Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern
28 juli 2023
De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.
Dit onderzoek richt zich op het ondersteunen van geneesmiddelenontdekkingsstudies met behulp van single nuclei RNA-sequencing om de werkzaamheid en veiligheid van potentiële behandelingen te onderzoeken. Daarom ontwikkelen we gestandaardiseerde protocollen voor het extraheren van kernen voor vers ingevroren weefselmonsters van verschillende organen. Ons doel was om de extractie van kernen te automatiseren en te standaardiseren om consistente en betrouwbare resultaten te bereiken door niet-biologische variabiliteit te verminderen.
Het voordeel is de gedeeltelijke automatisering door het gebruik van een robotdissociator en de eenvoudige en korte workflow die kan worden toegepast op verschillende weefselmonsters van verschillende soorten. Het hebben van gestandaardiseerde protocollen kan ons helpen vragen over de biologische distributie van geneesmiddelen te beantwoorden, en de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan eventuele veiligheidssignalen die we zouden kunnen waarnemen. In de toekomst zullen we de toepasbaarheid van ons protocol testen voor andere downstream-toepassingen, zoals ATAC-seq of multiomics.
We zullen ook proberen protocollen op te stellen om viraal tot expressie gebrachte transgenen in afzonderlijke kernen te detecteren.
Overzicht
Deze studie presenteert een gestandaardiseerd en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de extractie van hoogwaardige nuclei uit bevroren zoogdierweefsels, met als doel de efficiëntie en betrouwbaarheid van daaropvolgende single nuclei RNA-sequencing te verbeteren. Het protocol draagt bij aan de verbetering van studies naar geneesmiddelenontwikkeling door niet-biologische variabiliteit te verminderen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- RNA-sequencing van enkelvoudige kernen
- Studies naar geneesmiddelenontwikkeling
- Isolatie van hoogwaardige kernen
Achtergrond
- Ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen voor nucleusextractie
- Focus op vers ingevroren weefselmonsters uit diverse organen
- Doel is het analyseren van geneesmiddelbiodistributie en veiligheidssignalen
Gebruikte methoden
- Gedeeltelijk geautomatiseerde kernextractie met behulp van een robotische dissociator
- Zoogdierweefsels van diverse soorten
- Implementatie van sucrose-gradiëntzuivering
Belangrijkste resultaten
- Hoge kwaliteit celkernen verkregen zonder tekenen van debris of aggregatie
- Consistente resultaten over verschillende weefseltypen heen
- Lage technische variabiliteit en vergelijkbare cellulaire proporties tussen monsters
Conclusies
- De studie automatiseert en standaardiseert de extractie van kernen met succes.
- Dit protocol kan aanzienlijk helpen bij het beantwoorden van biologische vragen in medicijnontwikkeling en veiligheidsbeoordelingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Gestandaardiseerde isolatie van enkelvoudige kernen uit bevroren weefsels maakt robuuste transcriptomische profilering mogelijk in drug discovery, wat zowel onderzoek naar effectiviteit als veiligheid ondersteunt. Door niet-biologische variabiliteit te minimaliseren via gedeeltelijke automatisering, verhoogt dit protocol het voorspellende vertrouwen in downstream single nucleus RNA-sequencing. De aanpasbaarheid aan verschillende weefseltypen maakt het tot een herbruikbare methode voor mechanische risicoreductie en targetvalidatie voor de gehele portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om het werkingsmechanisme van geneesmiddelen en weefselspecifieke genexpressie te onderzoeken in archiefmonsters of monsters die moeilijk te dissociëren zijn.
- Vermindert technische variabiliteit, wat bijdraagt aan functionele targetvalidatie en mechanistische risicoreductie.
- Faciliteert de reproduceerbare generatie van gegevens voor hypothese-gestuurde triage van portfolio's.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt hoogwaardige kernsuspensies voor die geschikt zijn voor gestandaardiseerde single nucleus RNA-sequencing workflows.
- Ondersteunt de reproduceerbaarheid van assays en de consistentie van de kwantitatieve output over meerdere weefseltypes en soorten.
- Maakt schaalbare, gedeeltelijk geautomatiseerde monstervenwerking mogelijk voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt overeen met weefselanalyse van ziekte-relevante weefsels voor de ontdekking van translationele biomarkers bij gebruik van bevroren of archiefmonsters.
- Handhaaft continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie door ondersteuning van multi-weefsel- en multi-speciesstudies.
- Biedt een basis voor toekomstige multi-omics- en ATAC-seq-toepassingen, zoals vermeld in de vooruitblik van het protocol.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en maakt transcriptomanalyse met een hoge getrouwheid vanuit bevroren weefsels mogelijk voor de identificatie van lead-moleculen en mechanistische studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door single-nucleus transcriptomica mogelijk te maken uit diverse weefsels.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve kernpreparaten voor downstream sequencing-assays.
- Analytica: Biedt gestandaardiseerde outputs zoals gen-counts, UMI-counts en mitochondriaal gehalte voor vergelijking tussen monsters.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de analyse van drug-biodistributie en veiligheidssignalen in ziekterelevante weefsels.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Biedt een breed aanpasbaar protocol voor meerdere weefseltypen en soorten, ter ondersteuning van portfolio-brede studies.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in transcriptomische studies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en gedeeltelijke automatisering van workflows voor nuclei-isolatie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en de kapitaalefficiëntie door technische variabiliteit te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van drug-kandidaten mogelijk op basis van robuuste moleculaire gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, isolatie van kernen en downstream sequencing-workflows.
- Toegang tot een robotische dissociator, een geautomatiseerde fluorescente celsteller en een standaard moleculaire biologie-infrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid over verschillende studies en locaties te waarborgen.
- Aanpasbaar aan diverse zoogdierweefsels met minimale optimalisatie, zoals aangetoond in meerdere soorten.
- Potentiële beperkingen omvatten de noodzaak voor protocolaanpassingen voor niet-standaard weefsels of toekomstige multi-omics toepassingen.
