Name: Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Leer hoe vetafgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSCs) in co-cultuur met primaire gemengde glia de door prionen geïnduceerde ontsteking verminderen. Deze methode biedt inzicht in neuroprotectieve celtherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Lab Animal Resources voor hun veeteelt. Onze financieringsbronnen voor dit manuscript zijn onder meer het Boettcher Fund, het Murphy Turner Fund, CSU College of Veterinary Medicine en de Biomedical Sciences College Research Council. Figuur 2A, Figuur 2C en Figuur 3A zijn gemaakt met BioRender.com.

Muizen werden gefokt en onderhouden in Colorado State's Lab Animal Resources, geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, in overeenstemming met protocol #1138, goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Colorado State University.
1. Isoleren en infecteren van primaire corticale gemengde glia met prionen
<ol><li>Om primaire gemengde glia te isoleren die zowel astrocyten als microglia bevatten, verkrijgt u C57Bl/6 muizenpups van nul tot twee dagen oud. OPMERKING: Dit protocol is een aanpassing van eerdere protocollen 15,16.</li>
	<li>Euthanaseer pups één voor één door onthoofding en extraheer hun hersenen, scheid en gooi het cerebellum en de hersenstam weg.<ol><li>Plaats de hersenen in een petrischaaltje van 3 cm met daarin koude MEM/EBSS met 2x Penicilline/streptomycine/neomycine (PSN). Scheid onder een ontleedscoop de hersenhelften en verwijder en gooi de middenhersenen weg. Verwijder de hippocampus en hersenvliezen uit de cortex en gooi ze weg.</li>
		<li>Plaats beide corticale hemisferen in een conische buis van 50 ml met 5 ml MEM/EBSS + 2x PSN en plaats ze op ijs.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder in een weefselkweekkap het medium uit het conische buisje van 50 ml door voorzichtig op te zuigen met een pipet, waarbij u de stukjes corticaal weefsel op de bodem van het buisje achterlaat. Voeg met een gecoate glaspipet 10 ml voorverwarmde dissociatiemedia toe en trituruer het weefsel met de glaspipet 10-20x.</li>
	<li>Doe de suspensie in een bekerglas van 50 ml met een kleine roerstaaf en leg deze gedurende 10 minuten op een roerplaat op de laagste stand, ongeveer 30 omw/min. Haal het bekerglas van de roerplaat en zet het 3 minuten in een hoek van 30° om het zakdoekje op de bodem te laten bezinken. Verwijder de celsuspensie (supernatant) en breng deze over in een nieuwe conische buis van 50 ml op ijs.</li>
	<li>Voeg DNase-I (4.000 E/ml) toe aan 10 ml dissociatiemedia en resuspendeer het weefsel en roer nog 10 minuten. Herhaal dit door 2-4 keer extra verse dissociatiemedia (zonder DNase-I) toe te voegen (één keer voor elke twee gebruikte muizenjongen) en de celsuspensie over te brengen naar de kegelvormige buis van 50 ml op ijs, totdat er alleen vezelig weefsel op de bodem van het bekerglas achterblijft.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie in de conische buis gedurende 10 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C. Aspireer het supernatans op en vervang het door gliagroeimedium. Tel de cellen met een hemocytometer en plaat de cellen met een dichtheid van 106 in 10 cm met celcultuur behandelde schaaltjes. Plaats in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder na 24 uur de media en vervang deze door nieuwe gliamedia. Laat de cellen binnen 2 weken 100% samenvloeiing bereiken; Splits ze vervolgens en leg ze op een plaat voor experimenten.</li>
	<li>Voor in vitro prioninfectie, plaatglia op 100.000 cellen per putje in platen met 6 putjes en laat 80%-100% samenvloeiing bereiken. Stel hersenhomogenaten, zowel prionen als normale, verdund tot 20% in PBS bloot aan UV-licht gedurende 30 minuten voordat ze aan de celcultuur worden toegevoegd. Aspireer media van glia om te worden geïnfecteerd en voeg aan elk putje 1,5-2 ml gliale groeimedia toe met een eindvolume van 0,1% normaal of prionhersenhomogenaat.</li>
	<li>Zuig na 72 uur de media af en was de cellen met PBS om eventueel achtergebleven hersenhomogenaat te verwijderen. Vervang door verse gliale groeimedia (die geen hersenhomogenaten bevatten).</li>
