Name: Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer hoe je hoge-resolutie-respirometrie gebruikt om mitochondriale functie te analyseren in PINK1 B9-null mutanten van Drosophila melanogaster. Deze methode helpt onderzoekers bio-energetica te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen het Braziliaanse agentschap Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). PM (#88887.512821/2020-00) en TD (#88887.512883/2020-00) zijn ontvangers van onderzoeksbeurzen.

We gebruikten de stammen w1118 (wit) en w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (aangeduid als Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) van het Bloomington Drosophila stock center (ID-nummer: 34749). In deze studie worden mannelijke D. melanogaster PINK1B9-null mutanten vergeleken met mannelijke D. melanogaster uit de w1118 stam, die als controlegroep wordt gebruikt (genetische achtergrond). Andere parameters moeten gelijktijdig met de respirometrie-experimenten worden geanalyseerd om ervoor te zorgen dat de vliegen het juiste genotype hebben (Pink1B9/Y), zoals thoraxmisvormingen en voortbewegingsproblemen, die goed zijn beschreven voor pink1B9 mutante vliegen 24,25,26.
1. Dieren en huisvesting
<ol><li>Bewaar de vliegen in glazen flessen met 10 ml standaardvoeding (gist 1,73%, sojameel 0,9%, maïsmeel 7,3%, agar 0,5%, glucosestroop 7,6% en propionzuur 0,48%) bij constante temperatuur en vochtigheid (respectievelijk 25 °C en 60%), met een licht/donkercyclus van 12 uur:12 uur.</li>
	<li>Gebruik voor elk experiment twee vliegen van 1-3 dagen na de eclosie. OPMERKING: De PINK1B9-null mutante maagdelijke vrouwtjes werden gekruist met w1118 mannetjes om de F1 mannetjes met genotype Pink1B9/Y te verkrijgen.</li>
</ol>2. Voorbereiding van het monster
<ol><li>Bereid de MiR05-buffer voor zoals beschreven in tabel 1.</li>
	<li>Verdoof de vliegen op ijs en breng ze over in microcentrifugebuisjes (twee vliegen per buisje).</li>
	<li>Voeg in elk buisje 200 μL gekoelde MiR05-buffer toe en homogeniseer de vliegen. Homogeniseer handmatig en oefen lichte druk uit (ongeveer 4-6 slagen van de stamper) om het uiteenvallen van mitochondriën te voorkomen.</li>
</ol>3. Respirometriekalibratie met hoge resolutie van polarografische zuurstofsensoren
OPMERKING: De OROBOROS-kamers hebben een totaal volume van ongeveer 2 ml. Kalibratie is vereist om ervoor te zorgen dat de zuurstofflux dicht bij 0 pmol ligt om de test te starten.
<ol><li>Start de kalibratie en voeg 2 ml MiR05 toe aan de kamer. Bedek de kamer met de stop en laat geen luchtbellen achter; Trek vervolgens voorzichtig aan de stop om één enkele luchtbel te vormen.</li>
	<li>Open de OROBOROS Dat.Lab-software. Voer een temperatuur van 25 °C in het veld Bloktemperatuur in en klik op Verbinden met Oxygraph-2k (Figuur 1A).</li>
	<li>Klik en selecteer de map waarin de kalibratie moet worden opgeslagen en klik op Opslaan.</li>
	<li>Wanneer een nieuw venster wordt geopend, geeft u het experiment en de monsters een naam (als u kalibreert, voert u gewoon de naam kalibratie in) en klikt u op Opslaan.</li>
	<li>Ga naar het menu Layout en kies de eerste optie: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp zoals weergegeven in Figuur 1B.</li>
	<li>Wacht tot het programma doorverwijst naar de kalibratielay-out, wacht tot de rode lijn een standaard rechte lijn toont met punten rond 0 pmol. Selecteer vervolgens twee punten: één voor kamer A en de andere voor kamer B (Figuur 1C) wanneer de rode lijn precies op nul staat. OPMERKING: De geselecteerde punten moeten een zuurstofflux (rode lijn) rond 0 hebben.<ol><li>Om de punten van beide kamers te markeren, selecteert u de concentratie O2 aan de rechterkant van het scherm, selecteert u het gemarkeerde punt en kopieert u zowel de temperatuur - als de luchtdrukwaarden ten opzichte van het punt. Plak deze waarden in de onderstaande vakken en klik op Kalibreren en Kopiëren naar klembord in de rechterbenedenhoek van het scherm, zoals weergegeven in afbeelding 2.</li>
		<li>Voer dit proces uit voor beide kamers (A en B), ga vervolgens naar het menu Bestand en selecteer Opslaan en loskoppelen. NOTITIE: Na het kalibratieproces zal het programma de gebruiker omleiden naar het startscherm, zodat de software klaar is om de HRR-test te starten. Voor deze test gebruiken we het SUIT-protocol.</li>
	</ol></li>
</ol>4. SUIT-protocol
<ol><li>Als de kalibratie is voltooid, verwijdert u de stoppers en opent u de kamers.</li>
	<li>Was de stoppen (houd de punt vast die het monster niet raakt) en kamers met 100% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water, in die volgorde. OPMERKING: Herhaal het proces voor elke monsterwissel.</li>
