Name: Gerichte uitschakeling van genen in de plexus choroideus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Ontdek gerichte gentechnieken voor de plexus choroideus met ICV-injecties en AAV2/5-vectoren in muismodellen. Deze methode vermindert immuuncelinfiltratie en biedt nieuwe inzichten voor multiple sclerose-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de steun van de National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 31800903, toegekend aan W. Zheng) en het Wenzhou Science and Technology Project (nr. Y2020426, toegekend aan Y. Y. Weng) voor dit werk.

Alle dierprocedures die in deze studie worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn uiteengezet in de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Wenzhou Medical University.
1. Dieren
<ol><li>Koop mannelijke C57BL/6 muizen van 8-12 weken oud met een gewicht van 20-22 g.</li>
	<li>Verkrijg de transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) muislijn en mannelijke A2AR flox/flox muizen.</li>
	<li>Wijs de muizen willekeurig toe aan twee groepen en huisvest ze in kooien, met een maximum van vijf muizen per kooi, onder een standaard 12 uur licht/12 uur donkere cyclus gedurende 1 week.</li>
	<li>Voorzie de muizen van voldoende voedsel en water en houd ze op een constante temperatuur van 25 °C.</li>
</ol>2. ChP-specifieke knockdown van A2ARs met AAV2/5-shRNA
<ol><li>Weeg elke muis en noteer de waarden.</li>
	<li>Verdoof de muizen intraperitoneaal met 1% pentobarbital-natrium in een dosering van 6-8 ml/kg overeenkomend met 60-80 mg/kg pentobarbital en plaats de muis op een verwarmingskussen om hem warm te houden. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de juiste dosering pentobarbital-natrium toe te dienen op basis van het gewicht van de muis om een succesvolle operatie te garanderen. De anesthesie mag niet te diep zijn, omdat dit kan leiden tot sterfte, maar mag niet te oppervlakkig zijn, omdat de muis tijdens de procedure wakker kan worden, wat de effectiviteit van de virusinjectie kan beïnvloeden. Controleer de juiste anesthesiedosis door in de teen te knijpen en ervoor te zorgen dat muizen niet reageren.</li>
	<li>Gebruik een gespecialiseerd muizenscheerapparaat om het bovenste haar van de verdoofde muizen te trimmen.</li>
	<li>Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen en bevestig de muizen op een stereotaxisch apparaat om de hersenen te immobiliseren. Dek het dier af met een steriel laken.</li>
	<li>Steriliseer de huid van het hoofd en de nek van de muizen grondig met drie rondes jodoforontsmettingsmiddel en 75% alcohol om postoperatieve infectie te verminderen. Breng vervolgens plaatselijk 1% lidocaïne aan op de hoofdhuid van muizen en maak een kleine incisie om de schedel volledig bloot te leggen onder een microscoop. NOTITIE: Gebruik tijdens de hele procedure steriele instrumenten.</li>
	<li>Bereid twee spuiten van 10 μL voor: één met aangekochte AAV2/5-A2AR-shRNA (titer: 6,27 × 10 9 vg/μL) en de andere met aangekochte AAV2/5-Scramble (titer: 6,21 × 109 vg/μL). NOTITIE: Bij gebruik van de spuit moet het voorste uiteinde worden aangesloten op een glazen capillair en kan een bereik van 10 μL worden verkregen door de lengte van het glazen capillair te regelen.</li>
	<li>Gebruik de microscoop om het bregma en lambda te lokaliseren en stel het coördinatenpunt in (AP: -0,58; ML: ±1.10; DL: -2,20) op de spuit van 10 μl (Figuur 1). Het coördinatenpunt is gebaseerd op de stereotactische atlas15 van de muizenhersenen.</li>
	<li>Boor een klein gaatje in de schedel op het aangepaste coördinatenpunt. OPMERKING: Onder de microscoop wordt geboord met een steriele microboor tegen het oppervlak van de schedel. Na het boren, door het verwijderen van de hersenvliezen die de hersenen bedekken en het onderliggende hersenparenchym bloot te leggen, wordt letsel aan de bloedvaten voorkomen. Deze stap voorkomt dat de punt van het glazen capillair wordt afgebroken door de hersenvliezen. De diameter van het geboorde gat moet voldoende zijn om de punt van de naald in het hersenweefsel te laten komen.</li>
