Name: Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Leer transgenexpressie in gekweekte cellen met ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren. Deze kosteneffectieve methode biedt robuuste transductie-efficiëntie en is minder toxisch dan traditionele transfectiemethoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Robert Tjian en Xavier Darzacq voor hun steun en het gebruik van laboratoriumapparatuur. We danken Mark Kay voor zijn geschenk van de KP1 en LK03 rep/cap plasmiden, en Luk Vandenberghe voor AAV4 rep/cap plasmide. Financiering werd verstrekt door het Howard Hughes Medical Institute (34430, RT) en het California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. erkent financiering van het Berkeley Stem Cell Center via een Siebel postdoctorale beurs en van de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG) via een Walter Benjamin fellowship.

Productie van ruwe vectoren en efficiënte DNA-afgifte in celculturen

<ol><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+An+essential+receptor+for+adeno-associated+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection.</a> Nature. 539 (7629), 456(2016).</li>
<li>Nicolson, S. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+utilizes+host+cell+nuclear+import+machinery+to+enter+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus.</a> Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+in+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors in Gene Therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Ling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adeno-Associated+Virus+Genome+Packaging+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).</li>
<li>Maurer, A. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Genome+Interactions+Important+for+Vector+Production+and+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction.</a> Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+adeno-associated+virus+DNA+termini+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro.</a> Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).</li>
<li>Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+and+replication+of+adeno-associated+virus+type+2+as+well+as+vector+DNA+sequences+from+recombinant+plasmids+containing+deletions+in+the+viral+inverted+terminal+repeats%3A+selective+encapsidation+of+viral+genomes+in+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions.</a> Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Serotype-Specific+Inverted+Terminal+Repeat+Sequence+Role+in+Vector+Transgene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatamerization+of+adeno-associated+virus+circular+genomes+occurs+through+intermolecular+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination.</a> Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Advances%3A+A+Meta-Analysis+of+AAV+Usage+in+Clinical+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Defective+Virus+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+between+Adeno-Associated+Virus+and+its+Helper+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses.</a> Viruses. 12 (6), 662(2020).</li>
<li>Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nonviral+transfection+and+adeno-associated+viral+transduction+on+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+assay+and+growth+cycle+studies+of+a+defective+adeno-satellite+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus.</a> Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).</li>
<li>Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+DNA+of+a+defective+human+parvovirus+isolated+from+a+genital+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.</a> Virology. 134 (1), 52-63 (1984).</li>
<li>Gao, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viruses+from+rhesus+monkeys+as+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clades+of+Adeno-associated+viruses+are+widely+disseminated+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).</li>
<li>Lisowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+clinically+relevant+AAV+variants+in+a+xenograft+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model.</a> Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).</li>
<li>Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+vectors+to+target+persistent+viral+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs.</a> Virology Journal. 18 (1), 85(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).</li>
<li>Bi, X., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rearrangement+mediated+by+inverted+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA rearrangement mediated by inverted repeats.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).</li>
<li>Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+adeno-associated+virus+into+pBR322%3A+rescue+of+intact+virus+from+the+recombinant+plasmid+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR9-MyD88+pathway+is+critical+for+adaptive+immune+responses+to+adeno-associated+virus+gene+therapy+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).</li>
<li>Wagner, H., Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+is+not+Toll%3A+new+pathways+in+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">All is not Toll: new pathways in DNA recognition.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Digital+Droplet-Based+AAV+Genome+Titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li>
<li>Bell, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV9+receptor+and+its+modification+to+improve+in+vivo+lung+gene+transfer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).</li>
<li>McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+persistent+expression+patterns+of+CNS+gene+transfer+by+an+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector.</a> Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).</li>
<li>Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+Rep+proteins+mediate+complex+formation+between+AAV+DNA+and+its+integration+site+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).</li>
<li>Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+integrate+at+chromosome+breakage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites.</a> Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+AAV+vector+integration+into+CRISPR-induced+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
</ol>