	<li>Homogeniseer de vliegen in een buffer van 200 μL, plaats alle monsterinhoud in de kamer met behulp van een micropipet en plaats de stop in de kamer, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. NOTITIE: Als er luchtbellen ontstaan, verwijder dan voorzichtig de stop en voeg 100 μL MIR05-buffer toe.</li>
	<li>Klik op het menu Lay-out en selecteer de optie 05 Flow by Corrected Volume zoals weergegeven in figuur 1B.</li>
	<li>Wacht tot u wordt doorgestuurd naar een nieuw venster. Klik op Opslaan om de map te selecteren waarin het experiment moet worden opgeslagen.</li>
	<li>Wacht tot er weer een nieuw venster wordt geopend. Geef het experiment in de ruimte de naam Experimentele code. Geef vervolgens elk monster in de respectievelijke kamer A en B een naam in het veld Monster en stel het veld Eenheid in op eenheid. OPMERKING: Er kunnen ook andere eenheden worden gekozen, bijvoorbeeld Miljoenen cellen of mg.</li>
	<li>Gezien het feit dat dit protocol twee vliegen (2 eenheden) gebruikt en het kamervolume 2 ml is, definieert u in het veld Concentratie 1 per ml (Figuur 1D). OPMERKING: Hier werd de hoeveelheid monster genormaliseerd door het aantal vliegen; deze normalisatie kan echter worden uitgevoerd door het eiwitgehalte van het monster, mitochondriale DNA-kwantificering of activiteit van citraatsynthase.</li>
	<li>Wanneer het zuurstoffluxsignaal (rode lijn) stabiel is op de positieve waarde, start u het HRR-protocol met de titratie van substraten, remmers en ontkoppelaars (Figuur 3). Alle volgende reagentia en apparatuur zijn weergegeven in tabel 1.<ol><li>Voeg digitonine (5 μg/ml) toe om het mitochondriale membraan te permeabiliseren.</li>
		<li>Voeg pyruvaatsubstraten (5 mM), malaat (2 mM) en proline (10 mM) toe en wacht tot de zuurstofflux toeneemt en stabiliseert. Om de gebeurtenis voor elke toevoeging van een reagens te markeren, drukt u op de F4-toets op het toetsenbord en voert u de naam van elk reagens in.</li>
		<li>Voeg ADP (5mM) toe om de mitochondriale ademhalingsketen te koppelen en wacht op de toename en stabilisatie van de zuurstofflux.</li>
		<li>Voeg succinaat (10 mM) toe en wacht op de toename en stabilisatie van de zuurstofstroom.</li>
		<li>Voeg oligomycine (2,5 μM) toe om ATP-synthase te remmen en zoek naar een afname van de zuurstofflux.</li>
		<li>Wacht tot de rode lijn stabiliseert en ontkoppel de mitochondriale elektronenoverdracht met behulp van carbonyl-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazonecyanide (FCCP) met titers van 0,25 μM totdat het maximale zuurstofverbruik is bereikt, aangetoond door de stijging van de rode lijn. Na stabilisatie van de zuurstofflux, begint u de remmers van elk complex één voor één toe te voegen.</li>
		<li>Voeg Rotenon (0,5 μM) toe, een complex I-remmer. Wacht op de afname en stabilisatie van de zuurstofflux om de volgende remmer toe te voegen.</li>
		<li>Voeg Malonaat (5 mM) toe, een complex II-remmer. Wacht op de afname en stabilisatie van de zuurstofflux om de volgende remmer toe te voegen.</li>
		<li>Voeg ten slotte Antimycine (2,5 μM) toe, een complexe III-remmer. Wacht op de afname gevolgd door de toename en stabilisatie van de zuurstofflux. OPMERKING: De zuurstofflux moet stabiliseren op een positieve waarde, maar onder de waarde voor de laatste remming van mitochondriale eiwitcomplexen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder aan het einde van de analyse alle inhoud van de kamers met behulp van een micropipet. Bewaren bij -20 °C voor toekomstige analyse, indien nodig.</li>
</ol>5. Data-analyse
<ol><li>Gebruik een geschikt statistisch softwarepakket voor data-analyse.</li>
	<li>Voer t-toetsen uit om de verschillen tussen de twee groepen te beoordelen. Gebruik voor situaties met meerdere behandelingen variantieanalyse (ANOVA) als statistische test 27.</li>
	<li>Haal de O2 fluxwaarden uit de grafiek die door de software wordt gegenereerd. OXPHOS CI verwijst naar de waarde van deO2-flux na toevoeging van ADP. OXPHOS CII wordt verkregen door OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI af te trekken. OXPHOS CI&CII is de waarde van deO2-flux die wordt geëxtraheerd na toevoeging van succinaat. ETS CI&CII is de O2 fluxwaarde na toevoeging van FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenon en ETS CII = Rotenon - Malonaat.</li>
	<li>Bereken de ATP-synthese als het verschil tussen de OXPHOS (P) en LEAK (L) (P - L)28.</li>
	<li>Bepaal de Respiratory Control Ratio (RCR) door de verhouding OXPHOS/LEAK te berekenen, waarbij RCR = P/L.11</li>
</ol>

