning gemedieerd door laminaire stroming te bestuderen. Alternatieve fluïdische benaderingen zullen moeten worden gebruikt om het effect van andere mechanische signalen, zoals uitrekken of compressie, of andere soorten stroming zoals verstoorde of verstoorde stroming te bestuderen.
We hebben eerder aangetoond dat iPSC-afgeleide endotheelcellen de heterogene arterioveneuze cellulaire identiteiten nabootsen27, vergelijkbaar met die waargenomen in de foetale dorsale aorta28,29,30. Dit is met name van belang in de context van de ontwikkeling van bloedvaten en cellulaire specificatie, waarvan bekend is dat deze wordt gecontroleerd door de bloedcirculatie. Studies in verschillende modellen toonden aan dat een gebrek aan circulatie resulteert in een veranderde arterioveneuze specificatie11,14,31. De mechanismen die mechanische signalen verbinden met celspecificatie zijn nog onbekend en de hier beschreven pijplijn maakt verfijnde functionele studies mogelijk die niet in vivo konden worden getest.
Deze pijplijn beschrijft de productie en de stimulatie van endotheelcellen die zijn afgeleid van hiPSC's met behulp van in de handel verkrijgbare fluïdische kanalen, waardoor het niet nodig is om de apparaten te gieten zoals bij de veelgebruikte polydimethylsiloxaan (PDMS)-apparaten 12. Bovendien maakt het gebruik van PDMS-chips het verzamelen van de gestimuleerde cellen bijzonder uitdagend, terwijl met dit protocol de cellen gemakkelijk uit het kanaal kunnen worden gehaald. Dit verbetert de analytische kracht aanzienlijk, waardoor latere analyses mogelijk zijn, zoals proteomische en transcriptomische analyses, flowcytometrie en functionele assays, waarvoor mogelijk verdere kweek of in vivo assays nodig zijn.

Tijdens de embryonale ontwikkeling is het hart het eerste orgaan dat functionaliteit1 tot stand brengt, met detecteerbare samentrekkingen vanaf het vroegste stadium van de vorming van endocardiale buizen2. De bloedsomloop, samen met de mechanische signalen die worden gemedieerd door de bloedstroom in het vat, regelt veel cruciale aspecten van de vroege ontwikkeling. Voorafgaand aan de vestiging van de foetale circulatie is het vaatstelsel georganiseerd in een primaire capillaire plexus; Bij het functioneren van het hart reorganiseert deze plexus zich in veneuze en arteriële vasculatuur3. De rol van mechanische signalen in arterioveneuze specificatie wordt weerspiegeld door de pan-endotheliale expressie van arteriële en veneuze markers voordat de bloedstroom op gang komt4.
Hemodynamische krachten regelen niet alleen de ontwikkeling van het vaatstelsel zelf, maar spelen ook een fundamentele rol bij de controle van de vorming van bloedcellen. Hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) komen voort uit gespecialiseerde endotheelcellen, hemogeen endotheel 5,6,7,8 genaamd, die uitsluitend in het vroege ontwikkelingsstadium in verschillende anatomische regio's van de embryo's aanwezig zijn. Hartdeficiënte modellen, samen met in vitro modellen, hebben aangetoond dat mechanische signalen de HSPC-productie van het hemogene endotheel 9,10,11,12,13,14 instrueren en verhogen.
Van verschillende soorten stromingsdynamica is aangetoond dat ze de celcyclus differentieel regelen 15, waarvan bekend is dat ze belangrijk zijn in zowel hemogeen endotheel16,17 als arteriële celspecificatie18. Al met al zijn mechanische signalen cruciale determinanten van celidentiteit en -functie tijdens de ontwikkeling. Nieuwe in vitro fluïdische apparaten stellen ons in staat om de beperkingen te overwinnen die gepaard gaan met het bestuderen van ontwikkelingsmechanobiologie tijdens de ontwikkeling van menselijk bloed in vivo.
Het algemene doel van het protocol in dit manuscript is om stap voor stap de experimentele pijplijn te beschrijven om het effect van schuifspanning op menselijke endotheelcellen te bestuderen die in vitro zijn afgeleid van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Dit protocol bevat gedetailleerde instructies over de differentiatie van hiPSC's in endotheelcellen en hun daaropvolgende zaaien in fluïdische chips voor het stimulatieprotocol. Hiermee kunnen verschillende in vitro afgeleide endotheelcellen worden getest op hun vermogen om de schuifspanning te detecteren door hun oriëntatie als reactie op de stroom te analyseren. Dit zal andere laboratoria in staat stellen om vragen te beantwoorden over de reactie op schuifspanning en de functionele gevolgen ervan voor verschillende endotheelcelidentiteiten.