	<li>Dien 2 μL AAV2/5-A2AR-shRNA-virus toe in het hersenventrikel via laterale injectie met een constante snelheid van 100 nL/min. Houd de naald 10 minuten op zijn plaats voordat u zich terugtrekt. Merk op dat het virus werd toegediend met eenzijdige injectie.</li>
	<li>Sluit de beschadigde huid onmiddellijk af met medische biofibrinelijm om virusverlies te voorkomen, die na het verwijderen van de naald met CSF kan worden uitgespoeld als de lijm niet snel wordt aangebracht. Gebruik ook geen wattenstaafjes om het CSF af te vegen, omdat dit ook virusverlies kan veroorzaken.</li>
	<li>Om het herstel te vergemakkelijken, plaatst u de muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op 37,0 ± 0,5 °C te houden en brengt u plaatselijk 1% lidocaïne aan op de hoofdhuid van de muis. Laat de muizen 2 weken herstellen voordat ze het EAE-model induceren, aangezien deze periode nodig is voor de expressie van het AAV2/5-A 2A R-shRNA-virus en de daaropvolgende A2AR-knockdown.</li>
</ol>3. ChP-specifieke knockdown van A2AR met een Cre/locus van X-overP1 (Cre/LoxP) systeem
OPMERKING: De volgende procedures kunnen worden uitgevoerd met behulp van de eerder beschreven methode. Raadpleeg de stappen 2.1-2.11 voor gedetailleerde injectiemethoden.
<ol><li>Injecteer 2 μL CRE-TAT-recombinase in elke laterale ventrikel van een Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-muis als experimentele groep en 2 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) als controlegroep. Injecteer volgens hetzelfde protocol als hierboven (sectie 2) 2 μL CRE-TAT-recombinase in elk van de laterale ventrikels van A2AR flox/flox-muizen samen met 2 μL steriele PBS als controlegroep.</li>
	<li>Bereid ingevroren weefselsecties voor en voer nucleaire kleuring uit 2 weken na de CRE-TAT-recombinase-injectie. Zie stap 4.1-4.3 voor meer informatie.</li>
</ol>4. Transcardiale perfusie bij muizen
<ol><li>Dien 60-80 mg/kg pentobarbital-natrium toe om de muizen diep te verdoven. Bevestig het anesthesievlak door in de teen te knijpen en transcardiale perfusie uit te voeren met 40 ml steriele PBS-oplossing gevolgd door 20 ml 4% paraformaldehyde (PFA). OPMERKING: Succesvolle perfusie wordt aangegeven door een witte kleur in de lever, terwijl de aanwezigheid van vergrote longen of PBS-uitstroom uit de mond tijdens perfusie suggereert dat de procedure is mislukt.</li>
	<li>Extraheer snel de muizenhersenen, zodat de eiwitafbraak minimaal is.</li>
	<li>Dompel de muizenhersenen 's nachts onder in 4% PFA/PBS voor postfixatie, gevolgd door vervanging door 30% sucrose PB-oplossing gedurende 72 uur. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om overmatige uitdroging van het hersenweefsel te voorkomen, dus de hersenen mogen niet te lang in de sucrose PB-oplossing worden gelaten.</li>
</ol>5. Couperen en kleuren van bevroren weefsel
<ol><li>Veranker de eerder gedehydrateerde muizenhersenen in lijm met optimale snijtemperatuur (OCT), bevries de ingebedde hersenen en gebruik een glijdende microtoom om coronale secties met een dikte van 20 μm te snijden.</li>
	<li>Plaats de hersensecties op het glasplaatje. Zodra de hersensecties droog zijn, bewaar je ze in een koelkast van -20 °C voor volgende experimenten.</li>
	<li>Plaats elk glasplaatje in een framekast en dompel het frame onder in een bak gevuld met PBS om het glaasje grondig af te spoelen. Spoel de hersenglaasjes drie keer voorzichtig af met PBS-oplossing, telkens gedurende 10 minuten. NOTITIE: Voorzichtigheid is geboden om te voorkomen dat de hersensecties van het glasplaatje vallen.</li>
	<li>Kleuring van de hersenglaasjes met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-oplossing gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Spoel de hersenglaasjes gedurende 5 minuten met PBS-oplossing.</li>
	<li>Breng een druppel antifade-montagemedium aan op de hersensecties.</li>