Analyse van mitochondriale fysiologie en bio-energetica bij fruitvliegen

<ol><li>Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+mitochondrial+function+and+cellular+bioenergetics+in+ageing+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease.</a> Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).</li>
<li>Ramaccini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+dysfunction+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 624216(2021).</li>
<li>Zhunina, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+vascular+disease%2C+tumorigenesis%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes.</a> Front Mol Biosci. 8, 671908(2021).</li>
<li>Prasun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838(2020).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+Step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Perier, C., Vila, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology and Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332(2012).</li>
<li>DeMaagd, G., Philip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and its management.</a> Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+and+Parkin-independent+mitophagy+is+involved+in+reprogramming+of+glycometabolism+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).</li>
<li>Kopin, I. J., Markey, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP+toxicity%3A+implications+for+research+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).</li>
<li>Connolly, N. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+experimental+methods+to+assess+mitochondrial+dysfunction+in+cellular+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases.</a> Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+responding+to+mitochondrial+dysfunction%3A+The+UPRmt+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond.</a> Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).</li>
<li>Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+mouse+heart+tissues+using+oroboros+2k-oxygraph%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph.</a> Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).</li>
<li>Scheiber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+in+human+endomyocardial+biopsies+shows+reduced+ventricular+oxidative+capacity+related+to+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure.</a> Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).</li>
<li>Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+nine+-+use+of+safranin+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+potential+by+high-resolution+respirometry+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry.</a> Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).</li>
<li>Demir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+use+of+Drosophila+as+an+in+vivo+model+organism+for+COVID-19-related+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review.</a> Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+a+tool+to+identify+pharmacological+therapies+for+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Technol+Technologies%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome.</a> Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bar, S., Prasad, M., Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+degeneration+and+locomotor+deficit+in+a+Drosophila+model+of+mucopolysaccharidosis+VII+is+attenuated+by+treatment+with+resveratrol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol).</a> Dis Model Mech. 11 (11), (2018).</li>
<li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-Parkin+signaling+in+Parkinson%27s+disease%3A+Lessons+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila.</a> Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).</li>
<li>Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+PINK1+and+parkin+loss-of-function+mutants+display+a+range+of+non-motor+Parkinson%27s+disease+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes.</a> Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Bagchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+structural+dynamics+of+the+mutations+in+the+kinase+domain+of+PINK1+protein+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease.</a> Gene. 857, 147183(2023).</li>
<li>Koh, H., Chung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+and+Parkin+to+control+mitochondria+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling.</a> Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).</li>
<li>Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mask+loss-of-function+rescues+mitochondrial+impairment+and+muscle+degeneration+of+Drosophila+pink1+and+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants.</a> Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics%3A+a+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics: a biologist's guide</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+improves+mitochondrial+function+in+PINK1B9-null+mutant+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster.</a> J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+cellular+energy+maintenance+during+aging+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease.</a> Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).</li>
<li>Janowska, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complex+I+dysfunction+induced+by+N-methyl+carbamate+ex+vivo+can+be+alleviated+with+a+cell-permeable+succinate+prodrug%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug.</a> Toxicol In Vitro. 65, 104794(2020).</li>
<li>Ngo, D. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+modifications+of+mitochondrial+complex+II+are+associated+with+insulin+resistance+of+visceral+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity.</a> Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).</li>
<li>Stroud, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+subunits+are+integral+for+assembly+and+function+of+human+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I.</a> Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).</li>
<li>Senyilmaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+and+function+by+stearoylation+of+TFR1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1.</a> Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).</li>
<li>Poddighe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucuna+pruriens+%28Velvet+bean%29+rescues+motor%2C+olfactory%2C+mitochondrial+and+synaptic+impairment+in+PINK1B9+Drosophila+melanogaster+genetic+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease.</a> PloS One. 9 (10), e110802(2014).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Winer, L. S. P., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PloS One. 9 (10), e109916(2014).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Bingol, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%3A+PINK1%2C+Parkin%2C+USP30+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond.</a> Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

HRR is een krachtige techniek voor het bestuderen van mitochondriale ademhaling en energiemetabolisme in D. melanogaster en andere organismen. Het biedt een gedetailleerde en kwantitatieve beoordeling van de mitochondriale functie, waardoor onderzoekers inzicht kunnen krijgen in de bio-energetica van de cellen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de evaluatie van de functie van de mitochondriale ademhalingsketen en de activiteit van specifieke mitochondriale complexen met behulp van het SUIT-protocol bij...