	<li>Om AdMSC-cellen te isoleren, gebruikt u een serologisch pipet en zuigt u het vetweefsel voorzichtig op samen met ~1 ml HBSS/Trypsine-oplossing. Breng over naar een petrischaal van 4 cm met 2 ml DMEM/F12-media met een mengsel van 200 E/ml DNase-I en 400 E/ml collagenase/dispase. Knip met een kleine schaar de stukjes vetweefsel in kleine stukjes (minder dan 5 mm groot) en incubeer ze gedurende 1,5 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Breng de inhoud van het petrischaaltje over in een conische buis van 50 ml met een serologische pipet en tritureer het mengsel ~10x met de pipet. Zorg ervoor dat het weefsel gemakkelijk uit elkaar valt en een relatief homogeen mengsel vormt. Centrifugeer het mengsel bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 1.000 × g om de stromale vasculaire fractie te pelleteren, die er rood uitziet.</li>
	<li>Zuig het supernatans voorzichtig op en was de pellet met 5 ml voorverwarmd steriel PBS en centrifugeer bij 4 °C bij 1.000 × g gedurende 3 min. Aspireer het supernatans op en resuspendeer de pellet in 1 ml AdMSC-media (lage glucose DMEM bevattend L-glutamine en aangevuld met 15% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (hiFBS), 1% aminozuren, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% PSN).</li>
	<li>Plaats een celzeef van 40 μm op een verse steriele conische buis van 50 ml en pipetteer de celsuspensie door de zeef om niet-gedissocieerd weefsel te verwijderen. Voeg 9 ml AdMSC-media toe aan een met celcultuur behandelde schaal van 10 cm en pipetteer de gezeefde celsuspensie in de schaal. Plaats in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder en vervang de volgende dag door nieuwe AdMSC-media. Wacht tot de cellen voor 80-90% samenvloeien wanneer ze klaar zijn om te worden gepasseerd tussen 72 uur en 96 uur.</li>
	<li>Isoleer AdMSC's zoals hierboven beschreven en passeer twee keer om een consistente homogene populatie te verkrijgen 14. Was de cellen twee keer met steriel PBS en spuit 2 ml voorverwarmd trypsine (0,25%) op elke plaat. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat ze volledig loskomen van de plaat. Voeg 8 ml voorverwarmd AdMSC-medium toe aan elke plaat, pipetteer om de celsuspensie te mengen, breng over naar de conische buis en centrifugeer bij 1.000 × g bij 4 °C tot pellet.</li>
	<li>Resuspendeer AdMSC's in 3-10 ml media (afhankelijk van het aantal gebruikte platen) en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaat 100.000 cellen/putje in platen met 6 putjes die AdMSC-media bevatten. Plaats in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 's nachts.</li>
	<li>Stimuleer de volgende dag cellen met cytokines of hersenhomogenaat.<ol><li>Maak voor cytokine-gestimuleerde cellen AdMSC-media die ofwel 10 ng/ml TNFα of 200 ng/ml IFNγ bevatten. Gebruik verse media voor controleputten.</li>
		<li>Voor behandelingen met priongeïnfecteerde hersenenhomogenaat verkrijgt u 20% hersenhomogenaat (in PBS) van terminaal geïnfecteerde prionmuizen (22L- of RML-stammen). Maak AdMSC-media met een eindconcentratie van 0,1% prion-geïnfecteerd of normaal hersenhomogenaat voor controles.</li>
		<li>Aspireer media uit de putjes en pipetteer 1,5 ml cytokine- of hersenhomogenaatbevattende media naar overeenkomstige putjes. Voer uit in drievoud. Plaats de platen terug in de couveuse.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder de media, was de cellen 2x met voorverwarmd PBS, isoleer RNA door 350 ml lysisbuffer met 1% βME aan elk putje toe te voegen en gebruik een cellifter om cellysaten te verwijderen. Voer RNA-isolatie uit volgens het protocol van de fabrikant van de minikit, inclusief een DNase-verteringsstap. Voor RT-qPCR wordt 25 ng RNA per monster omgekeerd getranscribeerd en cDNA geamplificeerd met SYBR Green en primers voor elk gen bij 10 mM. Analyseer mRNA-expressie met behulp van de 2-ΔΔCT-methode en normaliseer naar de expressie van referentiegen β-actine 17. OPMERKING: Alle RT-PCR werd uitgevoerd volgens de MIQE-richtlijnen.</li>