	<li>Plaats een dekglaasje op de hersensecties, verzegel het dekglaasje met nagellak en analyseer de secties met een conventionele fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>6. EAE-inductie
NOTITIE: Voer EAE-inductie uit na 2 weken van de shRNA- of CRE-TAT-recombinase-injectie11.
<ol><li>Maak een waterige oplossing door 2,5 mg myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG35-55) te mengen met 2 ml PBS. Bereid een complete Freunds-adjuvans-olieoplossing (CFA) door M. tuberculosis (H37Ra) te mengen met onvolledig Freunds-adjuvans (IFA).</li>
	<li>Meng de waterige en olieoplossingen in een verhouding van 1:1. Gebruik een T-stuk om het mengsel in een olie-in-water-toestand te kloppen. OPMERKING: De T-pijp wordt ook wel een driewegpijp genoemd. Het is een plastic buis die de richting van de stromende oplossing kan regelen om de MOG35-55 en CFA volledig te mengen.</li>
	<li>Gebruik een hogesnelheidshomogenisator om de MOG-antigeenemulsie voor het EAE-model onder ijsbadomstandigheden te maken.</li>
	<li>Verdoof de muizen intraperitoneaal met 1% pentobarbitalnatrium in een dosering van 6-8 ml/kg overeenkomend met 60-80 mg/kg pentobarbital.</li>
	<li>Injecteer de MOG-antigeenemulsie subcutaan op vier verschillende punten (nek, rug, linker- en rechterheup) met een volume van 10 ml/kg voor een totaal van vier injecties elk. OPMERKING: Het is belangrijk om de injectieplaats zorgvuldig te selecteren, aangezien verschillende plaatsen verschillende effecten kunnen hebben op de morbiditeit en mortaliteit van muizen. Bovendien kunnen herhaalde MOG-injecties leiden tot immuuntolerantie, dus koos het onderzoeksteam voor een enkele injectiemethode om dit potentiële probleem te voorkomen.</li>
	<li>Injecteer onmiddellijk 500 ng/ml kinkhoesttoxine (PT) intraperitoneaal in een dosering van 5 mg/kg na MOG-injectie. OPMERKING: PT verhoogt de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) en vergemakkelijkt de infiltratie van T-cellen in de hersenen.</li>
	<li>Injecteer de PT-oplossing na 48 uur intraperitoneaal in hetzelfde volume.</li>
</ol>7. Neurologische uitvalscore
<ol><li>Evalueer en beoordeel de muizen dagelijks met behulp van een beoordelingsschaal 16 variërend van 0 tot15 om de incidentie en ernst van EAE te beoordelen op basis van de volgende neurologische tekorten: Staart: 0 geeft geen tekenen aan, 1 staat voor een half verlamde staart en 2 geeft een volledig verlamde staart aan. Ledematen: 0 geeft geen tekenen aan, 1 staat voor een zwakke of veranderde gang, 2 staat voor parese en 3 staat voor een volledig verlamde ledemaat.</li>
	<li>Geef een dier met een dwarslaesie met volledige verlamming een score van 12 en een sterftecijfer van 15.</li>
</ol>8. Hematoxyline-eosine (H&E) kleuring
<ol><li>Neem het uitgedroogde muizenbrein en bedin het in gesmolten paraffine. Laat het paraffineblok afkoelen en stollen voor later gebruik. NOTITIE: Het paraffineblok moet volledig droog en koel zijn om weefselbeschadiging te voorkomen.</li>
	<li>Snijd het paraffineblok van de muizenhersenen in glaasjes van 5 μm dik. Plaats het paraffine-muizenhersengedeelte op een glasglaasje en droog het gedurende 3 uur in een oven van 60 °C.</li>
	<li>Dompel de objectglaasjes achtereenvolgens onder in xyleenoplossing I gedurende 10 min, xyleenoplossing II gedurende 10 min, 100% alcohol I gedurende 3 min, 100% alcohol II gedurende 3 min, 95% alcohol gedurende 3 min, 90% alcohol gedurende 3 min, 80% alcohol gedurende 3 min, 70% alcohol gedurende 3 min en gedestilleerd water gedurende 1 min.</li>
</ol>9. Kwantitatieve analyse van polymerasekettingreactie (qPCR)
<ol><li>Nadat u de muizen met PBS hebt doorfusied, verwijdert u de ChP uit de ventrikels en extraheert u RNA met Trizol. Synthese het cDNA met behulp van de eerste Strand cDNA Synthesis Kit.</li>
	<li>Voer qPCR-analyse uit met behulp van Ex Taq SYBR-green premix en een real-time PCR-systeem. Gebruik de volgende A2AR-primers: vooruit - GCCATCCCATTCGCCATCA; omgekeerd - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Selectieve gen-uitschakeling in de plexus choroideus