Mitochondriën zijn cellulaire organellen die belangrijke functies regelen, waaronder apoptotische regulatie, calciumhomeostase en deelname aan biosynthetische routes. Door autonoom genetisch materiaal te bezitten, zijn ze in staat om bij te dragen aan cellulaire onderhouds- en herstelprocessen. Hun structuur herbergt de elektronentransportketen en oxidatieve fosforylering, beide cruciaal voor cellulaire energie 1,2,3. Energiebeheersing wordt met name bereikt door de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2. Verstoring van het energiemetabolisme met aantasting van mitochondriale functies treedt zowel op bij celoverleving als bij celdood 4,5, vaak geassocieerd met een breed scala aan menselijke pathologieën, zoals kanker, en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)3,6.
PD is een chronische, progressieve en neurologische aandoening. De primaire oorzaak van deze ziekte is het afsterven van hersencellen, vooral in de substantia nigra, die verantwoordelijk zijn voor de productie van de neurotransmitter dopamine, die beweging regelt 6,7,8. De vroegste waarneming die parkinsonisme in verband bracht met mitochondriale disfunctie werd gedaan in 1988, in experimentele modellen met toxines die de ademhalingsketen remmen Complex I9.
Momenteel zijn er verschillende methoden om mitochondriale disfunctie te evalueren 10,11,12,1 3; in vergelijking met conventionele benaderingen biedt respirometrie met hoge resolutie (HRR) echter een superieure gevoeligheid en voordelen 13,14. HRR-protocollen maken bijvoorbeeld de evaluatie mogelijk van de hele mitochondriale ademhalingsketenfunctie of de activiteit van specifieke mitochondriale complexen14,15. Mitochondriale disfuncties kunnen worden beoordeeld in intacte cellen, geïsoleerde mitochondriën of zelfs ex vivo 10,11,13,14.
Mitochondriale disfuncties zijn nauw verbonden met veel pathologische en fysiologische processen. Het is daarom belangrijk om mitochondriale fysiologie en bio-energetica te bestuderen met behulp van genetisch en experimenteel handelbare modelsystemen. In dit opzicht heeft onderzoek naar Drosophila melanogaster, de fruitvlieg, verschillende voordelen. Dit model deelt fundamentele cellulaire kenmerken en processen met mensen, waaronder het gebruik van DNA als genetisch materiaal, gemeenschappelijke organellen en geconserveerde moleculaire routes die betrokken zijn bij ontwikkeling, immuniteit en celsignalering. Bovendien hebben fruitvliegjes een snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud, lage kosten, hoge doorvoer en minder ethische bezwaren, waardoor ze een hulpmiddel van onschatbare waarde vormen voor het ontleden van complexe cellulaire processen 16,17,18,19,20.
Bovendien wordt een homoloog van het PTEN-geïnduceerde vermeende kinase 1 (pink1)-gen tot expressie gebracht in D. melanogaster. Het speelt een cruciale rol bij het verwijderen van beschadigde mitochondriën door het proces van mitofagie8. Bij mensen maken mutaties in dit gen individuen vatbaar voor een autosomaal recessieve familiale vorm van PD geassocieerd met mitochondriale disfunctie 8,21,22,23. Bijgevolg is de fruitvlieg een krachtig diermodel voor studies naar de pathofysiologie van PD en screening van kandidaat-geneesmiddelen met de nadruk op mitochondriale disfunctie en bio-energetica. Daarom legt het huidige werk uit hoe de mitochondriale functie kan worden geanalyseerd in een model van PD van D. melanogaster met behulp van de HRR-techniek in de OROBOROS met het Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-protocol.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>Adenosine 5’-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecuulgewicht = 501,31 g/mol.