A.C.M. is consultant voor Janssen Pharmaceuticals en is lid van de SAB voor NewBiologix. Alle andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Klonen Het kloonprotocol is niet beperkt tot het hierboven gebruikte pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40-plasmide en kan eenvoudig worden gewijzigd op basis van de experimentele behoeften van een onderzoeker. Veel ITR-bevattende plasmiden zijn direct online te koop. Er zijn bijvoorbeeld plasmiden beschikbaar die zowel Cas9 als een sgRNA-kloonplaats bevatten, maar die weinig extra stappen vereisen, zoals oligonucleotide-gloeien en PNK-behandeling30. Bovendien kunnen plasmiden worden gevonden die een meervoudige kloonplaats (MCS) bevatten met alleen ITR's en geen interne regulerende elementen31. Als er verschillende plasmiden moeten worden gebruikt, zijn de restrictie-enzymen (RE) die voor de spijsvertering worden gebruikt meestal de enige elementen die in dit protocol moeten worden gewijzigd. Een beperking van rAAV is echter de beperkte laadcapaciteit. Vanwege de fysieke beperkingen van de capside mag het vectorgenoom niet groter zijn dan 4,9 kb, inclusief de ITR's.
Bij het isoleren van plasmide uit bacteriën is het van cruciaal belang om een endotoxine-arme of -vrije midiprep- of maxiprep-kit te gebruiken om schade aan cellen tijdens drievoudige plasmidetransfectie of -transductie te verminderen. Plasmide uit miniprep-kits bevat vaak hogere onzuiverheden, verlaagde concentraties en minder supercoiled DNA, die allemaal de stroomafwaartse productie van rAAV kunnen beïnvloeden en daarom niet worden aanbevolen.
Het is van cruciaal belang om de structuur en eigenschappen van ITR's tijdens het klonen te begrijpen. Ten eerste is het buitengewoon moeilijk om PCR via de ITR te gebruiken. Kloonontwerpen die PCR-amplificatie via ITR's vereisen, moeten worden vermeden en bovendien moet het gebruik van de Gibson-kloontechniek worden beperkt. Als zodanig is het klonen van restrictie-enzymen de voorkeursmethode voor klonen in ITR-bevattende plasmiden. Bovendien zijn bepaalde primers voor Sanger-sequencing mogelijk niet compatibel als het gesequencede gebied de ITR bevat. In plaats daarvan wordt aanbevolen om primers te gebruiken die de sequentie van de ITR's naar het vectorgenoomlichaam leiden om nauwkeurigere sequentieresultaten te krijgen. Ten tweede zijn ITR's vatbaar voor deleties, herschikkingen en mutaties wanneer ze worden omgezet in bacteriën voor plasmide-amplificatie32,33. Om deze gebeurtenissen te verzachten, wordt aanbevolen om recombinatie-deficiënte competente bacteriestammen, zoals Stbl3, te gebruiken en deze bij 30 °C te incuberen om de celdeling te vertragen. Ten slotte is opgemerkt dat kleinere kolonies kunnen overeenkomen met klonen zonder herschikking of deleties, aangezien kolonies zonder ITR's een groeivoordeel kunnen opleveren en groter kunnen zijn. Daarom wordt aanbevolen om kleine kolonies te plukken.
Vector productie De succesvolle productie van rAAV-vector kan door meerdere elementen worden beïnvloed. Een kritische factor is de gezondheid van HEK293- of 293T-cellen die worden gebruikt voor transfectie. Over het algemeen zijn lage passagecijfers ideaal, omdat cellen met een hoge passage genotypische en fenotypische afwijkingen kunnen vertonen die rAAV-titers kunnen verminderen. Bovendien moet de dichtheid van de gezaaide cellen 75%-90% confluentie zijn voor een effectieve productie. Schaarse cellen genereren lage vectoropbrengsten omdat er minder cellen beschikbaar zijn om vectoren te produceren, terwijl overwoekerde cellen niet efficiënt worden getransfecteerd.
Variaties tussen reagenspartijen, celvoorraden en algemene variabiliteit van lab tot lab dragen bij aan verschillen in transfectie-efficiëntie en productietiter. Een optimaliseerbare factor die tot titerverbeteringen kan leiden, is de plasmide:PEI-verhouding in transfectiereacties. Het is van cruciaal belang om verse (<1 maand oude) PEI MAX te gebruiken. Het wordt aanbevolen om een plasmide:PEI-verhouding van 1:1 als uitgangspunt te gebruiken, en als de transfectie of transductie-efficiëntie slecht lijkt, test dan verschillende verhoudingen. Titeroptimalisatie is het gemakkelijkst als een transgen wordt gebruikt met een visuele uitlezing, zoals het CMV.Luc.IRES.EGFP-reportertrangen dat hierin wordt gebruikt als uitgangsmateriaal voor klonen. Om de optimalisatie uit te voeren, volgt u protocolstap 3 met behulp van een plaat met 12 putjes en verkleint u de plasmidemassa's en reagensvolumes met twee (de uiteindelijke plasmidemassa is 2,6 μg). Pas het PEI-volume dienovereenkomstig aan om overeen te komen met verhoudingen van 1:0.75 tot 1:3, met toenemende stappen van 0.25 (Figuur 6). Verdun elke reactie na 15 minuten met 950 μL SF-media. Voor het gemak kan een mastermix met de drievoudige plasmiden worden gemaakt en afzonderlijk worden gepipetteerd in buisjes van 1,5 ml voordat PEI wordt toegevoegd - zie aanvullend bestand 2. Oogst de vector, transduceer cellen van belang en afbeelding. Het putje met de hoogste transductie-efficiëntie (aandeel GFP+-cellen) komt overeen met de hoogste titer en de meest optimale verhouding van PEI:DNA.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg"> Figuur 6: PEI-optimalisatieworkflow. Schema van de stappen die nodig zijn voor PEI-optimalisatie. Meerdere verhoudingen van plasmide: PEI worden getest om de optimale verhouding te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Oogst- en titeroverwegingen De vries-/dooitechniek die wordt gebruikt om de rAAV-vector te oogsten, lyseert HEK293-cellen effectief op een manier die verenigbaar is met het directe gebruik van het geklaarde lysaat om gekweekte cellen te transduceren. Bepaalde rAAV-serotypen, zoals AAV1, AAV8 en AAV9, komen vrij uit cellen tijdens de vectorproductie en kunnen worden geoogst uit het gekweekte celmedium zonder vries-/dooicycli34. De hier beschreven methode levert doorgaans titers op in de orde van grootte van 1 x 1010 VG/ml bij gebruik van AAV2-capsiden en 1 x 1011 VG/ml voor AAV8. Hoewel hogere titers kunnen worden bereikt door wasmiddel of andere lysis op basis van chemicaliën, zijn deze schadelijk voor cellen bij stroomafwaarts gebruik en vereisen ze dat rAAV's verder uit het lysaat worden gezuiverd. Een lagere titer is een afweging die een onderzoeker moet overwegen bij het bepalen of ruwe preparaten geschikt zijn voor hun onderzoeksbehoeften, maar de marginaal lagere titers die worden geproduceerd door de hier beschreven methoden kunnen veel celtypen zeer goed transduceren (zie representatieve resultaten). Naast de transfectie-efficiëntie en celgezondheid variëren vectortiters afhankelijk van de capside die wordt gebruikt tijdens de productie van rAAV en de grootte en sequentie van het transgen binnen de VG35.