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
<li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447(2021).</li>
<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li>
<li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elevated+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1%2FTh2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111(2019).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+brain+stimulation+upregulates+adhesion+and+prevents+Eae%3A+MMP-2%2C+ICAM-1%2C+and+VCAM-1+in+the+choroid+plexus+as+a+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target.</a> International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).</li>
<li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193(2012).</li>
</ol>

De auteurs stellen dat ze geen concurrerende financiële belangen of andere openbaarmakingen hoeven aan te geven.

Het onderzoek presenteerde twee verschillende benaderingen voor de gerichte knockdown van ChP-genen. De eerste benadering betrof de ICV-injectie van CRE-TAT, dat Cre-recombinase bevat, in A2AR flox/flox-muizen. De tweede benadering omvatte ICV-injectie van AAV2/5 met shRNA van A2AR. Door gebruik te maken van deze twee strategieën bereikte het werk de selectieve knockdown van A 2A R binnen de ChP en was het in staat om de beschermende effecten aan te tonen van het remmen van A2A...

Van de plexus choroideus (ChP) werd vaak gedacht dat het hielp bij het handhaven van de functionele homeostase van de hersenen door cerebrospinale vloeistof (CSF) en brain-derived neurotrophic factor (BDNF) af te scheiden1,2. Toenemend onderzoek in de afgelopen drie decennia heeft aangetoond dat de ChP een duidelijke route vertegenwoordigt voor infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS).
De tight junctions (TJ's) van de ChP, bestaande uit een monolaag ChP-epitheel, handhaven de immunologische homeostase door te voorkomen dat macromoleculen en immuuncellen de hersenen binnendringen3. Onder bepaalde pathologische omstandigheden detecteert en reageert het ChP-weefsel echter op gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's) in de CSF en het bloed, wat leidt tot abnormale immuuninfiltratie en hersendisfunctie 4,5. Ondanks zijn cruciale rol maken de kleine omvang en unieke locatie van de ChP in de hersenen het moeilijk om zijn functie te bestuderen zonder andere hersengebieden te beïnvloeden. Daarom is het manipuleren van genexpressie specifiek in de ChP een ideale benadering om de functie ervan te begrijpen.
Aanvankelijk werden transgene lijnen van cyclisatierecombinatie-enzym (Cre), die Cre tot expressie brengen onder controle van promotoren die specifiek zijn voor genen die tot expressie worden gebracht in de ChP, vaak gebruikt om doelgenen te verwijderen door te fokken met gefloxte kandidaatgenen 6,7,8. De transcriptiefactor Forkhead box J1 (FoxJ1) wordt bijvoorbeeld uitsluitend tot expressie gebracht in het ChP-epitheel van de prenatale muizenhersenen7. Zo werd de FoxJ1-Cre-lijn vaak gebruikt om genen in de ChP 6,9 te verwijderen. Het succes van deze strategie hangt echter sterk af van de specificiteit van de promotor. Geleidelijk aan werd ontdekt dat het expressiepatroon van FoxJ1 niet onderscheidend genoeg was, aangezien FoxJ1 ook aanwezig was in trilhaarepitheelcellen in andere delen van de hersenen en hetperifere systeem. Om deze beperking te overwinnen, werd intra-cerebroventriculaire (ICV) injectie van Cre-recombinase uitgevoerd om recombinase af te leveren in de ventrikels van gefloxte transgene lijnen. Deze strategie vertoonde een hoge specificiteit, zoals blijkt uit de aanwezigheid van tdTomato-fluorescentie uitsluitend in het ChP-weefsel10,11. Deze methode wordt echter nog steeds beperkt door de beschikbaarheid van gefloxte transgene muislijnen. Om dit probleem aan te pakken, hebben onderzoekers ICV-injectie van adeno-geassocieerd virus (AAV) gebruikt om ChP-specifieke knockdown of de overexpressie van doelgenen te bereiken12,13. Een uitgebreide evaluatie van verschillende AAV-serotypen voor ChP-infectie onthulde dat AAV2/5 en AAV2/8 sterke infectiemogelijkheden vertonen in de ChP, terwijl ze geen andere hersengebieden infecteren. AAV2/8 bleek echter het ependyma rond ventrikels te infecteren, terwijl de AAV2/5-groep geen infectie vertoonde14. Deze methode heeft het voordeel dat de beperkingen van het verwerven van transgene dieren met floxs worden overwonnen.
Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol voor gen-knockdown in de ChP met behulp van twee methoden: ICV van AAV2/5 met shRNA van de adenosine A 2A-receptor (A 2A R) en Cre-recombinase-eiwit bestaande uit TAT-sequentie (CRE-TAT) recombinase om ChP-specifieke knockdown van A2A Rte bereiken. De bevindingen van de studie suggereren dat het uitschakelen van A2AR in de ChP experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) kan verlichten. Dit gedetailleerde protocol biedt nuttige richtlijnen voor ChP-functiestudies en de specifieke knockdown van genen in de ChP.

<table><tbody><tr><td>A2ARflox/flox muizen</td><td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA-virus</td><td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>antifade montagemedium</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>borosilicaatglas capillair</td><td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>hersen stereotaxische apparaat</td><td>RWD, Shenzhen</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT recombinase</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>bevroren snijmachine</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson and company</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton, American</td><td>P/N:&nbsp;86259</td><td></td></tr><tr><td>Incomplete Freunds adjuvant</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Laser confocal microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>OCT lijm</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital natrium</td><td>Boyun Biotech</td><td>PC13003</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpistool</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthese Kit</td><td>Takara</td><td>&nbsp;6110A</td><td></td></tr><tr><td>Real- Time PCR Systeem</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>superhoge snelheid homogenisator</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>xyleen oplossing</td><td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

gerichte uitschakeling van genen in de plexus choroideus

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

De plexus choroideus (ChP) dient als een kritieke toegangspoort voor infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Recent onderzoek heeft aangetoond dat het reguleren van de ChP-activiteit bescherming kan bieden tegen aandoeningen van het CZS. Het bestuderen van de biologische functie van de ChP zonder andere hersengebieden te beïnvloeden is echter een uitdaging vanwege de delicate structuur. Deze studie presenteert een nieuwe methode voor gen-knockdown in ChP-weefsel met behulp van adeno-geassocieerde virussen (AAV's) of cyclisatierecombinatie-enzym (Cre) recombinase-eiwit bestaande uit TAT-sequentie (CRE-TAT). De resultaten tonen aan dat na het injecteren van AAV of CRE-TAT in het laterale ventrikel, de fluorescentie uitsluitend geconcentreerd was in de ChP. Met behulp van deze aanpak schakelde de studie met succes de adenosine A 2A-receptor (A2A R) in de ChP uit met behulp van RNA-interferentie (RNAi) of Cre/locus van X-overP1 (Cre/LoxP) systemen, en toonde aan dat deze knockdown de pathologie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) zou kunnen verlichten. Deze techniek kan belangrijke implicaties hebben voor toekomstig onderzoek naar de rol van de ChP bij aandoeningen van het CZS.