</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Kasv</td><td>K25-1800</td><td>Voor bacteriologisch gebruik</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A van Streptomyces sp. (CAS-nummer 1397-94-0); molecuulgewicht 540 g/mol;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Bovine Serum Albumine (CAS-nummer 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%</td></tr><tr><td>Datlab software</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk</td><td>20700</td><td>Software voor dataverzameling en -analyse</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 5628</td><td>CAS-nummer 11024-24-1</td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogasterstrain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3</td><td></td><td></td><td>Verkregen van Bloomington Drosophila stock center</td></tr><tr><td>Drosophila melanogasterstrain w1118</td><td></td><td></td><td>Verkregen van de Federale Universiteit van Santa Maria</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td>Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraazijnzuur (CAS-nummer 13638-13-3); ≥97%; molecuulgewicht =468,28 g/mol</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Carbonylcyanide 4- (trifluormethoxy)fenylhydrazon (CAS-nummer 370-86-5); ≥98% (TLC), poeder</td></tr><tr><td>GraphPad Prism versie 8.0.1.</td><td></td><td></td><td>Software voor dataverzameling en -analyse</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur (CAS-nummer 7365-45-9); ≥99,5% (titratie), getest voor celcultuur; molecuulgewicht = 238,30 g/mol</td></tr><tr><td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K respirometer kit</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td>Monokaliumfosfaat (CAS-nummer 7778-77-0); Reagent Plus, molecuulgewicht = 136,09 g/mol</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211473</td><td>Kaliumhydroxide (CAS-nummer 1310-58-3); ACS-reagens, ≥85%, pellets</td></tr><tr><td>Malaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonzuur (CAS-nummer 141-82-2); 99%, molecuulgewicht = 104,06 g/mol). Een oplossing is pH geajusteerd naar ongeveer 7,0.</td></tr><tr><td>Appelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>(S)-(-)-2-Hydroxysuccinezuur (CAS-nummer 97-67-6); ≥95% ; molecuulgewicht = 134,09 g/mol</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>2-(N-Morpholino)ethaansulfonzuur (CAS-nummer 4432-31-9); ≥99% (titratie); molecuulgewicht = 195,24 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Magnesiumchloride (CAS-nummer 7786-30-3); watervrij, ≥98%, molecuulgewicht = 95,21 g/mol</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2K-Titratiesetopstelling</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk</td><td>20820-03</td><td>Hamiltonspuiten met verschillende volumes</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O 4876</td><td>Oligomycine van Streptomyces diastatochromogenes (CAS-nummer 1404-19-9); ≥90% totale oligomycines op HPLC-basis</td></tr><tr><td>Stempel voor homogenisatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>L-Proline (CAS-nummer 147-85-3); poeder; 99%; molecuulgewicht = 115,13 g/mol</td></tr><tr><td>Pyrowijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Natriumpyrovaat (CAS-nummer 113-24-6), ≥99%; molecuulgewicht = 110,04 g/mol</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Rotenon (CAS-nummer 83-79-4); ≥95%, molecuulgewicht 394,42 g/mol</td></tr><tr><td>Bernsteenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 2378</td><td>Natriumsuccinaat dibasisch hexahydraat (CAS-nummer 6106-21-4); ≥99%</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>107,651,000</td><td>Sucrose voor microbiologische toepassingen (CAS-nummer 57-50-1)</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>CAS-nummer 107-35-7</td></tr></tbody></table>