	<li>Plaat BV2 microglia met 50.000 cellen per putje, of primaire gemengde glia met 100.000 cellen per putje in een plaat met 6 putjes. Behandel BV2-cellen de volgende dag met media die 0,1% prion-geïnfecteerd of normaal hersenhomogenaat bevatten. Wacht voor gemengde glia tot de cellen voor 80-90% samenvloeien om te infecteren met hersenhomogenaat.</li>
	<li>Incubeer cellen in media die hersenhomogenaat bevatten gedurende 72 uur. Was de cellen 2x met PBS om de resterende hersenenhomogene te verwijderen en voeg verse media toe en keer terug naar de incubator.</li>
	<li>Gebruik AdMSC's bij passage 3 voor co-cultuur. Als AdMSC's worden gestimuleerd, gebruik dan media die 10 ng/ml TNFα bevatten en behandel gedurende 24 uur voorafgaand aan co-culturatie met BV2 of gemengde glia. Was gestimuleerde AdMSC's 3x met PBS om eventuele resterende TNFα te verwijderen.</li>
	<li>Trypsiniseer AdMSC's zoals beschreven in stap 1.15 en resuspendeer in AdMSC-media.</li>
	<li>Spin AdMSC-suspensie bij 1.000 × g bij 4 °C gedurende 5 min. Vervang gedurende deze tijd media op BV2-cellen of gemengde glia door 2 ml AdMSC-media per putje en plaats inserts voor 6-wells platen met een poriegrootte van 0,4 micrometer in de helft van de putjes. Voeg 2 ml AdMSC-media toe aan elke insert en nog eens 2 ml media aan wells die geen inserts ontvangen.</li>
	<li>Wanneer u klaar bent met het pelleteren van AdMSC's, resuspendeert u de pellet in AdMSC-media. Tel AdMSC's met een hemocytometer en voeg 50.000-100.000 cellen toe aan elk inzetstuk.</li>
	<li>Voor BV2-cellen, co-culturen gedurende 24 uur uitbroeden. Voor gemengde glia, incubeer gedurende slechts 24 uur en maar liefst 7 dagen.</li>
	<li>Na incubatie met AdMSC's gedurende de gewenste tijd, verwijdert u de inzetstukken en gooit u ze weg, of plaatst u ze in een nieuwe plaat met 6 putjes, wast u de inzetstukken 2x met PBS, voegt u de buffer toe die wordt geleverd door de RNA-isolatiekit aan de gemengde glia- of BV2-cellen en schraapt u de inzetstukken om AdMSC-RNA te analyseren.</li>
	<li>Behandel AdMSC's bij passage 2 met media die 10 ng/ml TNFα bevatten. De volgende dag de cellen 3x wassen met voorverwarmd steriel PBS en 4 uur incuberen in serumvrije AdMSC-media.</li>
	<li>Om een migratieceltest uit te voeren, voegt u 25.000 AdMSC's per insert toe en incubeert u cellen gedurende 24 uur bij 37 °C. Gedurende deze tijd zullen migrerende cellen uit de bovenste kamer van de wisselplaat bewegen en zich hechten aan de onderkant van de wisselplaat. Zuig de inhoud van zowel het putje als de inzetstukken voorzichtig op en was 2x met PBS, laat 1 ml PBS in elk putje om ervoor te zorgen dat de inzetstukken aan elke kant vochtig blijven.</li>
	<li>Verwijder één voor één, met een tang, de inzetstukken en veeg de bovenste kamer voorzichtig maar grondig af met een wattenstaafje om eventuele cellen te verwijderen die niet zijn gemigreerd. Zuig de resterende PBS en pipet 500 μL kristalviolette oplossing naar zowel de put- als de bovenste kamer van de inzetstuk en zorg ervoor dat het inzetmembraan volledig is ondergedompeld.</li>
	<li>Incubeer de inzetstukken gedurende 1 uur in kristalviolette oplossing bij kamertemperatuur. Om de kleur zo goed mogelijk te behouden, voert u de volgende stappen snel uit, met slechts één inzetstuk tegelijk.<ol><li>Zuig kristalviolette oplossing op uit de put en de bovenste kamer van het inzetstuk en was 3x met PBS. Veeg de bovenste kamer opnieuw af met een wattenstaafje.</li>
		<li>Plaats het inzetstuk in een kuiltje in een nieuwe plaat met 24 putjes met 1 ml PBS. Plaats de plaat boven een omgekeerde microscoop met een camera eraan. Maak met behulp van het 10x-objectief foto's van vier willekeurige gebieden in de richting van het midden van de wisselplaat, waarbij u alleen scherpstelt op de onderkant van de wisselplaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Nadat u dit met elke put hebt uitgevoerd, uploadt u afbeeldingen naar de beeldverwerkingssoftware van uw keuze en past u de achtergrond aan om het contrast met de paars gekleurde cellen te verbeteren. Tel de cellen handmatig met een cellenteller.</li>
</ol>

