Name: Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Leer een gestroomlijnde intravitale beeldvormingsmethode voor langetermijnmonitoring van epitheelweefseldynamiek bij levende muizen met omgekeerde confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Valentina Greco voor de K14-mCherry-H2B muizen. We zijn de Emory University Physics Department Machine Shop dankbaar voor het genereren van de glazen dekglaasjes. Dit werk werd gefinancierd door de Career Development Award #IK2 BX005370 van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs BLRD Service aan LS, NIH Awards RF1-AG079269 en R56-AG072473 aan MJMR, en I3 Emory SOM / GT Computational and Data Analysis Award aan MJMR.

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik van Emory University en Atlanta Veterans Affairs Medical Center en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Het live beeldvormingsinzetstuk installeren op de omgekeerde microscooptafel
<ol><li>Construeer het inlegvel met behulp van .stl-bestanden (aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3) met vermelding van de 3D-afmetingen en het ontwerp (zie afbeelding 1 en afbeelding 2A), een 3D-printer en polymelkzuur (PLA).</li>
	<li>Plaats het inzetstuk (Figuur 2B,C) voorzichtig in de grote groef van de microscooptafel (Figuur 2C en Figuur 3A). Gebruik schroeven om het inzetstuk vast te zetten via vier schroefgaten in elke hoek van het inzetstuk (Figuur 2B-C). NOTITIE: Het inzetstuk is bidirectioneel en kan 180° worden gedraaid, afhankelijk van de oriëntatie van de microscooptafel en het anesthesieapparaat.</li>
	<li>Schuif de warmteplaat met de kant naar beneden in de plugzijde van het inzetstuk (Figuur 2D) zodat het apparaat bovenop de onderste inzetgroeven ligt met de stekkerpoort onder de tafel door (Figuur 3B).</li>
	<li>Lijn de gegroefde ronde opening in het inzetstuk uit met een 40x onderdompelingsobjectief voor siliconenolie (Figuur 3C) en breng siliconenolie aan op het midden van het objectief.<ol><li>Als u gedurende langere perioden (>1 uur) beeldvorming maakt, breng dan een flinke klodder olie aan die tijdens de beeldvorming op het dekglaasje/objectief-interface blijft staan. Zorg ervoor dat er geen olie over de randen van de lens wordt gemorst.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een injectiespuit om een kleine hoeveelheid vacuümvet langs de gegroefde ronde opening aan te brengen en leg de dekglaasjesschijf erop om het inzetstuk af te dichten (Figuur 3D). OPMERKING: De dekglaasjesschijf wordt gemaakt door de wanden van een celkweekschaal van 35 mm x 10 mm met glazen bodem te verwijderen (uitgevoerd door een machinewerkplaats).</li>
	<li>Til het 40x objectief op totdat de olie de onderkant van het glazen dekglaasje kust.</li>
</ol>2. Isofluraanconfiguratie en muisvoorbereiding
<ol><li>Plaats de elektronische verdampercomponenten met laag debiet (anesthesiekamer, slang, verdamper, houtskoolbus) zodat de neuskegel en de bevestigde slang het inzetstuk kunnen bereiken (Figuur 3A). LET OP: Isofluraan is een inhalatie-anestheticum en moet met zorg worden behandeld om morsen te voorkomen en menselijke blootstelling tot een minimum te beperken.</li>