Bij het oogsten van ruwe vectorpreparaten kan plasmide-DNA aanwezig zijn dat werd gebruikt tijdens de transfectie van drievoudig plasmide en, hoewel zeldzaam, resulteren in stroomafwaartse transfectie tijdens transductie. Bovendien kunnen onverpakte VG's zich binden aan de buitenkant van capsiden en een aangeboren immuunrespons oproepen op naakt en vreemd enkelstrengs DNA36,37. Daarom kan het voor gevoelige celtypen nodig zijn dat vectorpreparaten DNase worden verteerd en gezuiverd om onverpakte VG's en plasmide te verwijderen.
Als men de titer van een ruw preparaat wil berekenen, kan qPCR worden uitgevoerd om het aantal verpakte VG in DNase-resistente deeltjes (DRP) te kwantificeren. In het kort wordt een kleine hoeveelheid ruw preparaat DNase-verteerd om plasmide-DNA, verontreinigende nucleïnezuren of gedeeltelijk verpakt VG te verwijderen. Het monster wordt vervolgens onderworpen aan qPCR en de beschermde VG in DRP's wordt gekwantificeerd, wat resulteert in een titer met eenheden van vectorgenoom per ml ruw preparaat38. Het wordt niet aanbevolen om vectortitratie uit te voeren met behulp van ELISA-gebaseerde assays die capsidetiters kwantificeren. In vergelijking met het wildtype AAV-virus heeft rAAV last van een aandeel lege en gedeeltelijk verpakte capsiden39. ELISA zal alle capsiden kwantificeren, ongeacht hun genoominhoud, en zal de transduceerbare eenheden overschatten die aanwezig zijn in een preparaat, waarvoor een verpakte VG nodig is.
Overwegingen bij transductie Veel factoren zijn van invloed op rAAV-transducties en er moeten de juiste overwegingen worden gemaakt voor elk nieuw experiment. Afhankelijk van de promotor die de transgenexpressie aanstuurt, kan het begin van de expressie al 4 uur na transductie (hpt) optreden, en de piekexpressie wordt doorgaans bereikt door 48 hpt. Het is belangrijk om rekening te houden met de tijdsduur vanaf het eerste zaaien van cellen tot het experimentele eindpunt. Dit is om de beginsamenvloeiing van de cellen in te schatten en ervoor te zorgen dat ze aan het einde van het experiment niet overgroeien. Als cellen te veel samenvloeien, kan het cellulaire gedrag veranderen als gevolg van een stressreactie en kan het experimentele resultaten verwarren. Sommige celtypen, zoals U2-OS, kunnen overgroei/contactremming vrij goed verdragen. Bovendien zijn ze bestand tegen lange perioden (48 uur+) in serumvrij geconditioneerd medium - het product van dit productieprotocol. Voor gevoelige celtypen kan het echter nodig zijn om het ruwe preparaat in serum toe te voegen of te verdunnen met een speciaal groeimedium om de gezondheid tijdens de transductie te behouden. Een licht verminderde transductie-efficiëntie door het gebruik van serumbevattende media is een mogelijke afweging voor de gezondheid van de cel en moet door de onderzoeker worden overwogen.
Doorgaans is voor snel delende cellen een startconfluentie van ongeveer 50% optimaal voor toepassingen die 48 hpt worden beëindigd. De confluentie kan echter dienovereenkomstig worden aangepast op basis van de behoeften van het experiment. Het wordt niet aanbevolen om onsterfelijke cellijnen van het monolaagtype met een confluentie van meer dan 75% te transduceren vanwege verminderde transductie-efficiëntie. De meeste gekweekte celtypen zijn met succes getransduceerd en gezond na een nacht incubatie met ruwe rAAV-preparaten, gevolgd door een verandering naar verse serumbevattende media in de ochtend.
Capside-serotype is een belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het produceren van rAAV om een doelcel te transduceren, aangezien de capside de primaire determinant is van cellulair tropisme en daaropvolgende transgenexpressie13. AAV2 is een veelgebruikt serotype vanwege het vermogen om vele soorten gekweekte cellen effectief te transduceren12. Deze eigenschap van AAV2 kan worden toegeschreven aan heparinesulfaatproteoglycanen (HSPG's) die dienen als de primaire hechtingsfactor voor AAV2 en de hoge niveaus van HSPG's op gekweekte cellen vanaf de aanpassing tot het groeien in een schaal40. Andere capsiden, zoals AAV9, zijn minder effectief in het transduceren van brede celtypen en kunnen worden verklaard door hun afhankelijkheidshechtingsfactoren die niet tot uiting komen in deze setting41. Daarom raden we AAV2 aan als eerste keus capside in gekweekte cellen als een gewenste doelcel niet eerder in de literatuur is getest met rAAV.
Houd er rekening mee dat een belangrijke beperking van preparaten voor ruwe vectoren is dat ze niet geschikt zijn voor het transduceren van diermodellen. In vivo studies vereisen dat preparaten worden gezuiverd en aan een kwaliteitsbeoordeling worden onderworpen.
Transgenexpressie en mogelijke integratieoverwegingen rAAV's resulteren niet op betrouwbare wijze in permanente expressie van het transgen. Na verloop van tijd kunnen VG's het zwijgen worden opgelegd en kan transgene expressie worden stopgezet na verschillende passages42. Bovendien blijven de meeste VG's episomaal en bevatten rAAV's niet de virale Rep-eiwitten die frequente integratie in het gastheergenoom zouden mediëren zoals bij een wild-type virale lysogene infectie of replicatie van VG's zouden bevorderen43. Als gevolg hiervan zullen episomen in getransduceerde cellen uiteindelijk worden verdund tussen dochtercellen door middel van delingen.
Integratie op basaal niveau is een mogelijkheid voor al het geleverde transgene DNA-materiaal. ITR-bevattende VG's zijn echter gevoelig voor integratie met een hogere frequentie44. Daarom kan permanente expressie van een transgen worden waargenomen in een kleine subset van cellen. Gebruikers moeten deze mogelijkheid overwegen, vooral bij het gebruik van rAAV om DNA-knippende enzymen, zoals Cas9, af te leveren, aangezien dubbelstrengs breuken kunnen resulteren in een nog grotere frequentie van integratie en permanente expressie45. Hoewel dit rAAV een goede kandidaat maakt voor het leveren van homologiegerichte reparatiesjablonen voor endogene tagging of gentoevoeging, moet de mogelijkheid van Cas9-insertie worden overwogen19,46.