Coculturing van AdMSC's en Glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen

<ol><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).</li>
<li>Smith, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+unfolded+protein+response+induces+a+specific+reactivity+state+that+causes+non-cell-autonomous+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration.</a> Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Collinge, J., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+prion+strains+and+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A general model of prion strains and their pathogenicity.</a> Science. 318 (5852), 930-936 (2007).</li>
<li>Gajdusek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmissible+and+non-transmissible+amyloidoses%3A+autocatalytic+post-translational+conversion+of+host+precursor+proteins+to+beta-pleated+sheet+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations.</a> J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).</li>
<li>Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+amyloid+formation+in+the+prion+diseases%3A+importance+of+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).</li>
<li>Hartmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+3%28%2B%29-astrocytes+are+highly+abundant+in+prion+diseases%2C+but+their+abolishment+led+to+an+accelerated+disease+course+and+early+dysregulation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83(2019).</li>
<li>Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+critical+in+host+defense+against+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Microglia are critical in host defense against prion disease.</a> Journal of Virology. 92 (15), e00549(2018).</li>
<li>Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+deficiency+accelerates+prion+disease+but+does+not+enhance+prion+accumulation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain.</a> Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).</li>
<li>Li, M., Chen, H., Zhu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine+in+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114(2022).</li>
<li>Sanchez-Castillo, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+roles%3A+beneficial+effects+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells+on+microglia+and+their+implication+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases.</a> Biomolecules. 12 (2), 219(2022).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), 784(2019).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+increases+bone+marrow+mesenchymal+stem+cell+migration+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).</li>
<li>Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+decrease+prion-induced+glial+inflammation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro.</a> Scientific Reports. 12 (1), 22567(2022).</li>
<li>Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+amplify+inflammatory+activation+of+astrocytes+in+manganese+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99(2017).</li>
<li>Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-neuronal+signaling+mechanisms+underlying+the+neuroinflammatory+effects+of+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hass, R., Otte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+all-round+supporters+in+a+normal+and+neoplastic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26(2012).</li>
<li>Carroll, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+strain+differences+in+accumulation+of+PrPSc+on+neurons+and+glia+are+associated+with+similar+expression+profiles+of+neuroinflammatory+genes%3A+comparison+of+three+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551(2016).</li>
<li>Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+confers+partial+neuroprotection+during+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease.</a> PLoS One. 13 (12), e0208559(2018).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+low-dose+inflammatory+stimulus+synergistically+enhance+bone+marrow+mesenchymal+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration.</a> Cell Proliferation. 50 (1), e12309(2017).</li>
<li>Hay, A. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasally+delivered+mesenchymal+stromal+cells+decrease+glial+inflammation+early+in+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408(2023).</li>
<li>English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+and+TNF-alpha+differentially+regulate+immunomodulation+by+murine+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells.</a> Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).</li>
<li>Hemeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+differentially+affect+cytokine+expression+and+migration+properties+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Carta, M., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+foundations+of+prion+strain+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular foundations of prion strain diversity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+microglia+and+macrophages+in+brain+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair.</a> CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+activities+of+reactive+microglia+and+astrocytes+associated+with+prion+diseases+are+dysregulated+in+opposite+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions.</a> Cells. 10 (7), 1728(2021).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).</li>
<li>Shan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effect+of+autologous+compact+bone-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).</li>
<li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cells+trafficking+fluorescent+prion+rods+hours+after+intraperitoneal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-secreted+TGF-beta+regulates+lipopolysaccharide-stimulated+macrophage+M2-like+polarization+via+the+Akt%2FFoxO1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Hier demonstreren we een betrouwbaar en relatief goedkoop protocol voor het beoordelen van de effecten van van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSC's) bij het verminderen van prion-geïnduceerde ontsteking in een gliacelmodel. AdMSC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd en in cultuur worden uitgebreid voor gebruik in slechts 1 week. Dit protocol produceert consequent een heterologe populatie van cellen die markers tot expressie brengen die consistent zijn met die van mesenchymale stromale cellen door immunof...