analyse van de mitochondriale functie in een drosophila melanogaster pink1 b9-null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), en cellulaire stoornissen zoals kanker zijn enkele van de aandoeningen die het energiemetabolisme verstoren met verslechtering van de mitochondriale functies. Mitochondriën zijn organellen die zowel het energiemetabolisme als de cellulaire processen regelen die betrokken zijn bij de overleving en dood van cellen. Om deze reden kunnen benaderingen om de mitochondriale functie te evalueren belangrijke inzichten bieden in cellulaire omstandigheden in pathologische en fysiologische processen. In dit opzicht maken protocollen voor respirometrie met hoge resolutie (HRR) evaluatie mogelijk van de gehele functie van de mitochondriale ademhalingsketen of de activiteit van specifieke mitochondriale complexen. Bovendien vereist het bestuderen van mitochondriale fysiologie en bio-energetica genetisch en experimenteel handelbare modellen zoals Drosophila melanogaster.
Dit model biedt verschillende voordelen, zoals de gelijkenis met de menselijke fysiologie, de snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud, kosteneffectiviteit, hoge doorvoermogelijkheden en een minimaal aantal ethische bezwaren. Deze eigenschappen maken het samen tot een hulpmiddel van onschatbare waarde voor het ontleden van complexe cellulaire processen. Het huidige werk legt uit hoe de mitochondriale functie kan worden geanalyseerd met behulp van de Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutant. Het pink1-gen is verantwoordelijk voor het coderen voor PTEN-geïnduceerd vermeend kinase 1, via een proces dat wordt erkend als mitofagie, wat cruciaal is voor de verwijdering van disfunctionele mitochondriën uit het mitochondriale netwerk. Mutaties in dit gen werden in verband gebracht met een autosomaal recessieve familiale vorm van PD met vroege aanvang. Dit model kan worden gebruikt om mitochondriale disfunctie te bestuderen die betrokken is bij de pathofysiologie van PD.

