Name: Voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Leer immunofluorescentiekleuring van ooglensvezelcellen om membraanarchitectuur en celinterdigitaties te bestuderen. Deze methode behoudt complexe structuren voor confocale microscopie en eiwitanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute. De auteurs bedanken Dr. Theresa Fassel en Kimberly Vanderpool van de Scripps Research Core Microscopy Facility voor hun hulp bij de elektronenmicroscoopbeelden.

Muizen zijn verzorgd op basis van een dierprotocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University Bloomington. De muizen die werden gebruikt om representatieve gegevens te genereren, waren controledieren (wildtype) met een C57BL6/J-achtergrond, vrouwelijk en 8-12 weken oud. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen voor dit experiment worden gebruikt, omdat het zeer onwaarschijnlijk is dat het geslacht van de muizen de uitkomst van het experiment beïnvloedt.
1. Lensdissectie en decapsulatie
<ol><li>Euthanaseer muizen volgens de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" van de National Institutes of Health en de protocollen voor diergebruik die door de instelling zijn goedgekeurd. OPMERKING: Voor de huidige studie werden muizen geëuthanaseerd door een overdosis CO2 gevolgd door cervicale dislocatie in overeenstemming met een goedgekeurd dierprotocol (Indiana University).</li>
	<li>Ontbind de ogen van de muizen met behulp van een gebogen pincet door het weefsel rond de ogen met één kant van de pincet in te drukken om het oog uit de kas te verplaatsen. Sluit vervolgens de pincet onder het oog en til het op om het oog uit de oogkas te verwijderen. Breng de ogen over op verse 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een dissectiebak.</li>
	<li>Knip de oogzenuw met een ultrafijne schaar zo dicht mogelijk bij de oogbol door. Steek voorzichtig een recht pincet met fijne punt in de oogbol door de uitgang van de oogzenuw aan de achterkant van het oog.</li>
	<li>Steek voorzichtig een schaar in op dezelfde plaats als het pincet in stap 1.3 en begin met het knippen van een incisie van de achterkant naar de overgang tussen het hoornvlies en de sclera. OPMERKING: Knaagdierlenzen bezetten ~30% van hun ogen. Onopzettelijke schade zal optreden als het pincet of de schaar te diep in het oog wordt gestoken.</li>
	<li>Ga door met knippen langs de cornea-sclerale overgang totdat ten minste de helft van de overgang is gescheiden.</li>
	<li>Gebruik een pincet om voorzichtig op het hoornvlies te drukken, zodat de lens door de incisie kan ontsnappen die is gemaakt met stap 1.4 en 1.5.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig grote stukken weefsel van de lens met een recht pincet met een fijne punt. Inspecteer de lens om het equatoriale gebied te vinden.</li>
	<li>Prik ondiep in de lens met een recht pincet met een fijne punt en verwijder vervolgens het lenskapsel. De massa lensvezelcellen blijft intact en de lensepitheliale monolaag blijft aan het lenskapsel vastzitten. Gooi het lenskapsel weg.</li>
</ol>2. Lens enkele vezelcel kleuring
