Snelle in-vitrocytotoxiciteitsevaluatie van Jurkat die chimere antigeenreceptor tot expressie brengt met behulp van fluorescerende beeldvorming
27 oktober 2023
Een protocol om kwantitatieve tumorceldoding te evalueren door Jurkat-cellen die chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie brengen die gericht zijn op een enkel tumorantigeen. Dit protocol kan worden gebruikt als een screeningsplatform voor snelle optimalisatie van CAR-scharnierconstructies voorafgaand aan bevestiging in perifere bloed-afgeleide T-cellen.
CAR T-cellen worden voortdurend verbeterd om betere responsen te bereiken in klinische onderzoeken bij mensen. We zoeken naar manieren om dit in ons laboratorium te evalueren met behulp van een onbevooroordeelde high-throughput-methode, zoals het gebruik van fluorescerende beeldvorming om combinaties te screenen die het beste werken. Er zijn verschillende combinaties van constructies die kunnen worden ontworpen voor elk variabel fragment van een enkele keten door de geometrie van de extracellulaire en scharnierdomeinen te wijzigen.
We hebben dit protocol ontworpen om de combinaties te identificeren met de beste werkzaamheid bij het elimineren van doelcellen met behulp van Jurkat-cellen. Dit is een snel, high-throughput protocol om CAR-constructen te screenen op basis van de cytotoxiciteit van de doelcel met behulp van Jurkat-cellen, die vervolgens worden gevalideerd met conventionele T-cellen. Met deze techniek kunnen een tiental verschillende CAR-constructies tegelijkertijd worden getest in een plaat met 96 putjes.
Hier in het Akhavan Lab kwantificeren we in absolute getallen de directe cyclose van doelcellen door de CAR die Jurkat-cellen tot expressie brengt op een manier met hoge doorvoer om meerdere CAR-constructen te screenen. Het primaire doel van ons laboratorium is het verbeteren van de klinische vertaling van CAR T-celtherapie tegen hooggradige hersentumoren. We maken gebruik van medicijnschermen met een hoge doorvoer als een modaliteit om de cytotoxiciteit van CAR T-cellen te verbeteren en om ons te richten op de micro-omgeving van de tumor.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een hoogdoorvoermethode voor het evalueren van de cytotoxiciteit van CAR-expresserende Jurkat-cellen tegen tumorcellen. Het maakt snelle screening van verschillende CAR-constructen mogelijk om de meest effectieve combinaties voor het targeten van specifieke tumorantigenen te identificeren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Kankerbiologie
- Cellulaire therapie
Achtergrond
- CAR T-cellen worden verfijnd voor verbeterde klinische resultaten.
- Hoogdoorvoerscreeningsmethoden zijn essentieel voor het optimaliseren van CAR-constructen.
- Jurkat-cellen dienen als model voor het evalueren van CAR-effectiviteit.
- Dit onderzoek richt zich op de cytotoxiciteit van CAR-constructen tegen doelcellen.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het efficiënt screenen van CAR-constructen.
- Om de cytotoxische effecten van CAR-expresserende Jurkat-cellen te kwantificeren.
- Om optimale CAR-configuraties te identificeren voor het targeten van tumorantigenen.
Gebruikte methoden
- Fluorescente beeldvorming voor hoogdoorvoerscreening.
- Evaluatie van meerdere CAR-constructen in een 96-well plate-formaat.
- Kwantificering van het doelceldood door CAR-expresserende Jurkat-cellen.
- Vergelijking met conventionele T-celreacties voor validatie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van effectieve CAR-constructen voor tumorceldood.
- Demonstratie van hoogdoorvoermogelijkheden met behulp van Jurkat-cellen.
- Kwantitatieve beoordeling van cytotoxiciteit over verschillende constructen.
- Mogelijkheid voor snelle optimalisatie van CAR-ontwerpen vóór klinische toepassing.
Conclusies
- Het protocol maakt efficiënt screenen van CAR-constructen mogelijk.
- Jurkat-cellen bieden een betrouwbaar model voor het beoordelen van CAR-effectiviteit.
- Deze aanpak kan de ontwikkeling van CAR T-celtherapieën versnellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput cytotoxicity evaluation of CAR constructs in Jurkat cells enables early-stage de-risking and prioritization of CAR designs before resource-intensive primary T cell validation. This platform accelerates the identification of hinge-optimized CARs with superior target cell killing, supporting efficient portfolio triage in oncology cell therapy pipelines. By quantifying cytotoxicity across multiple constructs simultaneously, teams can make data-driven decisions at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of CAR construct permutations for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying direct cytotoxicity in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in construct selection prior to primary T cell engineering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CAR-Jurkat systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes cytotoxicity assays with quantitative fluorescent imaging outputs.
- Enables reproducible, scalable evaluation of multiple CAR constructs in parallel.
- Supports reliable compound or construct evaluation in 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cytotoxicity data with translational goals by confirming findings in PBMC-derived T cells.
- Provides continuity from discovery-stage construct optimization to preclinical validation steps.
- Reduces risk of late-stage attrition by filtering out suboptimal CAR designs early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput cytotoxicity platform fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging construct design with preclinical validation. It enables rapid hypothesis testing and construct triage before advancing to resource-intensive primary T cell or in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of hinge and extracellular domain modifications for CAR efficacy.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cytotoxicity data for construct comparison and ranking.
- Analytics: Provides absolute cell counts and statistical outputs (e.g., one-way ANOVA) to inform decision-making.
- Translational Research: Confirms construct performance in PBMC-derived T cells, supporting translational continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for ongoing CAR construct optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR construct selection.
- Operational Value: Standardizes and scales cytotoxicity evaluation, enabling efficient resource allocation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by filtering constructs early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CAR construct design and lentiviral transduction of Jurkat cells.
- Needs access to fluorescent imaging instrumentation and analytical software for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis parameters.
- Adaptation to other cell models or antigens may require protocol optimization.
- Dependent on robust statistical analysis (e.g., ANOVA) for construct comparison.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