<table><tbody><tr><td>0.6 Luer uncoated slide</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Cited als Dissociatiereagens</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aspiration pipette</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Cited als Neuronaal celkweeksupplement (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Versie 8.0.1</td><td>Cited als flowcytometriesoftware</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Microbead kit</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar cell-repellent surface 6-well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Cited als cel-afstotende plaat</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; cell cryopreservation</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>Cited als Cryopreservatieoplossing</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>Cited als DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>EASY Strainer 40 &mu;m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Versie 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Versie 10.7.1</td><td>Cited als flowcytometrieanalysesoftware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>Fluidic unit</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Cited als L-glutamine supplement</td></tr><tr><td>Ham F-12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrin</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>Fujifilm UK LTD</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Pump system</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Cited als Pompsysteem</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>Cited als omgekeerde in-incubator microscoop</td></tr><tr><td>Lyophilised BSA&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>Cited als Magnetische scheider</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Cited als Magnetische kolom</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Notebook for pump system</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 37-41%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>Cited als Perfusieset</td></tr><tr><td>Polystyrene Round Bottom Tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td>Cited als Flowcytometriebuizen</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Versie 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>Pump control software</td><td>ibidi</td><td>versie 1.6.1</td><td>Cited als Pompsoftware</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem cell tecchonologies</td><td>5872</td><td>Cited als Losoplossing</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R&amp;D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R&amp;D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>Cited als Laminine</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R&amp;D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R&amp;D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT Lysis Buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Serial Connector for &micro;-Slides: Sterile, Sterile</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>Cited als Serum-Vrij media voor CD34+ cellen (SFM-34)</td></tr><tr><td>StemPro-CD34 Nutrient Supplement&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>Cited als 34 voedingssupplement</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>Cited als Cultuurmedia&nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Cited als iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td>

in vitro model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

Het hart is het eerste orgaan dat tijdens de ontwikkeling functioneel tot stand komt, waardoor de bloedcirculatie al heel vroeg in de zwangerschap op gang komt. Naast het transporteren van zuurstof en voedingsstoffen om de groei van de foetus te garanderen, regelt de foetale circulatie veel cruciale ontwikkelingsgebeurtenissen die plaatsvinden in de endotheellaag door middel van mechanische signalen. Biomechanische signalen induceren structurele veranderingen in bloedvaten, stellen arterioveneuze specificatie vast en regelen de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen. De ontoegankelijkheid van de zich ontwikkelende weefsels beperkt het begrip van de rol van de bloedsomloop in de vroege menselijke ontwikkeling; Daarom zijn in-vitromodellen cruciale hulpmiddelen voor de studie van vaatmechanobiologie. Dit artikel beschrijft een protocol om endotheelcellen te onderscheiden van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun daaropvolgende zaaien in een fluïdisch apparaat om hun reactie op mechanische signalen te bestuderen. Deze aanpak maakt het mogelijk om endotheelcellen op lange termijn te kweken onder mechanische stimulatie, gevolgd door het ophalen van de endotheelcellen voor fenotypische en functionele karakterisering. Het hier vastgestelde in-vitromodel zal een belangrijke rol spelen bij het ophelderen van de intracellulaire moleculaire mechanismen die de signalering transduceren die wordt gemedieerd door mechanische signalen, die uiteindelijk de ontwikkeling van bloedvaten tijdens het leven van de menselijke foetus orkestreren.