	<li>Meet voor gebruik het gewicht van de isofluraanfles en log deze uit. Bevestig de dop van de elektronische vaporizer aan de isofluraanfles.</li>
	<li>Sluit het netsnoer aan op de elektronische vaporizer. Sluit de blauwe neuskegelclips en open de witte inductiekamerclips om luchtstroom door de kamer in de houtskoolbus mogelijk te maken. Verwijder de rode omgevingsluchtkap aan de linkerkant van de machine om luchtstroom mogelijk te maken.</li>
	<li>Laat het systeem 5 minuten opwarmen met 200 ml/min (laag debiet) en 2% isofluraan. NOTITIE: Hoewel de instelling van de neuskegel is geselecteerd, moet de blauwe neuskegellijn gesloten blijven en moet de witte inductiekamerlijn open blijven.</li>
	<li>Zodra het systeem goed in evenwicht is, verwijdert u de leidingen om de resterende isofluraan uit de kamer te verwijderen.</li>
	<li>Plaats de muis in de inductiekamer en selecteer High Flow. Voltooi alle muizenvoorbereidingen (d.w.z. ontharen, plaatselijke medicijnafgifte, aanbrengen van oogzalf, enz.) voordat het lichaam van het dier op de insert wordt gelegd. Controleer of de muis volledig verdoofd is met behulp van de teenknijpreflexmethode.<ol><li>Gebruik met het been gestrekt een vingernagel om de teen stevig vast te knijpen zonder fysieke schade aan te richten. Als de muis een positieve reactie op de stimulus vertoont (d.w.z. terugtrekking van de benen, spiertrekkingen van de voet, enz.), Ga dan door met het toedienen van verdoving in de kamer totdat er geen reactie wordt waargenomen. Eenmaal op de juiste manier verdoofd, zou de ademhalingsfrequentie van de muis moeten vertragen tot ~55-65 ademhalingen per minuut18.</li>
	</ol></li>
	<li>Wanneer de muis volledig is verdoofd, selecteert u opnieuw High Flow om de toediening van isofluraan te stoppen. Leeg de kamer voordat u deze opent en pas de clips aan (blauw: open; wit: gesloten) om isofluraan door de neuskegel af te geven. Selecteer Low Flow terwijl de neuskegel aan de muis is bevestigd om door te gaan met de toediening van isofluraan.</li>
	<li>Rijg isofluraanslang met de bevestigde neuskegel door de hoekslangbeugel op het inzetstuk (Figuur 3A en Figuur 5).</li>
</ol>3. Plaatsing van de muis op het inzetstuk voor intravitale beeldvorming
<ol><li>Sluit de warmteplaat aan op de controller (met een aangesloten anale sonde), schakel hem in en laat de plaat 36 °C bereiken (Figuur 4A).</li>
	<li>Haal de verdoofde muis uit de inductiekamer en leg hem over de warmteplaat (Figuur 4B en Figuur 5A). Voer de overdracht van kamer naar inbrenging snel uit om de tijd dat de muis actief is zonder inhalatie-anesthesie te minimaliseren.</li>
	<li>Bevestig de neuskegel op de muis (Figuur 4B, C en Figuur 5). Gebruik indien nodig tape om de hoek en positionering van de neuskegel verder vast te zetten.</li>
	<li>Plaats de anale sonde en pas de temperatuur van de controller aan totdat de lichaamstemperatuur van de muis stabiel is op ~36 °C (Figuur 4A,B). Nadat de muis correct is gepositioneerd, gebruikt u indien nodig plastic huishoudfolie om warmte vast te houden om de juiste lichaamstemperatuur verder te ondersteunen (Figuur 4C).</li>
