Name: Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-gebaseerde snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer een niet-invasieve stringtest voor snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie via qPCR. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde behandeling en verbetert de klinische zorg voor patiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Sanming Project of Medicine in Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) en de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Grant No. 2022A1515220023). Research Foundation for Advanced Talents van Guandong Provincial People's Hospital (Nr. KJ012021097) en de National Natural Science Foundation of China (81871734, 82072380, 82272423). De financiers hadden geen rol in het studieontwerp, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

De huidige studie werd uitgevoerd in overeenstemming met ethische overwegingen die zijn vastgesteld door de ethische commissie van het Guangdong Provincial People's Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China (goedkeuringsnummer: KY-Q-2022-384-02). Patiënten in de leeftijdscategorie van 18-60 jaar oud werden geïncludeerd in deze studie. Patiënten die antibiotica, antibacteriële Chinese geneesmiddelen, geneesmiddelen zoals protonpompremmers (PPI) of H 2-receptorantagonisten, enz., Binnen2 weken voorafgaand aan het testen gebruikten, werden niet in deze studie opgenomen. De patiënten die in de afgelopen 3 maanden een behandeling tegen H.pylori hadden gekregen, werden ook uitgesloten van deze studie. Degenen met ernstige hart-, lever-, nierproblemen, ernstige neuropathie of psychische aandoeningen mochten ook niet deelnemen aan deze studie. Er waren geen zwangere vrouwen en zogende moeders opgenomen in deze studie. Details van de benodigdheden (reagentia, chemicaliën, apparatuur en software) die in dit onderzoek worden gebruikt, worden gegeven in de Materiaaltabel.
1. Stringtest voor maagvloeistofbemonstering
<ol><li>Vraag de patiënt om 's nachts te vasten voor de monsterverzameling.</li>
	<li>Open de volgende dag de stringtestkit, neem de capsule en houd de lus aan het einde van de string vast.</li>
	<li>Plak het touwtje op de wang van de patiënt en vraag hen om de capsule op hun tong te plaatsen in de buurt van de achterkant van de keel en het door te slikken met een slok water.</li>
	<li>Laat de capsule oplossen in de maag van de patiënt, waardoor de sliert in de capsule wordt blootgesteld om maagslijm te absorberen.</li>
	<li>Vraag een getrainde assistent om het touwtje voorzichtig uit te trekken 1 uur nadat de patiënt de capsule heeft ingeslikt.</li>
	<li>Snijd het onderste uiteinde van de in het maagvocht gedrenkte streng (40 cm) af, plaats het in de TSE-monsterconserveringsoplossing (Tris/zoutoplossing/EDTA) en stuur het vervolgens bij kamertemperatuur (RT) naar het klinisch laboratorium voor de daaropvolgende detectie van H. pylori en de bepaling van de antibioticaresistentieprofielen met behulp van qPCR.</li>
</ol>2. DNA-extractie
<ol><li>Plaats de monsterdragende opvangbuizen op een reageerbuisrek, correct gelabeld, en draai ze gedurende 10 s.</li>
	<li>Draai de 32-well plaat (nucleïnezuurextractie of zuiveringskit) meerdere keren ondersteboven om de magnetische kralen te resuspenderen. Na een korte vortex gedurende 10 s, verwijdert u voorzichtig de aluminiumfolieafdichting van de plaat.</li>
	<li>Breng 200 μL maagvloeistof van elk monster en H. pylori DNA als positieve controle over in de afzonderlijke putten.</li>
	<li>Plaats de 32-putplaat in de overeenkomstige monstersleuf van de nucleïnezuurextractormachine voor automatische DNA-extractie.</li>
	<li>Na DNA-extractie en bevestiging, start de antibioticaresistentie testen voor claritromycine en levofloxacine via qPCR op de positieve monsters.</li>
	<li>Plaats de overtollige maagvloeistof en geëxtraheerde DNA-monsters bij −20 °C voor langdurige opslag en toekomstig gebruik.</li>
	<li>Voer al deze stappen uit in een bioveiligheidskast om besmetting te voorkomen.</li>
</ol>3. qPCR voor de detectie van H. pylori en resistentie tegen antibiotica (claritromycine en levofloxacine)
<ol><li>Voer qPCR uit voor de detectie van H. pylori en de vermoedelijke antibioticaresistentiemutaties in zijn genoom.<ol><li>Ontdooi het qPCR-reactiemengsel (H. pylori-nucleïnezuurdetectiekit) op ijs en meng het door te vegen en te draaien om verlies van reagens te voorkomen.</li>
		<li>Meng voor elk monster op een plaat met 32 putten 20 μL PCR-reactiemengsel (genotyperingsreactiepremix [met het Taq-enzym, desoxyribonucleosidetrifosfaat, reactiebuffer en magnesiumchloride], met ureA-voorwaartse en omgekeerde primers en een ureA-sonde ) en 5 μL van het geëxtraheerde DNA.</li>
		<li>Voer de qPCR-plaat met 32 putten uit op de qPCR-machine. Programmeer de thermische cycler: het reactiemengsel wordt eerst sequentieel gereageerd bij 42 °C en 95 °C (beide gedurende één cyclus) gedurende elk 2 minuten; vervolgens 40 cycli bij 95 °C, denaturatie gedurende 10 s en gloeien en verlengen bij 58 °C gedurende 45 s.</li>
		<li>Stel de fluorescentiesignaalacquisitie in op FAM (H. pylori) en de gegevensverzameling op de versterkingsverlengingsperiode. Nadat de reactie is voltooid, slaat u de gegevens op voor toekomstige resultatenanalyse.</li>
		<li>Analyseer de gegevens met behulp van specifieke software voor qPCR, omdat het instrument automatisch basislijndrempels selecteert.</li>
		<li>Als het testresultaat voor H. pylori positief is, zal de machine automatisch beginnen met het testen van de resistentie van geneesmiddelen op het monster. Vervang de reagenskit door detectiereagentia voor 23S rRNA-gen en gyrA-genmutaties in de H. Pylori (qPCR)-kit. OPMERKING: De reagenskit (detectiereagentia voor 23S rRNA-gen en gyrA-genmutaties in Helicobacter pylori [qPCR]) bevat het PCR-reactiemengsel (genotyperingsreactiepremix [met het Taq-enzym, desoxyribonucleosidetrifosfaat, reactiebuffer, magnesiumchloride], primers en sondes). Alle negatieve kwaliteitscontroleproducten zijn steriel, gezuiverd water. Het positieve kwaliteitscontroleproduct in de H. pylori nucleïnezuurdetectiekit is geïnactiveerde H. pylori-standaardkralen (ATCC 43504). De sterke H. pylori-positieve en zwak positieve kwaliteitscontroleproducten in de kit (detectiereagentia voor het 23S-rRNA-gen en gyrA-genmutaties in H. pylori) zijn het DNA van de geïnactiveerde H. pylori-stam die het doelgen en het mutante gen bevat. Evenzo, op basis van de werkelijke situatie, zijn alle diagnostische normen, inclusief de aanwezigheid van H. pylori-infectie of medicijnresistentie, ingesteld op CT ≤ 35 en hebben ze een typische S-vormige curve. De concentratie van de zwakke kwaliteitscontrole is 1,0 x 103 kopieën / ml, terwijl de concentratie van de sterke kwaliteitscontrole 1,0 x 108 kopieën / ml is.</li>
	</ol></li>
</ol>

