Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen
15 december 2023
Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).
Het doel van dit onderzoek is het ontwikkelen van een methodologie voor monstervoorbereiding die zowel toegankelijk als betrouwbaar reproduceerbaar is. Door dit te bereiken, kan de kracht van directe cellulaire cryo-elektronentomografie worden gebruikt om een breed scala aan biologische vragen te beantwoorden. De uitdagingen van de voorbereiding van het net zijn groot.
Cellen hechten zich niet gemakkelijk aan roosters en manipulatie kan leiden tot schade aan de koolstoflaag, wat resulteert in het verlies van afbeeldbare rastergebieden. Bovendien wordt de prevalentie van dunne cellulaire uitsteeksels verminderd zonder aandacht te besteden aan de juiste omstandigheden voor monstervoorbereiding. De huidige protocollen vereisen doorgaans gespecialiseerde apparatuur om de belangrijkste knelpunten van seeding op te lossen, zoals micropatronen en 3D-geprinte houders voor respectievelijk celbevestiging en manipulatie.
Dit protocol biedt oplossingen met een grotere toegankelijkheid, terwijl de flexibiliteit behouden blijft voor het gebruik van deze gespecialiseerde tools voor downstream-toepassingen.
Overzicht
Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de preparatie van elektronenmicroscopie (EM) grids voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM). Het protocol pakt uitdagingen bij de gridpreparatie aan, waarbij celhechting wordt gewaarborgd en schade aan de koolstoflaag wordt geminimaliseerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektronenmicroscopie
Achtergrond
- Directe cellulaire cryo-elektronentomografie is een krachtig instrument voor biologisch onderzoek.
- De preparatie van het raster is cruciaal voor succesvolle beeldvorming en analyse.
- Huidige methoden vereisen vaak gespecialiseerde apparatuur, wat de toegankelijkheid beperkt.
- Dit protocol is erop gericht het proces te vereenvoudigen terwijl de flexibiliteit behouden blijft.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare en toegankelijke methodologie te ontwikkelen voor de preparatie van EM-roosters.
- Om de bruikbaarheid van cryo-elektronentomografie in biologische studies te verbeteren.
- Om veelvoorkomende uitdagingen bij celhechting en de integriteit van het rooster aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Glow discharge-behandeling van grids om de celadhesie te verbeteren.
- Toepassing van runder-fibronectine om celaanhechting te bevorderen.
- Procedures voor het uitzaaien van cellen en transfectie van HIV-moleculaire klonen.
- Plunge-freezing van grids voor cryo-elektronentomografie-beeldvorming.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle aanhechting van cellen aan EM-roosters met minimale beschadiging.
- Observatie van HIV-producerende cellen met behulp van cryo-correlatieve microscopie.
- Effectieve bewaring van de integriteit van het rooster tijdens het preparatieproces.
- Demonstratie van de reproduceerbaarheid van het protocol over meerdere proeven.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de toegankelijkheid voor de preparatie van EM-grids.
- Het maakt een effectieve studie van cellulaire processen mogelijk met behulp van cryo-elektronentomografie.
- Toekomstige toepassingen kunnen deze methode benutten voor diverse biologische onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Robuuste monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen is cruciaal om structurele studies met een hoge resolutie in natuurlijke cellulaire contexten mogelijk te maken. Dit protocol pakt belangrijke knelpunten aan bij de hantering van grids, celhechting en reproduceerbaarheid, wat een directe impact heeft op de betrouwbaarheid van downstream imaging en integratieve analyses. Verbeterde toegankelijkheid en standaardisatie in de monstervoorbereiding verhogen het voorspellend vertrouwen en de besluitvorming over portfolio's in vroegtijdige discovery en translationeel onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van de cellulaire ultrastructuur mogelijk voor mechanistische risicoreductie.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het behoud van natuurlijke celomgevingen.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar moleculaire assemblage in situ.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische monsters voor voor correlatieve imaging-workflows.
- Standaardiseert de rasterpreparatie om reproduceerbaarheid en kwantitatieve imaging-resultaten te waarborgen.
- Verbetert de gereedheid voor high-content screening en integratieve microscopieplatforms.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt beelduitgangen uit met ziekterelevante cellulaire modellen voor translationele continuïteit.
- Maakt structurele beoordeling van virale en cellulaire interacties in preklinische systemen mogelijk.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door het leveren van morfologische gegevens met een hoge getrouwheid.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor monstervoorbereiding integreert op het snijvlak van discovery biology en geavanceerde beeldvorming en ondersteunt workflows van vroege mechanistische studies tot validatie van preklinische modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Biedt reproduceerbare monstervoorbereiding voor hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking.
- Screening: Levert gestandaardiseerde grids van hoge kwaliteit voor kwantitatieve beeldvorming en assay-ontwikkeling.
- Analytiek: Maakt de acquisitie van robuuste structurele gegevens mogelijk voor vergelijkende analyse tussen experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinisch onderzoek door de cellulaire context in beeldvormingsresultaten te behouden.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een flexibel, toegankelijk protocol dat aanpasbaar is aan diverse celtypen en beeldvormingsmodaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de structurele validatie van targets.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, standaardisatie en schaalbaarheid van workflows voor monstervoorbereiding.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en de kapitaalefficiëntie door het aantal imaging-fouten te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, het hanteren van grids en microscopietechnieken.
- Toegang tot glow discharge-apparaten, biologische veiligheidskasten en plunge-freezing-instrumentatie is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare gridpreparatie en beeldkwaliteit.
- Aanpasbaar aan diverse adherente zoogdierceltypen met indien nodig aanpassingen aan het protocol.
- De fragiliteit en manipulatie van grids blijven praktische beperkingen die een zorgvuldige behandeling vereisen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