	<li>Plaats de muis zo dat de kop is uitgelijnd met de dekglaasjesschijf en immobiliseer het oor op het midden van het glazen dekglaasje met behulp van een metalen oorclip (Figuur 5A,B) of tape (Figuur 5C). NOTITIE: De druk van de metalen oorclip op het oor kan worden aangepast door de schroef los te draaien waarmee de clip aan het inzetstuk is bevestigd. Er kan een metalen veer worden toegevoegd voor meer flexibiliteit bij het aandraaien van de clip.<ol><li>Om de locatie van de oorclip te wijzigen, draait u de bout los met een 2.5 mm inbussleutel en brengt u deze over naar de secundaire plaats (Figuur 2B,C). Wanneer u de oorclip weer in elkaar zet, plaatst u de clip tegen het inzetstuk, gevolgd door de ring erop. Gebruik een bout om de clip stevig vast te maken met lichte kracht om de clip te draaien.</li>
	</ol></li>
	<li>Pas de z-positionering van het objectief aan totdat de cellen zich binnen de brandpuntsafstand bevinden (Figuur 6A,D). Stel de z-stack- en time-lapse-parameters in volgens de experimentele doelen en begin met beeldacquisitie. NOTITIE: Als de juiste instelling is bereikt, kan het oor van de muis gedurende ten minste 3 opeenvolgende uren worden afgebeeld (Figuur 6A',D').<ol><li>Zodra de grenzen van de z-stack zijn ingesteld, past u het laservermogen en de versterking aan om ervoor te zorgen dat geen enkel z-vlak oververzadigd raakt om fotobleken te minimaliseren. Bepaal de time-lapse-parameters met behulp van de totale dikte van de z-stack, stapnummers (Nyquist-bemonstering aanbevolen) en tijdsintervallen.</li>
		<li>Bepaal de beeldvormingsparameters (tijdsintervallen, totale beeldvormingstijd, enz.) met behulp van meerdere factoren, waaronder levensvatbaarheid van dieren onder anesthesie, lasergeïnduceerde fotobleking/fototoxiciteit en het doel van live beeldvorming (d.w.z. dynamiek van celdeling, cel-celinteracties, enz.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Beëindiging van de beeldvorming
<ol><li>Schakel het watercirculerende warmtekussen in en stel het in op Continue cyclus en 35 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat de beeldacquisitie wordt beëindigd.</li>
	<li>Selecteer na voltooiing van de beeldvorming Low Flow op de elektronische verdamper om de afgifte van isofluraan te stoppen en verplaats de muis naar een warmtekussen totdat hij ambulant is.</li>
	<li>Eenmaal wakker, beweegt u de muis terug naar de transfercontainer terwijl u op een warmtekussen blijft totdat u volledig ambulant bent. Houd de muis consequent in de gaten terwijl u op het warmtekussen ligt totdat deze reageert.</li>
	<li>Klik op de elektronische vaporizer op Menu selecteren > Verdovingscontrole > Leegmaken. Verwijder de isofluraanfles uit het systeem en plaats de dop van de fabrikant terug op de fles.</li>
	<li>Meet het gewicht van de isofluraanfles en de houtskoolbus en voer de gewichten in het logboek in. Zodra de houtskoolbus 50 g weegt ten opzichte van de nulmeting, gooit u de bus weg en vervangt u deze door een nieuw apparaat. Doe de isofluraan terug in het lockbox.</li>
	<li>Verwijder het dekglaasje en veeg schoon met lenspapier en lenzenvloeistof. Op de juiste manier bewaren om krassen voor hergebruik te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder de anesthesieslang van de insteekbeugel en schroef de insteekplaats los van de microscooptafel.</li>
</ol>