qPCR-gebaseerde snelle, niet-invasieve diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie

<ol><li>Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori%3A+Phenotypes%2C+genotypes+and+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes.</a> Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).</li>
<li>Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+alcohol+consumption%2C+cigarette+smoking%2C+and+Helicobacter+pylori+infection+in+Iraqi+patients+submitted+to+gastrointestinal+endoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Emergency+Medicine%2C+Trauma+and+Acute+Care%22%5BJournal%5D)">Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy.</a> Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12(2022).</li>
<li>Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori%3A+Commensal%2C+symbiont+or+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen.</a> World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).</li>
<li>Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+gastric+cancer%3A+Epidemiological+trends%2C+risk+factors%2C+screening+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).</li>
<li>Liou, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+eradication+of+Helicobacter+pylori+for+gastric+cancer+prevention%3A+The+Taipei+global+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus.</a> Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).</li>
<li>IARC Helicobacter pylori Working Group. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Helicobacter+Pylori+Eradication+as+A+Strategy+for+Preventing+Gastric+Cancer%22">Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer</a>. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2014).</li>
<li>Vaira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stool+antigen+test+for+detection+of+Helicobacter+pylori+after+eradication+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy.</a> Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).</li>
<li>Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercially+available+Helicobacter+pylori+serology+kits%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review.</a> Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).</li>
<li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+Helicobacter+pylori+infection+-+The+Maastricht+IV%2F+Florence+consensus+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht IV/ Florence consensus report.</a> Gut. 61 (5), 646-664 (2012).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+juice-based+real-time+PCR+for+tailored+Helicobacter+Pylori+treatment%3A+A+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach.</a> International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).</li>
<li>Thung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+The+global+emergence+of+Helicobacter+pylori+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Alimentary+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance.</a> Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+antibiotic+target+genes+related+to+clarithromycin%2C+metronidazole+and+levofloxacin+resistance+in+Helicobacter+pylori+strains+from+children+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China.</a> Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).</li>
<li>Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Helicobacter+pylori+infection+by+invasive+and+noninvasive+techniques+in+patients+with+gastrointestinal+diseases+from+Iraq%3A+A+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study.</a> PLoS One. 16 (8), e0256393(2021).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+sensing+strategies+based+on+different+types+of+biomarkers+toward+early+diagnosis+of+H.+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).</li>
<li>Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+clarithromycin+resistance+and+23SrRNA+point+mutations+in+clinical+isolates+of+Helicobacter+pylori+isolates%3A+Phenotypic+and+molecular+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).</li>
<li>Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+clarithromycin-resistant+Helicobacter+pylori+in+clinical+specimens+by+molecular+methods%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Antimicrobial+Resistance%22%5BJournal%5D)">Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review.</a> Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).</li>
<li>Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-endoscopic+method+to+obtain+Helicobacter+pylori+for+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture.</a> Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).</li>
<li>DiNardo, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+string+test+and+stool+specimens+to+diagnose+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis.</a> International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypervirulent+Klebsiella+pneumoniae+isolates+using+the+string+test+in+combination+with+Galleria+mellonella+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity.</a> European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).</li>
<li>Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+gram-positive+and+gram-negative+bacteria+and+yeasts+using+a+modification+of+the+%26%2334%3Bstring%26%2334%3B+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medical+Technology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the &#34;string&#34; test.</a> The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).</li>
</ol>