<ol><li>Breng de celmassa van de lensvezel over naar een putplaat met 500 μL vers gemaakte 1% paraformaldehyde (PFA; in 1x PBS)-oplossing en incubeer de monsters een nacht bij 4 °C met zachte nootvorming (Figuur 2A). OPMERKING: De volumes voor de gegeven oplossingen zijn geoptimaliseerd voor platen met 48 putjes. Als er een andere maat putplaat of buizen worden gebruikt, pas dan de volumes van de oplossingen dienovereenkomstig aan. Fixatie-, blokkerings- en wasoplossingen (1x PTX, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) werden gemaakt met 10x PBS en dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een eindconcentratie van 1x PBS.</li>
	<li>Breng de lensvezelcellen over naar een schaal van 60 mm met 1% PFA. Gebruik een scherpe scalpel om de bal vezelcellen in tweeën te splijten langs de voorste-achterste as (Figuur 2B). Snijd de helften weer doormidden langs dezelfde as om kwarten te maken. OPMERKING: De voorste-achterste as is gemakkelijk te herkennen aan de richting van de vezelcellen in de weefselmassa.</li>
	<li>Gebruik een recht pincet om het kerngebied uit de kwartalen van de lensvezelcellen te verwijderen (Figuur 2C). OPMERKING: Het gebied van de lenskern is stijf in knaagdierlenzen en het midden van de lens zal gemakkelijk scheiden van de zachtere corticale vezels.</li>
	<li>Fixeer de kwartalen van het lenscortexgebied in 200 μL 1% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) met zacht schudden (300 tpm op een platenschudder).</li>
	<li>Was de weefselkwarten twee keer in 750 μL van 1x PBS gedurende 5 minuten elk met zacht schudden bij RT.</li>
	<li>Blokkeer de monsters met 200 μL blokkeringsoplossing (5% serum, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) gedurende 1 uur bij RT met zacht schudden. OPMERKING: Voor de representatieve gegevens in dit protocol waren de monsters niet gekleurd met primaire of secundaire antilichamen. Na de blokkeringsstap werden de monsters geïncubeerd met tarwekiemagglutinine (WGA; 1:100) en phalloidine (1:100) (zie materiaaltabel) gedurende 3 uur bij RT met zacht schudden en bescherming tegen licht. Primaire antilichaamkleuring is aangetoond in eerdere publicaties22,23.</li>
	<li>Incubeer met 100 μL primaire antilichaamoplossing gedurende een nacht bij 4 °C met zacht schudden. OPMERKING: De antilichamen worden verdund in een blokkerende oplossing. In vergelijking met objectglaasjes met weefselcoupes zijn er meer cellen in dit type preparaat. De primaire antilichaamconcentraties moeten worden verhoogd om voldoende antilichamen te leveren om meer cellen te kleuren. Het wordt aanbevolen om de antilichaamconcentratie te verdubbelen ten opzichte van wat op weefselsecties wordt gebruikt. Hetzelfde geldt voor secundaire antilichamen.</li>
	<li>Was de weefselkwarten drie keer met 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) gedurende 5 minuten elk bij RT met zacht schudden.</li>
	<li>Incubeer de vezelcellen met 100 μL secundaire antilichaam/kleurstofoplossing gedurende 3 uur bij RT met zacht schudden. Bescherm de monsters tijdens deze en volgende stappen tegen licht. OPMERKING: WGA, phalloidine en andere fluorescerende kleurstoffen kunnen worden toegevoegd aan de secundaire antilichaamoplossing voor gelijktijdige etikettering van het celmembraan, cytoskelet of andere organellen, terwijl ook het primaire antilichaam wordt geëtiketteerd.</li>
	<li>Was de vezelcellen vier keer met 1x PTX gedurende 5 minuten elk bij RT met zacht schudden.</li>
	<li>Voeg een druppel of 50 μL montagemedia toe aan een plus-geladen microscoopglaasje voordat u de weefselkwarten op het objectglaasje overbrengt.</li>