Intravitale beeldvorming met behulp van een omgekeerde microscoop om de dynamiek van huidcellen te volgen

<ol><li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li>
<li>Nal Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196(2022).</li>
<li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li>
<li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li>
<li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li>
<li>Pal Arndt,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra%2Fextraglomerular+feedback+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).</li>
<li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).</li>
<li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li>
<li>Ral Li,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Tal Tumbar,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

In deze studie presenteren we een nieuw hulpmiddel dat stabiele, langdurige intravitale beeldvorming van intacte epitheel van de huid van muizen mogelijk maakt op omgekeerde confocale microscopen. Deze uitvinding is gemaakt van PLA, het meest voorkomende en goedkope 3D-printbare materiaal; alle in-house 3D-printkosten voor deze insert bedragen <$5. De twee afzonderlijke insteekstukken (afbeelding 1, aanvullende vijl 1 en aanvullende vijl 2) kunnen eenvoudig ...

Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel waarmee het gedrag van cellen in hun onverstoorbare in vivo omgevingen kan worden gevolgd. Deze unieke methode heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de innerlijke werking van complexe orgaansystemen van zoogdieren, waaronder de long1, de hersenen2, de lever3, de borstklier4, de darm5 en de huid6. Bovendien heeft deze aanpak veranderingen in het celgedrag tijdens de ontwikkeling van tumoren7, wondgenezing8,9, ontsteking10 en andere uiteenlopende pathologieën in situ aan het licht gebracht. In deze studie richten we ons op het verbeteren van de toegankelijkheid van intravitale microscopie om levende epitheliale en stromale dynamiek in intacte muizenhuid in beeld te brengen. Het begrijpen van celgedrag in de huid van zoogdieren is van groot klinisch belang vanwege de opmerkelijke regeneratieve en tumorigene capaciteit van dit weefsel.
Intravitale beeldvorming bij muizen is voornamelijk uitgevoerd met behulp van rechtopstaande multifotonenmicroscopen vanwege hun vermogen om beeldvorming met hoge resolutie te bieden op weefseldiepten >100 μm11,12. Desalniettemin missen deze instrumenten de veelzijdigheid van het werkpaard en de meer algemene toegankelijkheid van omgekeerde confocale microscopen, die gebruiksvriendelijker en kosteneffectiever zijn, de mogelijkheid bieden om gekweekte cellen in beeld te brengen, geen volledige duisternis vereisen tijdens beeldacquisitie en over het algemeen veiliger zijn, naast andere opmerkelijke voordelen13,14. In deze studie presenteren we een nieuw hulpmiddel dat de toegankelijkheid van intravitale beeldvorming aanzienlijk verbetert door deze benadering aan te passen voor omgekeerde confocale microscopen.
Hier presenteren we een 3D-geprint ontwerp van een op maat gemaakt inzetstuk dat verschillende belangrijke kenmerken bevat om stabiele, langdurige intravitale beeldvorming van de huid van muizenoren op een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5). Deze gespecialiseerde functies omvatten een offset-objectiefgat waardoor het volledige lichaam van een volwassen muis volledig plat kan liggen tijdens beeldvorming. Dit minimaliseert de trillingsinterferentie van lichaamsbewegingen van muizen op beeldvorming en elimineert de noodzaak om ketamine en xylazine toe te dienen om de ademhaling te dempen, een praktijk die vaak gepaard gaat met intravitale beeldvorming6. Bovendien positioneren hoekbeugels op het inzetstuk een isofluraanneuskegel correct om uit te lijnen met het gezicht van de muis, immobiliseert een metalen oorclip het muisoor op een op maat gemaakte dekglaasje en ligt een optionele afneembare biofeedback-warmteplaat met gesloten lus vlak in het inzetstuk om de lichaamstemperatuur van de muis te ondersteunen tijdens lange beeldvormingssessies. De op maat gemaakte dekglaasjeschijf, die een plat oppervlak biedt dat essentieel is voor het hoofd en het oor van de muis om plat te liggen, werd gegenereerd in een machinewerkplaats door de wanden van een generiek dekglaasje met celkweekschaal te verwijderen. Het gebruik van een 40x siliconen olie-immersielens (1,25 numerieke apertuur [N.A.], 0,3 mm werkafstand) in combinatie met de dekglaasjesschijf en het op maat gemaakte podiuminzetstuk zorgt voor beelden met een hoge resolutie >50 μm diep in de oordermis.
Om de functionaliteit van dit nieuwe omgekeerde microscooptafelinzetstuk te testen, hebben we z-stacks vastgelegd die alle epidermale epitheellagen overspannen gedurende een tijdsverloop van 3 uur in het oor van een levende transgene K14-H2B-mCherry15 volwassen muis (epitheelkernen in deze muislijn bevatten een rood fluorescerend label) (Figuur 6A-A'). We hebben ook z-stacks vastgelegd die verschillende fibroblastlagen in de huiddermis overspannen gedurende een tijdsverloop van 3 uur in het oor van een levende transgene Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 volwassen muis (fibroblastkernen in deze muizenlijn bevatten een groen fluorescerend label na doxycycline-inductie) (Figuur 6B-D'). Onze gegevens met hoge resolutie tonen een consistente stabiliteit aan door gebrek aan drift in de x-, y- en z-vlakken, en bewijzen zo de effectiviteit van dit nieuwe intravitale beeldvormingsinstrument voor gebruik op omgekeerde microscopen. Belangrijk is dat de afmetingen van dit 3D-geprinte podiuminzetstuk kunnen worden aangepast, zoals beschreven in Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2 en Aanvullend bestand 3, zodat het op elke omgekeerde microscoop past, en dat de positionering van de objectiefopening kan worden verplaatst naar alternatieve locaties binnen het inzetstuk om beter geschikt te zijn voor het afbeelden van een bepaald weefsel en/of diermodel van belang. Deze uitvinding kan dus individuele laboratoria, of onderzoekers met confocale toegang tot kernfaciliteiten, in staat stellen dit instrument aan te passen aan hun unieke intravitale beeldvormingsbehoeften, waardoor de evaluatie van diverse in vivo celbiologie wordt gestroomlijnd.