H. pylori-detectie kan worden uitgevoerd met behulp van zowel invasieve als niet-invasieve methoden13. Veelgebruikte invasieve technieken zoals histopathologie, de snelle ureasetest, polymerasekettingreactie (PCR) en bacteriële kweek vereisen endoscopie en biopsie. Serologische tests, ureumademtests en enzymgebonden immunosorbenttests (ELISA) worden aanbevolen onder de niet-invasieve procedures14. Hoewel niet-invasieve methoden gemakkelijk uit te voeren, economisch en comfortabeler zijn voor patiënten, vereisen de isolatie en kweek van H. pylori om aanvullende testen uit te voeren, zoals stamidentificatie en antibioticagevoeligheidstests, invasieve tests. Met de huidige toename van antibioticaresistentie worden eerder gebruikte antibiotica ineffectief en slagen ze er dus niet in om infecties te behandelen die worden veroorzaakt door medicijnresistente H. pylori-isolaten. In dit geval kan het ophalen van H. pylori om antibioticagevoeligheidstests uit te voeren nodig zijn om de antibiotica te selecteren die hoogstwaarschijnlijk met succes de resistente bacteriën zullen elimineren.
Routinematig uitgevoerde op cultuur gebaseerde gevoeligheidstests zoals de agarverdunningsmethode en epsilometertest (E-test) hebben verschillende beperkingen: ze zijn tijdrovend, omdat H. pylori een langzaam groeiende bacterie is, duur, op vaardigheden gebaseerd en invasieve technieken vereist. Afwisselend verschillende moleculaire technieken, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) technieken en qPCR, kunnen worden gebruikt om verschillende mutaties te identificeren, zoals in het 23S rRNA-gen, dat codeert voor resistentie tegen claritromycine15,16. Driepuntsmutatieplaatsen (A2142G, A2143G, A2142C) van het 23S rRNA-resistentiegen van H. pylori en zespuntsmutatieplaatsen (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) van het gyrA-resistentiegen van chinolonantibiotica werden geselecteerd voor het ontwerpen van primers en sondes om resistentie tegen respectievelijk claritromycine en levofloxacine te bepalen.
De stringtest, die afkomstig is van de ENTEO-TEST, maakt gebruik van een capsule bevestigd aan een zeer absorberende nylon string, die wordt ingeslikt om maagsecreties te verzamelen17. Momenteel zijn stringtests gebruikt om tuberculose18 te diagnosticeren, om zeer virulente Klebsiella pneumoniae (hvKp) te onderscheiden van traditionele Klebsiella pneumoniae19, om Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën en gist te identificeren en om H. pylori te diagnosticeren uit maagvloeistof20. In deze studie combineerden we de stringtest, een minimaal invasieve techniek, met qPCR voor de identificatie van H. pylori-infecties in een klinische opstelling en voerden we gevoeligheidstests uit door ons te richten op eerder gemelde resistentie-coderende mutaties in het H. pylori-genoom. We kozen voor het ureA-gen omdat het een huishoudingsgen is dat uniek is voor H. pylori zonder potentieel risico op kruisreactie met andere organismen. Alle H. pylori-isolaten moeten het ureA-gen hebben om in de menselijke maag te overleven, en knock-outexperimenten hebben aangetoond dat H. pylori zonder het ureA-gen niet het vermogen heeft om in de maag te koloniseren.
Voor qPCR zijn kwaliteitscontrolenormen uiterst belangrijk. In de qPCR-detectie van H. pylori zijn de vereisten van de kwaliteitscontrolenormen als volgt: een negatief kwaliteitscontroleproduct (geen toename van het fluorescentiesignaal in de FAM-detectieroute, geen typische S-type versterkingscurve, CT-waarde > 35,00 of geen duidelijk signaal); een positief kwaliteitscontroleproduct (fluorescentiesignaalgroeicurve van de FAM-detectieroute met een S-vormige curve, CT-waarde ≤ 35,00) en aan de bovenstaande eisen moet tegelijkertijd worden voldaan; anders wordt de test als ongeldig beschouwd en moet deze opnieuw worden uitgevoerd. Bovendien zijn voor de qPCR-detectie van H. pylori-resistentie tegen antibiotica (claritromycine en levofloxacine), met uitzondering van de CT-waarde die onderscheid maakt tussen positieve en negatieve resultaten, die verandert in 30,00 voor resistentiedetectie, de andere vereisten dezelfde als hierboven. Met name de sequentie-informatie over de primers en probes is niet beschikbaar in dit artikel omdat het commerciële eigendomsrechten betreft.
Om efficiëntere antibiotica voor elke patiënt te selecteren, is het van cruciaal belang om de lokale prevalentie van H. pylori en zijn antibioticaresistentieprofiel te onderzoeken vanwege de toegenomen antimicrobiële resistentie wereldwijd en bovendien vanwege de variatie in resistentiepatronen tussen verschillende geografische gebieden. De belangrijkste beperking van onze studie is dat de steekproefomvang erg klein was en geen betrekking had op verschillende geografische regio's in China om de prevalentie van H. pylori-infectie en het volledige antibioticaresistentieprofiel aan te tonen, maar de stringtesttechniek is goed ontwikkeld en door deze te combineren met qPCR, bereikten we een gelijktijdige diagnose van H. pylori detectie van infecties en resistentie tegen geneesmiddelen. Deze resultaten suggereren dat deze aanpak op grotere schaal kan worden gebruikt in verschillende regio's van de wereld.