Glia-ontsteking speelt een sleutelrol bij een verscheidenheid aan neurodegeneratieve ziekten, waaronder Parkinson, Alzheimer en prionziekte. Hoewel abnormale eiwitaggregatie wordt toegeschreven aan een groot deel van de pathogenese en neurodegeneratie van de ziekte, spelen gliacellen ook een rol bij het verergeren van deze 1,2,3. Daarom is het aanpakken van door glia geïnduceerde ontsteking een veelbelovende therapeutische benadering. Bij prionziekte vouwt het cellulaire prioneiwit (PrPC) zich mis met het ziekte-geassocieerde prioneiwit (PrPSc), dat oligomeren en aggregaten vormt en de homeostase in de hersenen verstoort 4,5,6.
Een van de eerste tekenen van prionziekte is een ontstekingsreactie van astrocyten en microglia. Studies die deze respons onderdrukken, hetzij door verwijdering van microglia of modificatie van astrocyten, hebben over het algemeen geen verbetering of verslechtering van de pathogenese van de ziekte aangetoond in diermodellen 7,8,9. Het moduleren van glia-ontsteking zonder deze te elimineren is een intrigerend alternatief als therapeutisch middel.
Mesenchymale stromale cellen (MSC's) hebben het podium ingenomen als behandeling voor een verscheidenheid aan ontstekingsziekten, vanwege hun vermogen om ontstekingen op een paracriene manier te moduleren 10,11. Ze hebben het vermogen aangetoond om te migreren naar ontstekingsplaatsen en te reageren op signaalmoleculen in deze omgevingen door ontstekingsremmende moleculen, groeifactoren, microRNA's en meer af te scheiden 10,12,13. We hebben eerder aangetoond dat MSC's afgeleid van vetweefsel (aangeduid als AdMSC's) in staat zijn om te migreren naar prion-geïnfecteerde hersenhomogenaat en op dit hersenhomogenaat te reageren door genexpressie voor ontstekingsremmende cytokines en groeifactoren te verhogen.
Bovendien kunnen AdMSC's de expressie verminderen van genen die geassocieerd zijn met Nuclear Factor-kappa B (NF-κB), het Nod-Like Receptor-familie pyrinedomein dat 3 (NLRP3) inflammasoomsignalering bevat, en glia-activering, in zowel BV2-microglia als primair gemengd glia 14. Hier bieden we protocollen voor het isoleren van zowel AdMSC's als primaire gemengde glia van muizen, het stimuleren van AdMSC's om modulerende genen te reguleren, het beoordelen van AdMSC-migratie en het co-kweken van AdMSC's met prion-geïnfecteerde glia. We hopen dat deze procedures een basis kunnen vormen voor verder onderzoek naar de rol van MSC's bij het reguleren van glia-geïnduceerde ontsteking bij neurodegeneratieve en andere ziekten.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229005B</td><td></td></tr><tr><td>6-wells weefselkweekplaten</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>10 cm celkweekschalen</td><td>Peak Serum</td><td>PS-4002</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229210</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buizen</td><td>Celltreat</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buizen</td><td>Celltreat</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>BV2 microglia cellijn</td><td>AcceGen Biotech</td><td>ABC-TC212S</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Biologix Research Company</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Kristalviolet</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>&nbsp;12785</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermo Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Caisson Labs</td><td>DFL14-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Essentiële aminozuren</td><td>Thermo Scientific</td><td>11130051</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100%)</td><td>EMD Millipore</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (hitte-inactief)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB4</td><td>Kan worden gekocht als hitte-inactief of in het laboratorium geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>EMD Millipore</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Glas 10 mL serologische pipet</td><td>Corning</td><td>&nbsp;7077-10N</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balances zout oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer/Neubauer kamer</td><td>Daigger</td><td>HU-3100</td><td></td></tr><tr><td>Hoge glucose DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Laag glucose DMEM met L-glutamine</td><td>Cytiva</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>MEM/EBSS</td><td>Cytiva</td><td>SH30024.FS</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145-100M</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine/neomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Cytiva</td><td>&nbsp;SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis IFN-gamma eiwit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis TNF-alpha (aa 80-235) eiwit, CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Bekleed de binnenkant van glazen pipetten door twee keer op en neer te aspireren in Sigmacote en laat goed drogen. Wikkel in aluminiumfolie en autoclaveer pipetten 24 uur later.</td></tr><tr><td>Stemxyme</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004106</td><td>Collagenase/Dispase mengsel</td></tr><tr><td>Steriele, individueel verpakte wattenstaafjes</td><td>Puritan Medical</td><td>&nbsp;25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>Thincert weefselkweek inserts, 24 well, poriegrootte=8 &micro;m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662638</td><td></td></tr><tr><td>Thincert weefselkweek inserts, 6 well, poriegrootte=0.4 &micro;m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657641</td><td></td></tr></tbody></table>