	<li>Gebruik een pincet om de vezelcellen voorzichtig van elkaar te scheiden en probeer overlapping van de celbundels te beperken.</li>
	<li>Breng voorzichtig een #1.5 dekglaasje aan op het monster in montagemedia. De bevestigingsmedia moeten zich uitstrekken tot aan de rand van het dekglaasje; Als dit niet gebeurt, voeg dan wat extra bevestigingsmedia toe aan de rand van het dekglaasje. Zuig overtollige montagemedia rond de rand van het dekglaasje weg en gebruik nagellak om de randen van het dekglaasje op het glaasje af te dichten. OPMERKING: Elk type montagemedium dat is geformuleerd voor confocale microscopie kan voor deze experimenten worden gebruikt.</li>
</ol>3. Kleuring van lenskern enkele vezelcellen
<ol><li>Voltooi de ontleding die in sectie 1 wordt beschreven.</li>
	<li>Verwijder mechanisch de corticale vezels van de bal van de lensvezelcellen, waarbij u de lenskern verlaat, door de vezelcelmassa voorzichtig over te brengen naar natte, gehandschoende vingertoppen en de weefselmassa voorzichtig te rollen. OPMERKING: Bij muizenlenzen is het rollen van de bal lensvezelcellen tussen gehandschoende vingertoppen een effectieve methode om de corticale vezelcellen uit de harde lenskernte verwijderen 28,30. Voor lenzen waarbij deze mechanische methode niet effectief is, kan zorgvuldige dissectie of een vortexmethode29 worden gebruikt om de corticale vezelcellen te verwijderen.</li>
	<li>Breng de lenskern over in vers gemaakte 1% PFA-oplossing in een putplaat en incubeer een nacht bij 4 °C met zacht schudden.</li>
	<li>Breng het monster over naar een schaal van 60 mm met 1% PFA en gebruik een scherpe scalpel om de lenskern langs de voorste-achterste as te splitsen. Halveer de weefselmonsters opnieuw om kernkwarten te produceren.</li>
	<li>Volg het proces dat wordt beschreven in de stappen 2.4-2.13 voor immunokleuring en monstermontage.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig02v2.jpg"> Figuur 2: Grafische samenvatting van de bereiding en immunokleuring van lensvezelcellen . (A) Deze plaat met 48 putjes is per kolom kleurgecodeerd om een monsterplaatopstelling voor de beschreven methoden te demonstreren, waardoor monsters gemakkelijk kunnen worden overgebracht tussen de verschillende immunokleuringsstappen door voorzichtige behandeling met een pincet. Hoewel de representatieve gegevens voor dit protocol niet zijn geïncubeerd met een primair antilichaam, bevat het diagram een kolom voor de incubatie van primaire antilichamen en kunnen de wasputten opnieuw worden gebruikt na verwijdering van gebruikte wasbuffers door aspiratie. (B) Na fixatie van de celmassa van de lensvezel wordt het weefsel gesplitst langs de voorste-achterste as (rode stippellijnen) om de oorspronkelijke structuur van de cellen te behouden. Nadat de weefselmassa is gehalveerd, worden de monsters geroteerd en worden de helften in vieren verdeeld langs de voorste-achterste as (rode stippellijnen). (C) Het verwijderen van het lenskerngebied (in roze) is eenvoudig te doen met een pincet om het dichte centrale weefsel uit de corticale vezelcellen (in blauw) te graven. Cartoondiagrammen zijn gedeeltelijk gemaakt met behulp van BioRender.com en niet op schaal getekend. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Immunofluorescentiekleuring van membraaninterdigitaties in lensvezelcellen