Het ophelderen van de moleculaire basis van cellulaire functies vereist vaak de expressie van transgeen DNA in celkweek. Om tot expressie te worden gebracht, moeten transgenen door het selectieve membraan van een cel dringen en de kern bereiken 1,2. Daarom is het vermogen om de fysieke barrières van de cel effectief te omzeilen en de centrale processen te manipuleren een noodzaak voor het toepassen van transgenese om nieuwe biologische fenomenen aan het licht te brengen. Eén benadering maakt gebruik van het intrinsieke vermogen van virussen om vreemd DNA af te leveren en tot expressie te brengen 3,4.
Adeno-geassocieerd virus (AAV) is een van de kleinste zoogdiervirussen: het 4,7 kilobase (kb), enkelstrengs DNA-genoom bevat twee genen, rep (voor replicase) en cap (voor capside), verpakt in een 60-mer icosahedrale capside van 25 nm. De rep/cap-genen hebben meerdere promotors, leesframes en splice-producten die coderen voor ten minste negen unieke eiwitten die nodig zijn voor virale replicatie, productie en verpakking 5,6. Bovendien bevatten beide uiteinden van het genoom secundaire structuren die omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) worden genoemd en die nodig zijn voor DNA-replicatie, genoomverpakking en stroomafwaartse verwerking tijdens transductie 7,8,9,10. De ITR's zijn de enige DNA-elementen die nodig zijn voor de verpakking van het genoom in de capside, en daarom kan AAV worden gekloond voor transgenafgiftedoeleinden door de virale rep/cap-genen te vervangen door de keuze van een onderzoeker van regulerende elementen en/of genen van belang6. De resulterende recombinante AAV (rAAV), met een gemanipuleerd vectorgenoom (VG), wordt veel gebruikt in de kliniek voor menselijke gentherapie en heeft successen behaald11. Een ondergewaardeerd gebruik van de vector is in het laboratorium; rAAV's kunnen efficiënt transgenexpressie bereiken in gekweekte cellen om aan de experimentele behoeften van een onderzoeker te voldoen12.
De meest gebruikelijke methode voor het produceren van rAAV is door drievoudige plasmidetransfectie in HEK293- of 293T-cellen (Figuur 1). Het eerste plasmide, gewoonlijk het cis-plasmide genoemd, bevat het gewenste transgen geflankeerd door ITR's (pAAV). Afhankelijk van de toepassing zijn cis-plasmiden met gemeenschappelijke elementen, zoals sterke promotors of op CRISPR gebaseerde tools, te koop. De tweede is het pRep/Cap-plasmide dat de wild-type AAV-rep- en cap-genen bevat die in-trans worden geleverd - d.w.z. op een afzonderlijk, niet-ITR-bevattend plasmide dat regulerende en structurele elementen tot expressie brengt die vervolgens interageren met het cis-plasmide - en wordt daarom het transplasmide genoemd. Naast het fysiek omsluiten van de VG, beïnvloedt de capside cellulair tropisme12,13. Door het serotype-specifieke cap-gen in-trans aan te bieden, zijn onderzoekers gemakkelijk in staat om de transductie-efficiëntie te maximaliseren door een geoptimaliseerd capside-serotype te kiezen voor hun gegeven doelcel. Ten slotte heeft AAV, als Dependoparvovirus, een helpervirus nodig om rep/cap-expressie van zijn virale promotors te activeren, bereikt door adenovirale helpergenen, geleverd op een derde plasmide zoals pAdΔF614,15. Na 72 uur triple-plasmidetransfectie kan de vector uit de producerende cellen in de kweekmedia worden vrijgegeven door herhaalde vries-/dooicycli. De volledige inhoud van de plaat wordt vervolgens verzameld en grote celresten worden verwijderd door centrifugeren; het resulterende media-supernatans is een rAAV-preparaat dat klaar is voor stroomafwaartse transducties.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de productie van ruwe rAAV-vectoren. De productie en transductie van ruwe rAAV kan binnen 5 dagen worden bereikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
rAAV kan gunstiger zijn voor transgenafgifte in vergelijking met andere transfectiemethoden, die vaak worden geassocieerd met cellulaire toxiciteit, lage efficiëntie en dure reagentia en apparatuur, zoals voor elektroporatie of transfectie op basis van chemicaliën/lipiden16,17. rAAV omzeilt deze obstakels en biedt vaak krachtige transgenexpressie met minimale toxiciteit en minimale hands-on tijd. Belangrijk is dat het produceren van rAAV en het toepassen ervan in celkweek eenvoudig is en zelden zuivering van de vector uit de kweekmedia vereist (Figuur 1). Bovendien integreert rAAV zijn VG niet in het genoom van de gastheer, in tegenstelling tot de toediening van het lentivirale transgen, en verlaagt zo het risico op insertionele mutagenese18. Ondanks de potentiële voordelen van het gebruik van rAAV voor transgenafgifte, moet rekening worden gehouden met beperkingen. Belangrijk is dat de grootte van het transgen, inclusief de ITR's, niet groter mag zijn dan 4,9 kb vanwege fysieke beperkingen van de capside, waardoor het vermogen van een onderzoeker om effectief grote regulerende elementen en transgenen af te leveren, wordt beperkt. Bovendien, aangezien rAAV een niet-integrerend virus is, resulteert transductie in voorbijgaande transgenexpressie in delende cellen en is het mogelijk niet praktisch voor stabiele expressie. Methoden die gebruik maken van dubbele rAAV-afgeleverde Cas9- en homologie-gerichte reparatie (HDR)-sjablonen kunnen echter worden gebruikt om sequenties stabiel in te voegen op specifieke genomische loci als een onderzoeker dat wenst19.