van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn krachtige regulatoren van ontstekingen door de productie van ontstekingsremmende cytokines, chemokinen en groeifactoren. Deze cellen vertonen het vermogen om neuro-inflammatie te reguleren in de context van neurodegeneratieve ziekten zoals prionziekte en andere stoornissen in het verkeerd vouwen van eiwitten. Prionziekten kunnen sporadisch, verworven of genetisch zijn; Ze kunnen het gevolg zijn van het verkeerd vouwen en aggregeren van het prioneiwit in de hersenen. Deze ziekten zijn steevast dodelijk, zonder dat er behandelingen beschikbaar zijn.
Een van de vroegste tekenen van ziekte is de activering van astrocyten en microglia en de daarmee gepaard gaande ontsteking, die optreedt voorafgaand aan detecteerbare prionaggregatie en neuronaal verlies; zo kunnen de ontstekingsremmende en regulerende eigenschappen van MSC's worden geoogst om astrogliose bij prionziekte te behandelen. Onlangs hebben we aangetoond dat van vet afgeleide MSC's (AdMSC's) in co-cultuur met BV2-cellen of primaire gemengde glia prion-geïnduceerde ontsteking verminderen door paracriene signalering. Dit artikel beschrijft een betrouwbare behandeling met behulp van gestimuleerde AdMSC's om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen.
Een heterozygote populatie van AdMSC's kan gemakkelijk worden geïsoleerd uit vetweefsel van muizen en in cultuur worden uitgebreid. Het stimuleren van deze cellen met inflammatoire cytokines verbetert hun vermogen om zowel te migreren naar prion-geïnfecteerde hersenhomogenen als als reactie daarop ontstekingsremmende modulatoren te produceren. Samen kunnen deze technieken worden gebruikt om het therapeutisch potentieel van MSC's bij prioninfectie te onderzoeken en kunnen ze worden aangepast voor andere eiwitmisvouwing en neuro-inflammatoire ziekten.