H. pylori is een spiraalvormige, zeer beweeglijke, gramnegatieve bacterie die voornamelijk in het pylorusgebied van de maagleeft 1. Het is een veel voorkomende ziekteverwekker die bijna 50% van de wereldbevolking infecteert2. De meeste mensen met H. pylori-infectie hebben geen klinische manifestaties en de meeste ontwikkelen verschillende ziekten na enkele jaren van infectie, waaronder chronische gastritis, maagzweren, maagzweren en maagkanker3. In verschillende studies op basis van verschillende populaties is de werkzaamheid van het elimineren van H. pylori voor het voorkomen van maagkanker en precancereuze laesies aangetoond 4,5. Daarom heeft het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) H. pylori-uitroeiing geadviseerd als een preventieve maatregel6.
Het gebruik van niet-invasieve methoden om H. pylori-infectie te identificeren is een belangrijk onderdeel van de behandeling voor de meeste personen met asymptomatische dyspepsie. De ureumademtest (UBT), H. pylori fecale antigeentest (SAT) en serologische testen zijn populaire niet-invasieve technieken. Onder deze is de UBT de minst indringende en meest nauwkeurige procedure die beschikbaar is. UBT gebruikt urease, overvloedig aanwezig in H. pylori, om isotopisch gelabeld ureum te hydrolyseren tot ammoniak en koolstofdioxide (13C of 14C). De immunochromatografische test (ICA)7 is daarentegen handig, eenvoudig en niet-invasief voor bemonstering. De nauwkeurigheid van de test wordt echter beïnvloed door verschillende factoren, zoals de kwaliteit van het ontlastingsmonster, de temperatuur en het interval tussen het verzamelen van monsters en het testen. Een andere test op basis van de immuunrespons is de serum H. pylori-antilichaamtest , die antilichamen in het serum van een patiënt detecteert. Deze test is echter niet geschikt voor analyse na de behandeling, omdat de antilichamen lang blijven nadat de bacteriën zijn opgeruimd8. Een ander groot nadeel is dat deze methoden alleen H. pylori-infectie diagnosticeren en geen medicijnresistentietests toestaan om op gevoeligheid gebaseerde behandeling te begeleiden.
Voor invasieve testmethoden moet maagbiopsieweefsel worden genomen door endoscopie en vervolgens worden onderworpen aan histologie, de urease-sneltest en bacteriecultuur. Deze testmethoden zijn ook zeer beperkt vanwege verschillende factoren. Momenteel zijn deze technieken beperkt tot oudere patiënten, patiënten met een hoog risico op precancereuze of kwaadaardige ziekte en patiënten die hebben gefaald in de eerstelijnstherapie voor gastro-oesofageale refluxziekte of H. pylori-infectie 9. Ten tweede, vanwege de unieke groeikenmerken van H. pylori, bereikt het slagingspercentage van bacteriecultuur slechts 50% 10. Moleculaire detectiemethoden bieden dus nieuwe hoop om de hoge eisen van invasieve detectiemethoden te overwinnen en op gevoeligheid gebaseerde behandeling te begeleiden. Onder moleculaire detectiemethoden is kwantitatieve PCR de afgelopen jaren enorm geëvolueerd. qPCR vereist, in tegenstelling tot traditionele PCR, geen gel-elektroforese en kwantificeert DNA / RNA in monsters nauwkeurig door primers en sondes toe te voegen in de gloeifase. qPCR-kits voor de detectie van H. pylori-infectie en medicijnresistentie zijn nu in de handel verkrijgbaar. Toch heeft elke methode zijn beperkingen; Daarom moeten de klinische diagnose en behandeling van een patiënt worden overwogen in combinatie met hun symptomen, tekenen, geschiedenis, andere laboratoriumtests en respons op de behandeling.
Momenteel is de primaire methode voor de behandeling van H.pylori-infecties het nemen van antibiotica, maar de laatste tijd wordt het steeds moeilijker om deze infecties te behandelen vanwege de toename van antibioticaresistentie. Vervolgens is wereldwijd een significante afname van de werkzaamheid van de behandeling met H. pylori waargenomen, waardoor de uitroeiing van H. pylori een belangrijk probleem voor de volksgezondheid isgeworden 11.
Claritromycine en levofloxacine zijn de twee breedspectrumantibiotica die worden gebruikt om infecties veroorzaakt door H.pylori te behandelen, maar verschillende studies hebben wijdverspreide resistentie tegen deze twee geneesmiddelen in H.pylori-isolaten gemeld. A2143G, A2142G en A2142C zijn drie van de talrijke puntmutaties in het 2,9 kb 23S rRNA-gen die resulteren in claritromycineresistentie door te voorkomen dat het macrolide bindt. Tegelijkertijd bevinden de mutatieloci van het levofloxacineresistentiegen zich voornamelijk in de zes mutatieplaatsen (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) van het gyrA-gen 12. De ontdekking van deze resistentiemechanismen op basis van genetische mutaties heeft geleid tot een geleidelijke verschuiving in de detectie van H. pylori door middel van culturele studies naar moleculair testen.
Over het algemeen is er een dringende klinische behoefte aan een niet-invasieve, effectieve en gelijktijdige diagnostische methode voor de detectie van H. pylori-infecties en medicijnresistentie. We hebben een gecombineerde stringtest en qPCR-methode aangenomen om de moeilijkheden van bemonstering te overwinnen en het doel van de gelijktijdige detectie van H. pylori-infectie en medicijnresistentie te bereiken met behulp van verschillende primer-sondes.