<ol><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+regulation+of+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factor regulation of lens development.</a> Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+morphology+of+embryonic+and+adult+chick+lens-fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells.</a> The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+epithelial+and+fiber+cells+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens.</a> International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).</li>
<li>Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+scanning+electron+microscopy+of+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).</li>
<li>Lo, W. K., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Square+arrays+and+their+role+in+ridge+formation+in+human+lens+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers.</a> Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).</li>
<li>Taylor, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+normal+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphology of the normal human lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).</li>
<li>Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+the+human+eye+lens-a+morphological+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+A%2C+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging of the human eye lens-a morphological point of view.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).</li>
<li>Vrensen, G. F., Duindam, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+fiber+membranes+in+the+human+eye+lens.+Ultrastructural+and+Raman+microspectroscopic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations.</a> Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rabbit.+A+scanning+electron+microscopic+reinvestigation%5BTitle%5D)+AND+%22Albrecht+von+Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Opthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation.</a> Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).</li>
<li>Zhou, C. J., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+clathrin%2C+AP-2+adaptor+and+actin+cytoskeleton+with+developing+interlocking+membrane+domains+of+lens+fibre+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells.</a> Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).</li>
<li>Kuwabara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maturation+of+the+lens+cell%3A+a+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The maturation of the lens cell: a morphologic study.</a> Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).</li>
<li>Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+gradient+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Stiffness gradient in the crystalline lens.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).</li>
<li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).</li>
<li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age%3A+the+basis+for+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).</li>
<li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+heat%3A+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein%2C+alpha-crystallin%2C+in+maintaining+lens+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li>
<li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometric%2C+optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li>
<li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).</li>
<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
<li>Lo, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+targets+interlocking+domains+to+control+the+integrity+and+transparency+of+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+3.5+protects+the+F-actin+networks+required+for+tissue+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties.</a> Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+lens+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The development of lens sutures.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).</li>
<li>Bassnett, S., Costello, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cause+and+consequence+of+fiber+cell+compaction+in+the+vertebrate+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens.</a> Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+interlocking+domains+may+contribute+to+formation+of+membranous+globules+and+lens+opacity+in+ephrin-A5%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice.</a> Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).</li>
<li>Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+specializations+emerging+late+in+mouse+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics%2C+morphology%2C+refractive+index+and+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+affects+development+of+the+eye+lens+nucleus+and+the+gradient+of+refractive+index%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2(2022).</li>
<li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens%3A+strain+and+morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53986(2016).</li>
<li>Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForrester%2C+JV+%22The+Eye+%28Fourth+Edition%29%22">The Eye (Fourth Edition)</a>. Saunders, W. B. , 1(2016).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling for scanning electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li>
<li>Goldberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+of+the+nuclear+lamina+and+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).</li>
<li>Hermann, R., Walther, P., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+in+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling in scanning electron microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol heeft de fixatie-, conserverings- en immunokleuringsmethoden gedemonstreerd die de 3D-membraanmorfologie van bundels of enkelvoudige lensvezelcellen van verschillende diepten in de lens getrouw behouden. De gekleurde lensvezels worden vergeleken met SEM-preparaten die al lang worden gebruikt om de morfologie van lensvezelcellen te bestuderen. De resultaten laten vergelijkbare membraanstructuren zien tussen beide preparaten. EM blijft de gouden standaard voor het bestuderen van celmorfologie, maar immunolabel...