<table><tbody><tr><td>Snapgene DNA viewing sofrware</td><td>Snapgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td><td>AddGene</td><td>105533</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td><td>AddGene</td><td>104963</td><td></td></tr><tr><td>pAd&Delta;F6</td><td>AddGene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0418</td><td></td></tr><tr><td>Boekel Scientific Economy Digital Incubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000</td><td></td></tr><tr><td>LB medium, powder</td><td>MP Biomedicals</td><td>113002042</td><td></td></tr><tr><td>Carbencillin (Disodium)</td><td>GoldBio</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick I26 Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6333000022</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Buffer</td><td>NEB</td><td>B0518S</td><td>Verstrekt bij aankoop van Phusion Polymerase</td></tr><tr><td>Phusion&nbsp;High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Orange (6X)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-100</td><td>Zymo</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Verstrekt bij aankoop van restrictie-enzym</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Verstrekt bij aankoop van T4 Ligase</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Precision Microprocessor Water Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221046</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Plastic Culture Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>149566B</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifuge Tube</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149Y01</td><td></td></tr><tr><td>ZR Plasmid Miniprep - Classic</td><td>Zymo</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>Xma1</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>Sma1</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-well</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator</td><td>Marshall Scientific</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex Genie 2</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo Ultra Low Freezer</td><td>Sanyo</td><td>14656-15267-16219</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Line IL 10 with transparent window</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuges</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-well</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>JAX</td><td>strain #000664</td><td></td></tr><tr><td>organoid growth medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>6005</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane</td><td>Fisher</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher</td><td>08-772-3D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Fisher</td><td>12-565-470</td><td></td></tr><tr><td>BeWo cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-98</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Hepa1-6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>UC Berkeley BSD Cell Culture Facility</td><td>HUH-7</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>HSkMC</td><td>ATCC</td><td>PCS-950-010</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium</td><td>Sigma</td><td>C-23060</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Differentiation Medium</td><td>Sigma</td><td>C-23061</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp;EVOS Digital Color Fluorescence Microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-340</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14001000</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 96-well</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td></td></tr><tr>

transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAV) kunnen krachtige en duurzame transgenexpressie bereiken zonder integratie in een breed scala aan weefseltypes, waardoor ze een populaire keuze zijn voor genafgifte in diermodellen en in klinische omgevingen. Naast therapeutische toepassingen zijn rAAV's een nuttig laboratoriuminstrument voor het afleveren van transgenen die zijn afgestemd op de experimentele behoeften en wetenschappelijke doelen van de onderzoeker in gekweekte cellen. Enkele voorbeelden zijn exogene reportergenen, overexpressiecassettes, RNA-interferentie en op CRISPR gebaseerde tools, waaronder die voor genoombrede screenings. rAAV-transducties zijn minder schadelijk voor cellen dan elektroporatie of chemische transfectie en vereisen geen speciale apparatuur of dure reagentia om te produceren. Ruwe lysaten of geconditioneerde media die rAAV's bevatten, kunnen rechtstreeks aan gekweekte cellen worden toegevoegd zonder verdere zuivering om veel celtypen te transduceren - een ondergewaardeerde eigenschap van rAAV's. Hier bieden we protocollen voor het klonen van transgencassettes en demonstreren we hoe ruwe rAAV-preparaten kunnen worden geproduceerd en toegepast op gekweekte cellen. Als proof of principle demonstreren we de transductie van drie celtypes die nog niet gerapporteerd zijn in rAAV-toepassingen: placentacellen, myoblasten en organoïden van de dunne darm. We bespreken geschikte toepassingen voor ruwe rAAV-preparaten, de beperkingen van rAAV's voor genafgifte en overwegingen voor capsidekeuze. Dit protocol schetst een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor onderzoekers om productieve DNA-afgifte in celkweek te bereiken met behulp van rAAV zonder de noodzaak van moeizame titratie- en zuiveringsstappen.

