Snelle in-vitrocytotoxiciteitsevaluatie van Jurkat die chimere antigeenreceptor tot expressie brengt met behulp van fluorescerende beeldvorming
27 oktober 2023
Een protocol om kwantitatieve tumorceldoding te evalueren door Jurkat-cellen die chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie brengen die gericht zijn op een enkel tumorantigeen. Dit protocol kan worden gebruikt als een screeningsplatform voor snelle optimalisatie van CAR-scharnierconstructies voorafgaand aan bevestiging in perifere bloed-afgeleide T-cellen.
CAR T-cellen worden voortdurend verbeterd om betere responsen te bereiken in klinische onderzoeken bij mensen. We zoeken naar manieren om dit in ons laboratorium te evalueren met behulp van een onbevooroordeelde high-throughput-methode, zoals het gebruik van fluorescerende beeldvorming om combinaties te screenen die het beste werken. Er zijn verschillende combinaties van constructies die kunnen worden ontworpen voor elk variabel fragment van een enkele keten door de geometrie van de extracellulaire en scharnierdomeinen te wijzigen.
We hebben dit protocol ontworpen om de combinaties te identificeren met de beste werkzaamheid bij het elimineren van doelcellen met behulp van Jurkat-cellen. Dit is een snel, high-throughput protocol om CAR-constructen te screenen op basis van de cytotoxiciteit van de doelcel met behulp van Jurkat-cellen, die vervolgens worden gevalideerd met conventionele T-cellen. Met deze techniek kunnen een tiental verschillende CAR-constructies tegelijkertijd worden getest in een plaat met 96 putjes.
Hier in het Akhavan Lab kwantificeren we in absolute getallen de directe cyclose van doelcellen door de CAR die Jurkat-cellen tot expressie brengt op een manier met hoge doorvoer om meerdere CAR-constructen te screenen. Het primaire doel van ons laboratorium is het verbeteren van de klinische vertaling van CAR T-celtherapie tegen hooggradige hersentumoren. We maken gebruik van medicijnschermen met een hoge doorvoer als een modaliteit om de cytotoxiciteit van CAR T-cellen te verbeteren en om ons te richten op de micro-omgeving van de tumor.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een high-throughput methode voor het evalueren van de cytotoxiciteit van CAR-expresserende Jurkat-cellen tegen tumorcellen. Hiermee is het mogelijk om snel verschillende CAR-constructen te screenen om de meest effectieve combinaties voor het targeten van specifieke tumorantigenen te identificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Kankerbiologie
- Cellulaire Therapie
Achtergrond
- CAR T-cellen worden verder verfijnd voor verbeterde klinische resultaten.
- High-throughput screeningmethoden zijn essentieel voor het optimaliseren van CAR-constructen.
- Jurkatcellen dienen als model voor het evalueren van de CAR-efficiëntie.
- Deze studie richt zich op de cytotoxiciteit van CAR-constructen tegen doelcellen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het efficiënt screenen van CAR-constructen.
- Het kwantificeren van de cytotoxische effecten van CAR-expresserende Jurkat-cellen.
- Het identificeren van optimale CAR-configuraties voor het targeten van tumorantigenen.
Gebruikte methoden
- Fluorescente beeldvorming voor high-throughput screening.
- Evaluatie van meerdere CAR-constructen in een 96-well plaatformaat.
- Kwantificering van de doding van doelcellen door CAR-expresserende Jurkat-cellen.
- Vergelijking met conventionele T-celresponsen voor validatie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van effectieve CAR-constructen voor het doden van tumorcellen.
- Demonstratie van high-throughput capaciteiten met gebruik van Jurkat-cellen.
- Kwantitatieve beoordeling van de cytotoxiciteit over verschillende constructen.
- Potentieel voor snelle optimalisatie van CAR-ontwerpen vóór klinische toepassing.
Conclusies
- Het protocol maakt een efficiënte screening van CAR-constructen mogelijk.
- Jurkat-cellen vormen een betrouwbaar model voor het beoordelen van de CAR-effectiviteit.
- Deze aanpak kan de ontwikkeling van CAR-T-celtherapieën versnellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Snelle, high-throughput evaluatie van de cytotoxiciteit van CAR-constructen in Jurkat-cellen maakt risicoreductie in een vroeg stadium en prioritering van CAR-ontwerpen mogelijk, nog voordat er arbeidsintensieve validatie in primaire T-cellen plaatsvindt. Dit platform versnelt de identificatie van hinge-geoptimaliseerde CAR's met een superieur vermogen om doelcellen te doden, wat een efficiënte triage van de portfolio in oncologische celtherapie-pipelines ondersteunt. Door de cytotoxiciteit van meerdere constructen gelijktijdig te kwantificeren, kunnen teams datagestuurde beslissingen nemen op kritieke beslismomenten tijdens de ontdekkingsfase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Maakt snelle analyse van CAR-constructpermutaties mogelijk voor functionele doelwitvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door directe cytotoxiciteit te kwantificeren in een gecontroleerd systeem.
- Vergemakkelijkt voorspellende zekerheid bij de selectie van constructen voorafgaand aan de primaire T-celengineering.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde CAR-Jurkat-systemen voor op downstream high-throughput screening-workflows.
- Standaardiseert cytotoxiciteitstesten met kwantitatieve fluorescentie-imagingoutputs.
- Maakt reproduceerbare, schaalbare evaluatie van meerdere CAR-constructen in parallel mogelijk.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van verbindingen of constructen in 96-wellplaatformaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt vroege cytotoxiciteitsgegevens uit met translationele doelen door bevindingen in PBMC-afgeleide T-cellen te bevestigen.
- Zorgt voor continuïteit van de optimalisatie van constructen in de ontdekkingsfase naar de stappen van preklinische validatie.
- Vermindert het risico op uitval in een laat stadium door suboptimale CAR-ontwerpen vroegtijdig te filteren.
Integratie van pipeline en workflow
Dit high-throughput cytotoxiciteitsplatform bevindt zich op het grensvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waarbij het de brug slaat tussen constructontwerp en preklinische validatie. Het maakt snelle hypothesetoetsing en triage van constructen mogelijk voordat er wordt overgegaan naar arbeidsintensieve primaire T-celstudies of in vivo-onderzoeken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde evaluatie van modificaties aan het scharniervlak en het extracellulaire domein voor de effectiviteit van CAR.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare cytotoxiciteitsgegevens voor het vergelijken en rangschikken van constructen.
- Analytics: Biedt absolute celcounts en statistische outputs (bijv. één-weg ANOVA) ter ondersteuning van de besluitvorming.
- Translationeel onderzoek: Bevestigt de prestaties van constructen in uit PBMC afgeleide T-cellen, wat de translationele continuïteit ondersteunt.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een schaalbaar, herbruikbaar platform voor doorlopende optimalisatiecampagnes van CAR-constructen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de selectie van CAR-constructen.
- Operationele waarde: Standaardiseert en schaalt de evaluatie van cytotoxiciteit, wat een efficiënte toewijzing van middelen mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door constructen in een vroeg stadium te filteren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van CAR-kandidaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van CAR-constructen en lentivirale transductie van Jurkat-cellen.
- Toegang tot fluorescentie-beeldvormingsinstrumentatie en analytische software voor kwantitatieve read-outs is noodzakelijk.
- Standaardisatie van de assay-opstelling en data-analyseparameters tussen teams is vereist.
- Aanpassing aan andere celmodellen of antigenen kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Afhankelijk van robuuste statistische analyse (bijv. ANOVA) voor de vergelijking van constructen.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