ChP-specifieke A2AR knockdown door ICV-injectie van AAV2/5-shRNA of CRE-TAT De rol van A2AR in de ChP als een krachtige regulator van neurale informatie in de pathogenese van EAE blijft onduidelijk. Het uitschakelen van ChP-specifieke A 2A R-expressie zou licht kunnen werpen op de A2AR-regulerende effecten op het centrale immuunsysteem bij EAE en andere ontstekingen van het zenuwstelsel. Deze studie maakte gebruik van ICV-injectie van CRE-TAT om de expressie...

Hier beschrijven we een methode om selectief genexpressies in de plexus choroideus te veranderen en tegelijkertijd impact in andere hersengebieden te vermijden.

Gerichte uitschakeling van genen in de plexus choroideus

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Het doel van dit onderzoek is het onderzoeken van de technieken voor het manipuleren van genexpressie in de plexus choroide. Onze studie heeft de twee methoden geïntroduceerd die techniek uitsluitend in de plexus choroideus mogelijk maken zonder enige waarneembare impact op andere regio's. Onze bevindingen kunnen mogelijk toekomstige functiestudies van de plexus choroideus in de neurowetenschappen verbeteren.Ons onderzoek heeft aangetoond dat het remmen van T-celinfiltratie door de plexus choroideus door selectieve afsluiting van adenosine naar een receptor voldoende is om muizen te beschermen tegen EAE-pathologie. Deze bevinding ondersteunt het idee dat het detecteren van gateway-activiteit in de plexus choroideus een veelbelovende nieuwe strategie zou kunnen zijn voor de behandeling van multiple sclerose. Deze studie presenteert twee alternatieve methoden voor manipulatie van genexpressie in de plexus choroide.ICV-injectie van Cre-recombinase in die transgene muizen of ICV-injectie van AAV2/5, of het is gerichte SHI in de WT-muizen. Deze methoden overwinnen problemen met het bevorderen van specificiteit en het fokken van transgenetische muizen.

targeted-knockdown-of-genes-in-the-choroid-plexus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

In this video, we demonstrate a method to perform transduction of shRNA lentiviral vectors to obtain stable knockdown cell lines in immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs).

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro: A Lentivirus-Based shRNA Expression System Delivery into iHSPCs for Knockdown of Specific Gene Expression

We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale...

Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Dit protocol biedt een workflow op hoe te combineren met kunstmatige microRNA-gemedieerde RNA-interferentie met optogenetics te stimuleren specifiek presynaptische los met verminderde expressie van selectieve gene(s) binnen intact neuronale circuits.

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

In de huidige studie wordt de expressie neergehaald van twee stroomafwaartse signaalcomponenten van de PERK-route, de cytoprotectieve calcineurine en de pro-apoptotische CHOP, door specifieke shRNA's te gebruiken. Op tegenovergestelde manieren moduleren deze de gevoeligheid van primaire corticale neuronen voor neurietatrofie na inductie van endoplasmatische reticulumstress.

Moleculaire modulatie door lentivirus-geleverde specifieke shRNA's in endoplasmatisch reticulum gestreste neuronen

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

De elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten biedt een nauwkeurige en efficiënte benadering om voorbijgaande genetische modificatie (s) te introduceren in verschillende voorlopertypen en neuronen in een modelsysteem dat dicht bij de ontwikkeling van primaat (patho) fysiologische neocortex ligt. Dit maakt de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen mogelijk en kan ook worden toegepast voor ziektemodellering.

Gerichte micro-injectie en elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten voor genetische modificatie

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

Ontdek gerichte gentechnieken voor de plexus choroideus met ICV-injecties en AAV2/5-vectoren in muismodellen. Deze methode vermindert immuuncelinfiltratie en biedt nieuwe inzichten voor multiple sclerose-onderzoek.

Gerichte uitschakeling van genen in de plexus choroideus

Meer video's verkennen