Hier zien we dat de O2-flux in OXPHOS CI (P = 0,0341) en OXPHOS CI & II (P = 0,0392) in PINK1B9 nulvliegen wordt verminderd in vergelijking met controlevliegen (Figuur 4). Dit resultaat werd ook waargenomen in eerdere bevindingen van onze groep 29,30.
CI en CII zijn belangrijke componenten van het elektronentransportsysteem (ETS), waarbij CI verantwoordelijk ...

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Ons onderzoek gebruikt Drosophila melanogaster als een experimenteel model om de mitochondriale functie bij ziekte en chemische toxiciteit te begrijpen. Enkele vragen die we willen beantwoorden zijn: hoe beïnvloedt de PINK-1-mutatie de mitochondriale functie en hoe is dit gekoppeld aan de ziekte van Parkinson? Hoe kunnen we de mitochondriale disfunctie die met deze mutatie gepaard gaat, terugdraaien of afwenden?Respirometrie met hoge resolutie vereist gespecialiseerde training voor nauwkeurige bediening en gegevensanalyse. Bovendien staat het systeem dat we hebben gebruikt het niet toe om met meerdere monsters tegelijk te werken en is het niet opgeleid voor high-throughput analyse. Omdat het slechts mogelijk is om twee monsters tegelijk uit te voeren, moet het experimentele ontwerp goed worden afgebakend.Onze bevindingen duiden op een progressieve verslechtering van de mitochondriale functie waarmee we worden geconfronteerd in PINK1-Null-mutanten, die wordt gekenmerkt door een afname van de OXPHOS CI-link en ETS CI & CII-link, en een metabole metabole verschuiving in ATP-productie van oxidatief naar glycolytisch in routes. Deze bevindingen zijn nauw verwant aan de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson. Een van de belangrijkste punten van respirometrie met hoge resolutie is het vermogen om directe en nauwkeurige metingen van het zuurstofverbruik te leveren, waardoor een gedetailleerde analyse van de mitochondriale functie en het cellulaire metabolisme mogelijk is.Het is ook veelzijdig. Het kan worden gebruikt voor een breed scala aan soorten monsters, waaronder geïsoleerde mitochondriën. Gezien het feit dat mitochondriale disfunctie een gemeenschappelijk kenmerk is van neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Parkinson, zullen we ons in de toekomst richten op het onderzoeken hoe mitochondriale functie en energieverhoging belangrijke doelen kunnen zijn voor therapieën gericht op neurodegeneratieve ziekten.

analyzing-mitochondrial-function-drosophila-melanogaster-pink1b9-null

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Mitochondria spelen een centrale rol in de regulatie van metabolisme en homeostase. Subtiele veranderingen in mitochondriaal metabolisme die de fysiologie van organismen beïnvloeden, kunnen moeilijk te detecteren zijn in metabolomics-studies van hele organismen. Hier beschrijven we een isolatiemethode die de detectie van subtiele metabolische verschuivingen in Drosophila melanogaster verbetert.

Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em&gt; Drosophila</em

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

We presenteren een protocol voor een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa in Drosophila weefsel homogenates.

Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster.  Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Leer hoe je hoge-resolutie-respirometrie gebruikt om mitochondriale functie te analyseren in PINK1 B9-null mutanten van Drosophila melanogaster. Deze methode helpt onderzoekers bio-energetica te begrijpen.

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie (Video) | JoVE Journal

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Meer video's verkennen