De lens is een helder en eivormig weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee celtypen, epitheel- en vezelcellen 1 (Figuur 1). Er is een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekt. Vezelcellen worden onderscheiden van epitheelcellen en vormen het grootste deel van de lens. De zeer gespecialiseerde vezelcellen ondergaan een verlenging, differentiatie en rijpingsprogrammering, gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de morfologie van het celmembraan van de lensperiferie naar het lenscentrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , ook wel bekend als de lenskern. De functie van de lens om licht dat van verschillende afstanden op het netvlies komt fijn te focussen, hangt af van de biomechanische eigenschappen ervan, waaronder stijfheid en elasticiteit 13,14,15,16,17,18,19. De complexe interdigitaties van lensvezels zijn verondersteld20,21 en onlangs is aangetoond dat ze belangrijk zijn voor lensstijfheid22,23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg"> Figuur 1: Lensanatomiediagrammen en representatieve scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beelden van lensvezels. De cartoon toont een longitudinaal (van voren naar achteren van boven naar beneden) weergave van de voorste monolaag van epitheelcellen (lichtblauw gearceerd) en een bulkmassa lensvezelcellen (wit). Het midden van de lens (roze gearceerd) staat bekend als de kern en bestaat uit sterk verdichte vezelcellen. Aan de rechterkant onthult een cartoon met dwarsdoorsnede de langwerpige zeshoekige celvorm van lensvezels die in een honingraatpatroon zijn verpakt. Vezelcellen hebben twee brede zijden en vier korte zijden. Representatieve SEM-beelden langs de onderkant tonen de complexe membraaninterdigitaties tussen lensvezelcellen op verschillende diepten van de lens. Van rechts hebben nieuw gevormde lensvezels aan de rand van de lens kleine uitsteeksels langs de korte zijden en kogels langs de brede kant (rode vakken). Tijdens de rijping ontwikkelen lensvezels grote peddeldomeinen die worden versierd met kleine uitsteeksels langs de korte zijden (blauwe vakken). Rijpe vezelcellen bezitten grote peddeldomeinen die worden geïllustreerd door kleine uitsteeksels. Deze in elkaar grijpende domeinen zijn belangrijk voor de biomechanische eigenschappen van lenzen. Vezelcellen in de lenskern hebben minder kleine uitsteeksels langs hun korte zijden en hebben complexe tand-en-groef-interdigitaties (paarse vakken). De brede zijden van de cel vertonen een bolvormige membraanmorfologie. De cartoon is aangepast van22,32 en niet op schaal getekend. Schaalbalk = 3 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De lens groeit door schelpen van nieuwe vezelcellen toe te voegen die bovenop eerdere generaties vezels zijn gelegd24,25. Vezelcellen hebben een langwerpige, zeshoekige dwarsdoorsnedevorm met twee brede zijden en vier korte zijden. Deze cellen strekken zich uit van de voorste tot de achterste pool van de lens en afhankelijk van de soort kunnen de lensvezels enkele millimeters lang zijn. Om de structuur van deze langwerpige en dunne cellen te ondersteunen, creëren gespecialiseerde interdigitaties langs de brede en korte zijden in elkaar grijpende structuren om de vorm van de lens en de biomechanische eigenschappen te behouden. Veranderingen in de vorm van het celmembraan tijdens de differentiatie en rijping van vezelcellen zijn uitgebreid gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM) studies 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nieuw gevormde vezelcellen hebben ballen-en-sockets langs hun brede zijden met zeer kleine uitsteeksels langs hun korte zijden, terwijl volwassen vezels in elkaar grijpende uitsteeksels en peddels langs hun korte zijden hebben. Kernvezels vertonen tand-en-groef-interdigitaties en bolvormige membraanmorfologie. Er is weinig bekend over de eiwitten die nodig zijn voor deze complexe in elkaar grijpende membranen. Eerdere studies naar eiwitlokalisatie in vezelcellen waren gebaseerd op lensweefselsecties, die geen duidelijke visualisatie van de complexe celarchitectuur mogelijk maken.
Dit werk heeft een nieuwe methode gecreëerd en geperfectioneerd om enkele en bundels lensvezelcellen te fixeren om de complexe morfologie te behouden en om immunokleuring voor eiwitten op het celmembraan en in het cytoplasma mogelijk te maken. Deze methode behoudt getrouw de celmembraanarchitectuur, vergelijkbaar met gegevens uit EM-studies, en maakt kleuring mogelijk met primaire antilichamen voor specifieke eiwitten. We hebben eerder immunogekleurde corticale lensvezels die differentiatie en rijping ondergaan22,23. In dit protocol is er ook een nieuwe methode om vezelcellen uit de lenskern te kleuren. Dit protocol opent de deur naar het begrijpen van de mechanismen voor vorming en veranderingen in membraaninterdigitaties tijdens de rijping van vezelcellen en de verdichting van de lenskern.