Het stimuleren van AdMSC's met TNFα of interferon-gamma (IFNγ) gedurende 24 uur induceert veranderingen in de expressie van ontstekingsremmende moleculen en groeifactoren. Behandeling van AdMSC's met TNFα of interferon-gamma (IFNγ) verhoogt het TNF-gestimuleerde gen 6 (TSG-6) mRNA, terwijl TNFα, maar niet IFNγ, een toename van transformerende groeifactor bèta-1 (TGFβ-1) mRNA veroorzaakt. Stimulatie met TNFα of IFNγ induceert een toename van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF)-mRNA, maar geen vera...

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSC's) hebben krachtige immunomodulerende eigenschappen die nuttig zijn voor de behandeling van ziekten die verband houden met ontstekingen. We demonstreren hoe AdMSC's van muizen en primaire gemengde glia kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, AdMSC's kunnen worden gestimuleerd om ontstekingsremmende genen en groeifactoren te reguleren, migratie van AdMSC's kunnen worden beoordeeld en AdMSC's kunnen worden gekweekt met primaire gemengde prion-geïnfecteerde glia.

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Ons werk richt zich op prionziekten, dit zijn dodelijke neurodegeneratieve ziekten die worden veroorzaakt door het verkeerd vouwen van het prioneiwit in de hersenen. Er zijn maar weinig studies die zich hebben gericht op de impact van gliacellen op neuronale dood. We willen begrijpen of het stoppen van ontstekingen veroorzaakt door gliacellen een therapeutische benadering kan zijn.Er is een recente ontdekking gedaan in het mesenchymale stromale celveld, waaruit blijkt dat de beschermende eigenschappen voortkomen uit de extracellulaire blaasjes die ze afgeven. We willen dieper ingaan op de inhoud van deze blaasjes en begrijpen hoe ze bescherming bieden tegen door prionen veroorzaakte glia-ontsteking. Momenteel zijn er op het gebied van neurodegeneratie een paar manieren die succesvol zijn in het stoppen van neuro-inflammatie.Deze omvatten kleine moleculen en genetische modulatie met behulp van adeno- of lentivirussen. Geen enkele is echter in staat geweest om ontstekingen volledig te verminderen, met name in grote delen van de hersenen. De belangrijkste bevinding die we hebben kunnen vaststellen, is dat we door middel van celtherapie in staat zijn om de progressie van prionziekten te vertragen door remming van glia-ontsteking.Het gebruik van een gecombineerd met het primaire gliacelmodel van ziekte zal ons in staat stellen om te blijven vragen naar cellulaire stressroutes die belangrijk zijn voor neuroprotectie, op een efficiëntere en directere manier dan het gebruik van alleen in-vivo-modellen.

adipose-derived-mesenchymal-stromal-cells-co-cultured-with-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier hebben we een protocol voor het kweken van rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag. De gekweekte neuronen tot stand polariteit en creëren synapsen, en kan gescheiden worden van de glia voor gebruik in diverse toepassingen, zoals electrofysiologie, calcium imaging, overleving van de cel assays, immunocytochemie, en RNA / DNA / eiwit isolatie.

Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Globoïde cellen zijn een typerend pathologisch kenmerk van de ziekte van Krabbe, een leukodystrofie waarvoor momenteel geen effectieve langetermijntherapie bestaat. We hebben een celkweekmodel ontwikkeld om de intrinsieke biologie en het pathogene potentieel van geactiveerde microglia en hun transformatie in globoïde cellen te bestuderen.

Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Bij meercellige organismen veroorzaken uitgescheiden oplosbare factoren reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. Co-cultuursystemen bieden een eenvoudige manier om de veranderingen aan te brengen die worden veroorzaakt door uitgescheiden oplosbare factoren in de afwezigheid van cel-celcontact.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Leer hoe vetafgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSCs) in co-cultuur met primaire gemengde glia de door prionen geïnduceerde ontsteking verminderen. Deze methode biedt inzicht in neuroprotectieve celtherapie.

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen (Video) | JoVE Journal

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen

Meer video's verkennen