We beschrijven hier een protocol voor de differentiatie en mechano-stimulatie van endotheelcellen afgeleid van hiPSC's dat de studie van hun reactie op mechanische signalen mogelijk maakt (Figuur 1). Dit protocol resulteert in de productie van functioneel mechanosensitieve endotheelcellen. We geven hier representatieve resultaten en beschrijven het verwachte fenotype om te beoordelen hoe de cellen reageren op de cytokinestimulatie tijdens de differentiatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schema van het differentiatie- en mechanische stimulatieprotocol. Schema van het differentiatieprotocol met de timing van de verschillende mengsels van cytokines, de CD34+- celisolatie, het zaaien van fluïdische chips en de uiteindelijke analyse van de mechanisch gestimuleerde cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Cultuur van hiPSC's Het is belangrijk om het protocol te starten vanaf hiPSC's die correct groeien in zelfvernieuwende omstandigheden. Een goede indicatie van de kwaliteit van de cultuur is de snelheid van hun groei. Na het ontdooien hebben de cellen mogelijk 2-3 weken nodig om de juiste groeifase te bereiken die zorgt voor een goede differentiatie. Wanneer de cellen twee keer per week kunnen worden gepasseerd in een verhouding van 1:6 en bijna volledige samenvloeiing bereiken, is dit het moment dat ze klaar zijn om te worden gedifferentieerd op dezelfde dag dat ze moeten worden gepasseerd.
Differentiatie van hiPSC's in endotheelcellen De eerste stap van de differentiatie, bestaande uit de vorming van embryoïde lichamen (EB's), is afhankelijk van de cellijn en moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor de specifieke cellijn die wordt gebruikt. De in protocolstappen 1.3.2.2-1.3.2.4 beschreven dissociatie kan worden gewijzigd door de incubatie met het dissociatiereagens te verminderen of te verlengen en de daaropvolgende dissociatie met de pasteurpipet. Bovendien kunnen voor deze stap andere dissociatiereagentia worden gebruikt, naast de fysieke dissociatie van de kolonies met een snijgereedschap of een P100-pipetpunt. EB's van goede kwaliteit vertonen een gedefinieerde rand op dag 2 van de differentiatie en zien er helder en helder uit wanneer ze met een microscoop worden waargenomen; donkere gebieden kunnen duiden op celdood binnen de EB's (Figuur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> Figuur 2: Morfologie van embryoïde lichamen. (A) Dag 2 embryoïde lichamen met goed gedefinieerde buitenranden en consistente grootte. (B) Dag 2: embryoïde lichamen van slechte kwaliteit die uitgebreide celdood vertonen, wat leidt tot desaggregatie van de structuur. Schaalbalk = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Op dag 2 remt de toevoeging van CHIR99021 aan de EB's het GSK-3-eiwit, wat resulteert in de activering van de Wnt-route. Verschillende cellijnen reageren verschillend op CHIR-behandeling, en dit moet worden getest door het aantal CD34+- cellen dat op dag 8 is verkregen te kwantificeren met behulp van verschillende concentraties (Figuur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> Figuur 3: Endotheelceldifferentiatie met verschillende CHIR-behandelingen. Betrokkenheid van endotheelcellen gekwantificeerd door flowcytometrie op dag 8 van differentiatie door CD34-membraanexpressie, na CHIR-behandeling op dag 2 bij (A) 3 μM, (B) 5 μM en (C) 7 μM. Flowcytometriegegevens werden verkregen met behulp van vijflasercytometers en speciale software (zie Materiaaltabel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
CD34+ cel isolatie Het is belangrijk om te valideren dat de CD34+ verrijking met behulp van de magnetische kralen ten minste 80% CD34+ levert na elutie van de kolom. Om voldoende zuiverheid te garanderen, kan een aliquot van cellen verkregen uit de magnetische isolatie worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie, waarbij ervoor wordt gezorgd dat een andere antilichaamkloon wordt gebruikt dan degene die wordt gebruikt voor de magnetische verrijking. Hier werd de 4H11-kloon gebruikt en werd ~85% zuiverheid bereikt na verrijking (Figuur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> Figuur 4: Membraanexpressie van CD34 voor en na verrijking door magnetische sortering. Dag 8 gedissocieerde embryoïde lichamen (grijs) en cellen na magnetische verrijking (groen) werden gekleurd voor CD34-expressie en geanalyseerd door middel van flowcytometrie, wat een succesvolle verrijking na sortering aantoonde. Flowcytometriegegevens werden verkregen met behulp van vijflasercytometers en speciale software (zie Tabel met materialen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Cellen zaaien in het fluïdische kanaal Bij het zaaien van de cellen in het fluïdische kanaal is het cruciaal om de adhesie en proliferatie van de endotheelcellen te volgen. Na het zaaien hebben de cellen ~5 uur nodig om zich volledig aan het kanaal te hechten (Figuur 5A). In dit stadium kan ook een alternatieve coatingoplossing worden getest om de hechting te verbeteren. Om te bevestigen dat de geteste cellen mechanosensitief zijn en dus in staat zijn om te reageren op mechanische stimulatie, kan de celoriëntatie in de loop van de tijd worden getest. Cellen vóór de stimulatie vertonen een willekeurige oriëntatie (Figuur 5A en Figuur 5C) en heroriënteren zich evenwijdig aan de stroomrichting (Figuur 5B,C). Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om de cellen uit het kanaal te verzamelen om stroomafwaartse analyses uit te voeren, bijvoorbeeld flowcytometrie, voor de studie van hun membraanimmunofenotype, waarbij de endotheelidentiteit van de gestimuleerde cellen wordt verkregen (Figuur 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> Figuur 5: Mechanoresponsiviteit van van hiPSC's afgeleide endotheelcellen . (A) Confluente laag van geïsoleerde CD34+ -cellen 48 uur na het zaaien. (B) Geheroriënteerde laag endotheelcellen 3 dagen onder dynamische kweek. (C) Oriëntatieanalyse van de endotheelcellen na 5 dagen dynamische kweek. (D) CD34-expressieprofiel van cellen die gedurende 5 dagen onder stroom zijn gekweekt. (E) Percentage CD34+- cellen van de celpopulatie dat uit het fluïdische kanaal is gehaald. De beelden werden gemaakt met behulp van een omgekeerde in-incubator microscoop; flowcytometriegegevens werden verkregen met behulp van vijflasercytometers en speciale software (zie Materiaaltabel). Schaalbalken = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagentia</td>
			<td>Concentratie van de voorraad</td>
			<td>Volume toegevoegd</td>
			<td>Definitieve concentratie</td>
		</tr><tr><td>Iscove's gemodificeerde Dulbecco's Medium (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Ham's F-12 Voedingsmengsel (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>N-2 supplement (100x)</td>
			<td>100 x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>50 x</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>Ascorbinezuur</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>1,25 ml</td>
			<td>25 μg/ml</td>
		</tr><tr><td>α-monothioglycerol (MTG)</td>
			<td>11,5 m boven NN</td>
			<td>19,5 μL</td>
			<td>448,5 μM</td>
		</tr><tr><td>Humaan serumalbumine</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td>Holo-Transferrin</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>0,75 ml</td>
			<td>150 μg/ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Samenstelling en recept voor 500 ml serumvrij differentiatiemedium (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Dagen van differentiatie</td>
			<td>Cytokine Mix</td>
			<td>Cytokine</td>
			<td>Definitieve concentratie</td>
		</tr><tr><td>Dag 0 - 2</td>
			<td>Mengen 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr><tr><td>Dag 2</td>
			<td>Mengen 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>Vanaf dag 3</td>
			<td rowspan="2">Mix 3 en 4</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/ml</td>
		</tr><tr><td>Vanaf dag 6</td>
			<td rowspan="8">Mengen 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>EOB</td>
			<td>3 E/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 ng/ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Mengsels van cytokinen die worden gebruikt voor endotheelceldifferentiatie, dagen waarop ze aan het SFD-medium worden toegevoegd en uiteindelijke concentratie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Schuifspanning (dyn/cm2)</td>
			<td>Tijd (h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Tot het einde van het experiment</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Schuifspanningswaarden voor de dynamische cultuur en de duur van hun toepassing.
Aanvullende afbeelding S1: Geometrie en afmetingen van de chip en de slang die voor dit protocol worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende afbeelding S2: Stap-voor-stap handleiding voor de software die de luchtpomp aanstuurt met een beschrijving van elke stap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S3: Leidraad voor de oriëntatieanalyse met behulp van FIJI met de tekening van de celvorm, de elliptische aanpassing en de eindmeting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel S1: Eenheidsgrootte, resuspensievolume en voorraadconcentraties voor cytokines die in het differentiatieprotocol worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Ons onderzoek onderzoekt hoe mechanische signalen het lot van endotheelcellen tijdens de ontwikkeling instrueren, waarvoor we door de mens geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatie combineren met fluïdisch gemedieerde mechanische stimulatie. Endotheelcellen worden constant blootgesteld aan de beweging van bloed, dus belangrijke signalen worden gemist in statische kweek, wat dit de grootste uitdaging maakt bij het bestuderen van endotheelcelbiologie met behulp van traditionele kweeksystemen. Mechanische signalen activeren in feite veel cruciale signaalroutes die over het hoofd kunnen worden gezien in cellen die in statische omstandigheden worden gekweekt.Ons protocol biedt een eenvoudige, stapsgewijze handleiding voor het differentiëren en mechanisch stimuleren van geïnduceerde pluripotente endotheelcellen uit stamcellen. Dit zal veel laboratoria helpen bij het adopteren van een thermische kweek om gemakkelijk vragen te beantwoorden over het gedrag van endotheelcellen terwijl ze onder stroom zijn.