<table><tbody><tr><td>100% Triton X-100</td><td>FisherScientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>60mm plate</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10X fosfaat gebufferd zoutoplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1X fosfaat gebufferd zoutoplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (22 x 40 mm)</td><td>FisherScientific</td><td>12-553-467</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereo Discovery V8</td><td></td></tr><tr><td>Pincet met fijne punt</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72707-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglazen</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 confocale microscoop met Airyscan (63X) en Zen 3.5 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagellak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normaal ezelsserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (rhodamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Primair antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Feather Wegwerp, steriel, Nr. 11</td><td>VWR</td><td>76241-186</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rechte pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Nunc MicroWell MiniTrays (dissectielade)</td><td>FisherScientific</td><td>12-565-154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafijne schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wei-kiem agglutinine (fluoresceine)</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1021-5</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

De lens is een transparant en ellipsoïde orgaan in de voorste oogkamer dat van vorm verandert om het licht fijn op het netvlies te richten om een helder beeld te vormen. Het grootste deel van dit weefsel bestaat uit gespecialiseerde, gedifferentieerde vezelcellen die een zeshoekige doorsnede hebben en zich uitstrekken van de voorste tot de achterste polen van de lens. Deze lange en dunne cellen staan sterk tegenover naburige cellen en hebben complexe interdigitaties over de lengte van de cel. De gespecialiseerde in elkaar grijpende structuren zijn vereist voor normale biomechanische eigenschappen van de lens en zijn uitgebreid beschreven met behulp van elektronenmicroscopietechnieken. Dit protocol demonstreert de eerste methode om enkelvoud en bundels van muizenlensvezelcellen te behouden en te immunokleuren om de gedetailleerde lokalisatie van eiwitten in deze complex gevormde cellen mogelijk te maken. De representatieve gegevens tonen kleuring van de perifere, differentiërende, rijpe en nucleaire vezelcellen in alle regio's van de lens. Deze methode kan mogelijk worden gebruikt op vezelcellen die zijn geïsoleerd uit lenzen van andere soorten.

Lensvezelcellen worden bereid uit de lenscortex (differentiërende vezels en rijpe vezels) en de kern, en de cellen worden gekleurd met falloïdine voor F-actine en WGA voor het celmembraan. Een mengsel van bundels cellen of enkelvoudige lensvezels (Figuur 3) wordt waargenomen en in beeld gebracht. Vanuit de lenscortex worden twee soorten cellen gevonden (Figuur 3A). Differentiërende vezelcellen in de periferie van de lens zijn recht, met zeer kleine uitsteeksels ...

Dit protocol beschrijft methoden om perifere, volwassen en nucleaire ooglensvezelcellen voor te bereiden op immunofluorescentiekleuring om complexe cel-tot-cel-interdigitaties en de membraanarchitectuur te bestuderen.

Voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

De lens is een transparant ellipsoïde orgaan in de voorste oogkamer en is verantwoordelijk voor een fijne focus van licht op het netvlies om een helder beeld te creëren. De functie van de lens is afhankelijk van zijn biomechanische eigenschappen, complexe interdigitaties tussen de lensvezelcellen zijn onlangs belangrijk gebleken voor de stijfheid van de lens. Hoewel de gespecialiseerde morfologie van lensvezelcellen eerder is beschreven door elektronenmicroscopie, is er weinig bekend over de eiwitten die nodig zijn voor deze in elkaar grijpende membranen.Eerdere studies waren gebaseerd op lensweefselsecties, die geen duidelijke visualisatie van complexe celarchitectuur mogelijk maken. We hebben een nieuwe techniek ontwikkeld en geperfectioneerd om de complexe membraaninterdigitaties tussen lensvezelcellen getrouw te bewaren voor kleuring en confocale microscopiebeeldvorming van specifieke eiwitten. In dit protocol is er ook een nieuwe methode om de vezelcellen vanuit het midden van de lens te kleuren, ook wel de lenskern genoemd.Deze methode opent de deur naar het begrijpen van de differentiatie en rijping van vezelcellen door de mechanismen van vorming en veranderingen in membraaninterdigitaties te bestuderen.

preparation-immunofluorescence-staining-bundles-single-fiber-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Technieken voor het visualiseren retinale cytoarchitecture direct aan individuele elektroden binnen een retinale stimulator.

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Deze protocollen werden ontwikkeld om de corticale lens morfologie, structurele integriteit van de zebravis lens hechtingen in vaste en live lenzen te analyseren en om de positie van de zebravis lens Nucleus te meten langs de voorste-posterior as.

Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.

Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor het verkrijgen van hoogwaardige cryosecties van hele konijnenogen. Het beschrijft procedures voor dissectie, fixatie, inbedding en secties van konijnenogen, die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor gebruik in elk onderzoek waarbij immunohistochemie in grotere ogen wordt gebruikt.

Het verkrijgen van cryosecties van het hele konijnenoog van hoge kwaliteit 

Deze methode visualiseert de natuurlijke structuur van collageenvezels in het glasvocht met behulp van confocale reflectiemicroscopie.

Varkensogen voorbereiden op confocale reflectiemicroscopie om het glasvochtvezelnetwerk van collageen te visualiseren

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Leer immunofluorescentiekleuring van ooglensvezelcellen om membraanarchitectuur en celinterdigitaties te bestuderen. Deze methode behoudt complexe structuren voor confocale microscopie en eiwitanalyse.

Voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens

Meer video's verkennen