<table><tbody><tr><td>23S rRNA en gyrA-genpuntmutaties detectiekit (PCR-fluorescentieproberen)</td><td>Hongmed Infagen</td><td></td><td>Detectie van Helicobacter pylori-resistentie tegen claritromycine en levofloxacine</td></tr><tr><td>ABI 7500-fluorescentie kwantitatieve PCR-machine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SEDA 20163220767</td><td>Fluorescentie kwantitatieve PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>ABI 7500 software</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Gegevensanalyse</td></tr><tr><td>BSC-1500IIA2-X</td><td>BIOBASE</td><td>SEDA 20143222263</td><td>Bioveiligheidskabinet</td></tr><tr><td>DNA-extractiekit</td><td>Daan Gene&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-Centrifuge</td><td>WEALTEC</td><td></td><td>Centrifugeer het restvocht van de buiswand.</td></tr><tr><td>H. Pylori DNA-detectiekit (PCR-fluorescentieproberen)&nbsp;</td><td>Hongmed Infagen</td><td></td><td>Testen op H. pylori-infectie</td></tr><tr><td>Stream SP96 geautomatiseerde nucleïnezuur extractor</td><td>Daan Gene</td><td>SEDA 20140104</td><td>Voor DNA-extractie&nbsp;</td></tr><tr><td>String testkit</td><td>Hongmed Infagen</td><td></td><td>Het bevat een capsule die aan een touw is bevestigd, een schaar, wattenstaafje en een monsterbewaarbuis&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-lage temperatuurvriezer&nbsp;(DW-YL450)&nbsp;</td><td>MELING</td><td>SEDA 20172220091</td><td>-20 &deg;C voor het opslaan van reagentia&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex-5</td><td>Kylin-bell</td><td></td><td>Voor het mengen van reagentia&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve polymerasekettingreactie (qpcr)-gebaseerde snelle diagnose van helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie

Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-Based Rapid Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Antibiotic Resistance

Helicobacter pylori is een belangrijke menselijke ziekteverwekker die ongeveer de helft van de wereldbevolking infecteert en een ernstige bedreiging voor de gezondheid wordt vanwege de toenemende antibioticaresistentie. Het is de veroorzaker van chronische actieve gastritis, maagzweren en maagkanker en is geclassificeerd als een groep I carcinogeen door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek. Daarom zijn de snelle en nauwkeurige diagnose van H. pylori en de bepaling van de antibioticaresistentie belangrijk voor de efficiënte uitroeiing van deze bacteriële ziekteverwekker. Momenteel omvatten de diagnosemethoden van H. pylori voornamelijk de ureumademtest (UBT), de antigeentest, de serumantilichaamtest, gastroscopie, de snelle ureasetest (RUT) en bacteriecultuur. Onder hen zijn de eerste drie detectiemethoden niet-invasief, wat betekent dat het eenvoudige tests zijn om uit te voeren. Bacteriën kunnen echter niet via deze technieken worden opgehaald; Het testen van resistentie tegen geneesmiddelen kan dus niet worden uitgevoerd. De laatste drie zijn invasieve onderzoeken, maar ze zijn duur, vereisen hoge vaardigheden en hebben het potentieel om schade aan patiënten te veroorzaken. Daarom is een niet-invasieve, snelle en gelijktijdige methode voor H. pylori-detectie en medicijnresistentietests erg belangrijk voor het efficiënt uitroeien van H. pylori in de klinische praktijk. Dit protocol heeft tot doel een specifieke procedure te presenteren met de stringtest in combinatie met kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) voor de snelle detectie van H. pylori-infectie en antibioticaresistentie. In tegenstelling tot bacterieculturen zorgt deze methode voor een eenvoudige, snelle, niet-invasieve diagnose van de H. pylori-infectiestatus en medicijnresistentie. Specifiek gebruikten we qPCR om rea te detecteren voor H. pylori-infectie en mutaties in de 23S-rRNA- en gyrA-genen , die coderen voor resistentie tegen respectievelijk claritromycine en levofloxacine. In vergelijking met routinematig gebruikte kweektechnieken biedt dit protocol een niet-invasieve, goedkope en tijdbesparende techniek om H. pylori-infectie te detecteren en de antibioticaresistentie te bepalen met behulp van qPCR.