<table><tbody><tr><td>3D Printer</td><td>Qudi Tech</td><td>i-Fast</td><td>3D afdrukken met PLA-materiaal</td></tr><tr><td>40x 1.25NA siliconen objectieflens</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafje met katoenen punt</td><td>VWR</td><td>76337-046</td><td>Crème/zalf applicatie</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Induces GFP labeling van fibroblast kernen in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP muizen</td></tr><tr><td>Kruiskopschroevendraaier (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Bevestiging van inzet op microscooptafel</td></tr><tr><td>Kruiskopschroeven x 4 (#6-32)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Schroef inzet op microscooptafel</td></tr><tr><td>Cultuurschaal met glazen bodem</td><td>chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1811-002</td><td>Gemodificeerd door het verwijderen van de wanden van de schaal voor gebruik als dekglas schijf compatibel met live inzet; 35 mm brede schijf bevat 20 mm brede glazen dekglas; de wanden van de schaal werden verwijderd door machine werkplaats</td></tr><tr><td>Heat Plate controller</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td>Dier Temperatuur Controller - Laag Voltage; anale sonde bevestiging voor muis lichaamstemperatuur monitoring</td></tr><tr><td>Zeskantsleutel (1,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Voor M3 instelschroef aanpassingen</td></tr><tr><td>Zeskantsleutel (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Aanpassen van de spanning op metalen oorclip</td></tr><tr><td>Intravital Imaging Inzet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Med-Vet International</td><td>HPA030782-100uL</td><td>Muis anesthesie</td></tr><tr><td>Labeling Tape (of Scotch Tape)</td><td>VWR</td><td>10127-458</td><td>Alternatief voor metalen oorclip om oor te immobiliseren op dekglas</td></tr><tr><td>Metalen bevestiging</td><td></td><td></td><td>gebruikt als oorclip</td></tr><tr><td>Muis: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:034459</td><td>Fibrroblast-specifieke promotor die doxycycline-induceerbare rtTA expressie aandrijft</td></tr><tr><td>Muis: K14-H2BPAmCherry</td><td>Met dank aan Dr. Valentina Greco van Yale University</td><td></td><td>Labelt epidermale epitheliale celkernen met mCherry; in de tekst vermeld als "K14-H2B-mCherry"</td></tr><tr><td>Muis: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:005104</td><td>Labelt fibroblast kernen met GFP indien gecombineerd met Pdgfra-rtTA en geïnduceerd met doxycycline</td></tr><tr><td>Multipurpose Sealing Wrap</td><td>Glad</td><td></td><td>Verhoogt muis warmte</td></tr><tr><td>Optixcare</td><td>VWR</td><td>MSPP-078932779</td><td>Oogsmeer</td></tr><tr><td>Schroeven x 3 (M3; 6 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SS3M6</td><td>Bevestiging voor heatplate module</td></tr><tr><td>Silicone Onderdompeling Olie</td><td></td><td></td><td>Toegepast op 40x siliconen objectief</td></tr><tr><td>Kleine Dieren Verwarmingsplaat</td><td>Physitemp</td><td>HP-4M</td><td>Biedt warmte aan dier</td></tr><tr><td>Somnoflow Low-Flow Elektronische Verdamper</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td>Muis anesthesie</td></tr><tr><td>Vacuum Vet</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP1095</td><td>Bevestigt dekglas schijf aan inzet</td></tr><tr><td>Veet</td><td></td><td></td><td>Haarverwijdering</td></tr><tr><td>Watercirculerende warmtepad</td><td>Stryker Medical</td><td>TP700</td><td>voor muis herstel na beeldvorming</td></tr></tbody></table>

gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Het begrijpen van normaal en afwijkend in vivo celgedrag is noodzakelijk om klinische interventies te ontwikkelen om het ontstaan en de progressie van de ziekte te dwarsbomen. Het is daarom van cruciaal belang om beeldvormingsbenaderingen te optimaliseren die de observatie van celdynamiek in situ vergemakkelijken, waarbij de weefselstructuur en -samenstelling onverstoord blijven. De epidermis is de buitenste barrière van het lichaam en de bron van de meest voorkomende vormen van kanker bij de mens, namelijk huidcarcinomen. De toegankelijkheid van huidweefsel biedt een unieke kans om het gedrag van epitheel- en dermale cellen bij intacte dieren te volgen met behulp van niet-invasieve intravitale microscopie. Desalniettemin is deze geavanceerde beeldvormingsbenadering voornamelijk bereikt met behulp van rechtopstaande multifotonmicroscopen, die voor de meeste onderzoekers een belangrijke toetredingsdrempel vormen. Deze studie presenteert een op maat ontworpen, 3D-geprinte microscooptafel die geschikt is voor gebruik met omgekeerde confocale microscopen, waardoor de intravitale beeldvorming op lange termijn van de oorhuid bij levende transgene muizen wordt gestroomlijnd. Wij zijn van mening dat deze veelzijdige uitvinding, die kan worden aangepast aan het merk en model van de omgekeerde microscoop naar keuze en kan worden aangepast om extra orgaansystemen in beeld te brengen, van onschatbare waarde zal zijn voor de grotere wetenschappelijke onderzoeksgemeenschap door de toegankelijkheid van intravitale microscopie aanzienlijk te verbeteren. Deze technologische vooruitgang is van cruciaal belang voor het versterken van ons begrip van de dynamiek van levende cellen in normale en ziektecontexten.

De juiste montage van het live imaging-inzetstuk op een omgekeerde confocale microscoop en de juiste oriëntatie van een transgene muis bovenop het inzetstuk wordt gevalideerd door het verkrijgen van z-stapels fluorescerend gelabeld, levend oorweefsel gedurende een tijdsverloop ≥1 uur met minimaal bewijs van drift in de x-, y- en z-as. Beelden moeten met consistente tussenpozen worden vastgelegd (intervaltijd hangt af van de biologische vraag, sterkte van het fluorescentiesignaal, enz.), zodat celdynamiek en beelddrift in...

Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

We ontwikkelden een tool om intravitale beeldvorming uit te voeren op levende muizen met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. Dit stelt ons in staat om de dynamiek van huidcellen tijdens de homeostase te volgen en het celgedrag tijdens het begin en de progressie van de ziekte te vergelijken. Multifotonenmicroscopie is de primaire benadering die wordt toegepast om intravitale celtracking te bereiken.De nadelen van deze microscopen zijn echter de beperkte dagelijkse beeldvorming, de hoge kosten en de technische complexiteit. Onze nieuwe tool maakt het gebruik van veelzijdige omgekeerde confocale microscopen mogelijk voor in vivo intravitale beeldvorming. Door het ontwerpbestand aan te passen, kunnen de afmetingen van de tafelwisselplaat worden aangepast aan elk merk omgekeerde microscoop.Het objectiefgat kan worden vergroot of verkleind en verplaatst om in elk diermodel en weefsel naar keuze te passen.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

This video demonstrates the visualization of γδ intraepithelial lymphocytes (IELs) in transgenic mice using confocal microscopy. The surgical procedure involves creating a perforation line and making a longitudinal incision to expose the intestinal mucosa and villi. The transgenic mice express reporter proteins exclusively in γδ IELs, allowing their tracking. Intravital imaging captures the dynamic movement of green fluorescence-labeled γδ IELs along the intestinal epithelial cell's basement...

Intravital Visualization of Gamma Delta Intraepithelial Lymphocytes

Een nieuwe benadering van het combineren van de intra-oculaire transplantatie en confocale microscopie maakt longitudinale, niet-invasieve real-time beeldvorming met single-cell resolutie binnen geënt...

Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming met Single-cell resolutie in real-time

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Leer een gestroomlijnde intravitale beeldvormingsmethode voor langetermijnmonitoring van epitheelweefseldynamiek bij levende muizen met omgekeerde confocale microscopie.

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop (Video) | JoVE Journal

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Meer video's verkennen