Het vinden van een optimale capside voor het transduceren van gekweekte cellen van belang Een verscheidenheid aan celtypen werd getransduceerd om het tropisme van verschillende capside-serotypen te bepalen (Figuur 5). De natuurlijke serotypen AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 en de gemanipuleerde capsidevarianten Anc80 25, DJ 26, LK0327 enKP1 28 werden verpakt met een vectorgenoom dat mScarlet tot expressie brengt onder een CMV-promotor, gekloond met behulp van de methoden die in dit protocol worden verstrekt. Niet-getitreerde ruwe vectorpreparaten werden verdund in de juiste kweekmedia en de cellen werden gedurende 24+ uur getransduceerd en in beeld gebracht (figuur 5B). De transductie-efficiëntie werd berekend door het aandeel van het totale aantal cellen dat mScarlet+ was, of het aandeel cellen in een enkel z-vlak dat mScarlet+ was (voor organoïden van de dunne darm van muizen; Figuur 5C). Transductie-efficiënties (mScarlet+-cellen) worden niet verstrekt voor gedifferentieerde C2C12- en HSkMC-myotubes, maar eerder voor ongedifferentieerde C2C12- en HSkMC-myoblasten (Figuur 5A).
AAV2 en KP1 waren de krachtigste serotypen in alle geteste cellijnen (Figuur 5A). Er werd ook waargenomen dat vergelijkbare celtypen afkomstig van verschillende soorten met verschillende efficiëntie worden getransduceerd. Hepa1-6 (een van muizen afgeleide levercellijn) vertoont bijvoorbeeld een duidelijke afname van de transductie in vergelijking met Huh7 (een van mensen afgeleide levercellijn) bij gebruik van AAV2 (Figuur 5B). Bovendien spelen verschillende mediacondities een belangrijke rol tijdens de transductie. Organoïden van de dunne darm van muizen (mSIO's) gekweekt in pre-transductiemedia worden minder effectief getransduceerd in vergelijking met organoïde groeimedia (Figuur 5C). Bovendien transduceert AAV2 op efficiënte wijze ongedifferentieerde HSkMC-myoblasten en gedifferentieerde HSkMC-myotubes (Figuur 5B), hoewel kwantitatieve analyse van myotubes moeilijk is en daarom niet wordt verstrekt.
De hoge transductie-efficiëntie die voor verschillende celtypen in figuur 5 is waargenomen, laat zien dat ruwe vectorpreparaten effectief kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan celtypen te transduceren zonder verdere stappen zoals zuivering en titratie. Er moet echter zorgvuldig worden nagedacht bij het kiezen van een capside om de afgifte van transgen te maximaliseren. Veel andere cellijnen en capsiden zijn eerder getest en gepubliceerd, zij het met gezuiverde vectorpreparaten12.
Een vectordeeltje-onafhankelijk effect van mediacondities kan de efficiëntie van de transductie beïnvloeden. Het is echter algemeen aanvaard dat tropisme (d.w.z. celtype-specifieke opname en expressie van vector) een eigenschap is die capside-specifiek is29. Er is nog niet waargenomen dat een vergelijking tussen op de dosis afgestemde ruwe en gezuiverde preparaten het cellulaire tropisme beïnvloedt. Daarom kunnen preparaten van ruwe vectoren op dezelfde manier worden gebruikt als gezuiverde vectoren in celkweek.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg"> Figuur 5: Ruwe vectortransductie van verschillende celtypen . (A) Percentage mScarlet+ na toevoeging van verschillende AAV-vectoren die een mScarlet-transgen bevatten. (B) Cellen die mScarlet tot expressie brengen, geleverd door AAV-serotype 2. Schaalbalken: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 en HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Afkortingen: hpt = uren na transductie. (C) Dunne darmorganoïden (mSIO's) van muizen werden ofwel rAAV behandeld in pre-transductiemedia of organoïde groeimedia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: Werkblad voor drievoudige plasmidetransfectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: PEI-optimalisatiewerkblad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