Detectie van H. pylori-infectie en antibioticaresistentie in maagvocht door qPCR We voerden qPCR uit voor de detectie van H. pylori-infectie door het ureA-gen te amplificeren en bepaalden het antibioticaresistentieprofiel door zich te richten op puntmutaties in het 23S-rRNA-gen en gyrA-gen (tabel 1). De CT-waarden voor kwaliteitscontrole in alle drie de groepen van de qPCR-experimenten lagen binnen het aanbevolen bereik, wat aangeeft dat de monsters zich allemaal in een normale toestand bevonden op het moment van het experiment en dat de testresultaten betrouwbaar waren. In deze studie werden vijf monsters met verschillende testresultaten (S1-S5) geselecteerd om de betrouwbaarheid van het experimentele protocol te karakteriseren. S1 vertegenwoordigt een representatieve stam van H. pylori zonder infectie, terwijl de S2-S5-monsters die zijn geïnfecteerd met H. pylori met verschillende resistentieresultaten (figuur 1). We hebben het systeem ingesteld om geen verdere resistentietests uit te voeren met de monsters die niet zijn geïnfecteerd met H. pylori, dus het S1-monster ging niet mee naar de weerstandstest nadat de systeemtest een negatief resultaat voor H. pylori liet zien. In termen van de monsters die positief waren voor H. pylori-infectie, lagen de S2 CT-waarden allemaal binnen het detectiebereik, wat aangeeft dat het monster H. pylori-positief was en dubbele resistentie vertoonde tegen claritromycine en levofloxacine, en clinici werden aanbevolen om andere methoden voor behandeling naar eigen goeddunken te kiezen. De CT-waarden van S3 lagen binnen het detectiebereik voor H. pylori-infectie en de levofloxacineresistentietest, terwijl er geen CT-waarden werden gedetecteerd in de claritromycineresistentietest, wat aangeeft dat het S3-monster afkomstig was van een levofloxacine-resistente patiënt. Evenzo lag de CT-waarde van het S4-monster binnen het detectiebereik voor H. pylori-infectie en claritromycineresistentie, terwijl er geen CT-waarde werd gedetecteerd voor levofloxacineresistentie, wat aangeeft dat deze patiënt resistent was tegen claritromycine, en het werd aanbevolen dat ze levofloxacine namen voor behandeling. Ten slotte toonde de S5-monstertest CT-waarden binnen het detectiebereik alleen voor de detectie van H. pylori-infectie, wat aangeeft dat deze patiënt gevoelig was voor beide antibiotica en kon worden behandeld met een van de twee geneesmiddelen. In vergelijking met de bacteriële kweekmethode, die ook H. pylori-infectie en medicijnresistentie detecteert, is deze methode veilig en effectief in het detecteren van H. pylori-infectie en medicijnresistentie zonder schade aan de patiënt te veroorzaken en kan deze worden gebruikt om de arts te begeleiden bij het formuleren van een geschikt behandelplan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65689/65689fig01.jpg"> Figuur 1: Detectie van H. pylori en zijn antibioticaresistentie in maagvocht door qPCR. (A) Kwantitatieve PCR-amplificatie van H. pylori-infectie , (B) detectie van claritromycineresistentie en (C) detectie van levofloxacineresistentie. "S" staat voor sample. "S1" is een monster dat negatief terugkwam voor H. pylori-infectie en werd ook getest op antibioticaresistentie; "S2" is een met H. pylori geïnfecteerd monster met resistentie tegen zowel claritromycine als levofloxacine; "S3" is ook een H. pylori-positief monster, maar is claritromycine-gevoelig en levofloxacine-resistent; "S4" is ook een H. pylori-positief monster, maar is claritromycine-resistent en levofloxacine-gevoelig; "S5" is een H. pylori-positief monster, maar is gevoelig voor zowel claritromycine als levofloxacine. De concentratie van de zwakke kwaliteitscontrole is 1,0 x 103 kopieën / ml, terwijl de concentratie van de sterke kwaliteitscontrole 1,0 x 108 kopieën / ml is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65689/65689fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Monster</td>
			<td colspan="2">H. Pylori</td>
			<td colspan="2">Claritromycine</td>
			<td colspan="2">Levofloxacine</td>
		</tr><tr><td>+/-</td>
			<td>CT</td>
			<td>+/-</td>
			<td>CT</td>
			<td>+/-</td>
			<td>CT</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
		</tr><tr><td>S2</td>
			<td>+</td>
			<td>22.61</td>
			<td>+</td>
			<td>22.77</td>
			<td>+</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>S3</td>
			<td>+</td>
			<td>28.32</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>+</td>
			<td>30.18</td>
		</tr><tr><td>S4</td>
			<td>+</td>
			<td>28.76</td>
			<td>+</td>
			<td>27.67</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
		</tr><tr><td>S5</td>
			<td>+</td>
			<td>31.59</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Tabel met de qPCR-resultaten van de detectie van H. pylori-infectie en resistentie tegen claritromycine en levofloxacine. Deze tabel presenteert de kwalitatieve resultaten voor H. pylori-infectie , de detectie van 23S-rRNA-genmutaties die aantonen dat het isolaat resistent is tegen claritromycine en de detectie van gyrA-genmutaties die aantonen dat het isolaat resistent is tegen levofloxacine. +/−, kwalitatief resultaat; +, positief resultaat; −, negatief resultaat.

Het protocol presenteert een niet-invasieve methode voor de snelle diagnose van Helicobacter pylori-maaginfecties door middel van de stringtest en bepaalt de antibioticaresistentie tegen claritromycine en levofloxacine met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR).

Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-gebaseerde snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to ...

Maagkanker veroorzaakt door de maagbacterie, Helicobacter pylori, doodt elk jaar 300.000 mensen in China. Dit onderzoek beschrijft de ingeslikte snaartest waarmee we Helicobacters niet-invasief kunnen vangen en vervolgens testen, zodat patiënten de allerbeste antibioticabehandeling kunnen krijgen. We denken dat elke arts in China gepersonaliseerde, precisiegeneeskunde zal willen beoefenen door deze test te gebruiken om hun behandeling te begeleiden.We richten ons momenteel op de ontwikkeling van de stringtest. Wij geloven dat het het potentieel heeft om een revolutie teweeg te brengen in de manier waarop maagziekten kunnen worden gediagnosticeerd. Stringtest opent deuren voor onderzoekers om maagmonsters van vrijwilligers te verkrijgen zonder de noodzaak van gastro-endoscopie.Het belangrijkste is dat we hopen dat de stringtest in de toekomst kan worden gebruikt om te screenen op vroege maagkanker. De combinatie van stringtest en qPCR stelt ons in staat om H.pylori-infecties en zijn antibioticaresistentie te detecteren zonder de noodzaak om H.pylori te kweken. Dit verminderde de diagnostische tijd aanzienlijk van drie weken tot slechts één dag en vermeed de vaardigheidsafhankelijke H.pylori-kweektechniek.Ten eerste zou de zeer gevoelige en specifieke van de stringtest en qPCR-combinatie een nauwkeuriger resultaat opleveren. Ten tweede kan deze ene test ook een antibioticaresistentieprofiel opleveren, waardoor artsen een effectievere, gepersonaliseerde behandeling kunnen bieden. Ten derde hoefden onderzoekers niet langer maagmonsters te nemen, afhankelijk van gastro-enteroloog.Deze niet-invasieve methode is sneller en handiger om maagaandoeningen te bestuderen. De huidige studie werkt aan Helicobacter pylori-infectie en de antibioticaresistentie in heel China. Vervolgens zullen we op basis van de gegevens die we hebben ons management verbeteren door ons te concentreren op regio's met een hogere antibioticaresistentie.Bovendien biedt de stringtest ons een geweldige kans om nieuwe markers voor kankerpreventie te verkennen.