in-vitro-model-fetal-human-vessel-on-chip-to-study-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Protocollen voor het bestuderen van de embryonale en perinatale lymfkliertest aorta met behulp van in vivo klonale analyse en lot toewijzing, aorta explantaten en geïsoleerde gladde spier cellen zijn gedetailleerd hier. Deze uiteenlopende benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta in normale ontwikkeling en de pathogenese in ziekte.

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Hier ontwikkelden we een menselijk aorta gladde spiercel orgaan-op-een-chip model om de in vivo biomechanische stam van gladde spiercellen in de menselijke aortawand te repliceren.

Constructie van een humane Aorta gladde spiercel orgaan-op-A-chip model voor het recapuleren van biomechanische stam in de aortawand

Hier presenteren we een protocol voor het bouwen van een organ-on-chip (OOC) -systeem dat is ontworpen om pneumonectomie na te bootsen. Dit systeem onderzoekt de mogelijke correlatie tussen glycocalyxstoornissen en complicaties na pneumonectomie.

Modellering van de endotheliale glycocalyx na pneumonectomie in een 3D-fluïdische chip - een benadering voor het fabriceren van een vasculair orgaan-op-chip-systeem

Dit artikel beschrijft een methode voor het creëren van een mechanische vaatbeschadiging bij zebravisembryo's. Dit verwondingsmodel biedt een platform voor het bestuderen van hemostasis, verwondingsgerelateerde ontsteking en wondgenezing in een organisme dat bij uitstek geschikt is voor real-time microscopie.

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Leer endotheelceldifferentiatie uit menselijke iPS-cellen met mechanische stimulatie op een microfluïdische chip. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mechanobiologie en vasculaire ontwikkeling.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

Meer video's verkennen