Gentherapie maakt gebruik van een virale capside om DNA in cellen te introduceren, en vervolgens verwerken de cellen dat DNA via mechanismen die niet volledig worden begrepen. Door te bestuderen hoe de cel AAV-afgeleverd DNA verwerkt, hopen we de veiligheid, werkzaamheid en levensduur van AAV-gentherapieën te verbeteren. Het bestuderen van AAV-DNA-verwerking op weefsel- of organismeniveau was vrij moeilijk.En terwijl we bezig waren met het ontwikkelen van celkweektransductieprotocollen voor AAV-visualisatie via superresolutiemicroscopie, ontdekten we dat de eenvoud van het produceren en gebruiken van ongezuiverde AAV-preparaten in celkweek niet goed bekend is. Deze eenvoudige methode voor transiënte expressie kan voordelig zijn voor onderzoekers op tal van gebieden. Het maken van ruwe AAV-preparaten is vrij eenvoudig en ze hebben een lange houdbaarheid F4C, waardoor ze in tal van experimenten kunnen worden gebruikt.Het aanbrengen ervan is eenvoudig, waardoor ze een tijd- en kosteneffectief alternatief zijn voor standaard transfectiereagentia. Vaak zijn ruwe AAV-preparaten efficiënter en minder giftig dan transfectie. Vectrologie heeft twee armen, productie en transductie, en beide zijn volledig afhankelijk van de cellulaire machinerie van de gastheer.Ons toekomstig onderzoek is gericht op het identificeren van de cellulaire machinerie die betrokken is bij deze processen en manieren om ze te manipuleren, zodat we de productie- en transductie-efficiëntie kunnen verbeteren. Het begrijpen van de basisbiologie die ten grondslag ligt aan beide takken van de vectrologie is van vitaal belang voor het succes van gentherapieën.

transgene-expression-cultured-cells-using-unpurified-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we de identificatie van het adeno-geassocieerd virus serotype 3 (AAV3) als de meest efficiënte vector voor het richten van de menselijke lever kankercellen.

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectoren worden steeds waardevol...

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

We tonen de basistechniek om moleculair ingenieur en synthetische adeno-geassocieerde virale (AAV) gentherapievectoren evolueren via DNA-familie shuffelen. Bovendien geven we algemene richtlijnen en representatieve voorbeelden voor de selectie en analyse van individuele chimere capsiden met verbeterde eigenschappen op doel cellen in cultuur of in muizen.

Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.

Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

Er worden methoden beschreven voor het genereren van grote hoeveelheden recombinante adenovirussen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het inheemse knaagdier urotheel te transduceren, waardoor expressie van transgenen of downregulatie van endogene genproducten mogelijk is.

Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Leer transgenexpressie in gekweekte cellen met ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren. Deze kosteneffectieve methode biedt robuuste transductie-efficiëntie en is minder toxisch dan traditionele transfectiemethoden.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Meer video's verkennen