quantitative-polymerase-chain-reaction-qpcr-based-rapid-diagnosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle en nauwkeurige methode voor de detectie van H. pylori en het testen van resistentie tegen geneesmiddelen is zeer belangrijk voor het efficiënt uitroeien van H. pylori in de klinische praktijk. Dit protocol heeft tot doel een specifieke methodologie te presenteren met betrekking tot kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) van het maagslijmvlies voor de snelle detectie van H. pylori en antibioticaresistentie.

Maagslijmvlies Kwantitatieve polymerasekettingreactieanalyse voor het detecteren van Helicobacter pylori en antibioticaresistentie

Het protocol maakt gebruik van een niet-invasieve ontlastingsbemonstering in combinatie met een kwantitatieve polymerasekettingreactie om een gemakkelijke en snelle diagnostische methode te bieden voor Helicobacter pylori-infectie en de resistentie tegen claritromycine en chinolonen.

Detectie van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie via ontlasting Kwantitatieve polymerasekettingreactieanalyse

Van de talrijke diagnostische methoden voor Helicobacter pylori kan kwantumdot-immunofluorescentie Helicobacter pylori snel typen en detecteren, wat een basis vormt voor klinische behandelingsbeslissingen. Dit artikel geeft een gedetailleerde inleiding tot de toepassingswaarde van quantum dot-technologie bij de typering en detectie van Helicobacter pylori.

Snelle detectie van virulentie en typering van Helicobacter pylori met behulp van Quantum Dot-labeltechnologie

In deze studie werd een sandwichdetectietechniek op basis van dubbele antilichamen ontwikkeld voor snelle detectie van fecale antigenen geïnfecteerd met Helicobacter pylori.

Snelle detectie van fecaal antigeen van Helicobacter pylori-infectie op basis van dubbele antilichaamsandwichdetectietechnologie

Deze studie beschrijft een methode die de snelle en duidelijke diagnose van plantaardige virusziekten in ongeveer een halve dag maakt door gebruik te maken van een combinatie van microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie en negatieve kleuring methoden.

Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Een snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek kan worden gebruikt als een monster voor toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF, Gram-kleuring, antibiotica gevoeligheidstesten en PCR-gebaseerde test. De resultaten kunnen snel worden meegedeeld aan artsen om de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren.

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Hier beschrijven we een methode om het oncogene bacteriële orgaantje, bekend als het Cag Type IV Secretie Systeem (Cag-T4SS), te visualiseren.  We ontdekken dat de Cag-T4SS differentieel wordt geproduceerd op het oppervlak van H. pylori als reactie op wisselende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid.

Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid

Uit stamcellen afgeleide culturen bevatten een enorm potentieel om infectieziekten te modelleren. Hier wordt de kweek van muis en menselijke gastrische organoïden, afgeleid van volwassen stamcellen, beschreven. De organoïden worden gemicro-injecteerd met het gastrische pathogeen Helicobacter pylori.

Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori

Een hoge opbrengst Werkwijze voor eenstaps negatieve zuivering van recombinant Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP) tot overexpressie gebracht in Escherichia coli door diethylaminoethyl harsen batchmodus is beschreven. HP-NAP gezuiverd met deze methode is gunstig voor de ontwikkeling van vaccins, geneesmiddelen of diagnostica voor H. pylori-geassocieerde ziekten.

Een stap Negatieve Chromatografische zuivering van<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofiel-activerend eiwit overexpressie in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In Batchmodus

Leer een niet-invasieve stringtest voor snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie via qPCR. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde behandeling en verbetert de klinische zorg voor patiënten.

Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-gebaseerde snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-gebaseerde snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie

Meer video's verkennen