Name: Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:25:00.000+00:00
Description: Leer calciumbeeldvorming voor retinale ganglioncellen bij elektrische stimulatie met ex vivo rattenretina's. Deze methode biedt cellulaire resolutie voor het testen van retinale prothesen en verbetert het begrip van neuronale reacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara en Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) dankbaar voor hun technische ondersteuning, Anna Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) van de Ophthalmology Research group voor hun ondersteuning bij de intravitreale injecties en de in vivo beeldvorming van het netvlies.
De financieringsentiteiten die dit werk hebben ondersteund zijn: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programma voor kenniscentra op het gebied van O&O (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya via het CERCA-programma; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr. 871124); Stichting La Caixa (LCF/HR19/52160003); en Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de standaard ethische richtlijnen voor dieren (Richtlijn 86/609/EU van de Europese Gemeenschappen) en goedgekeurd door de lokale ethische commissies voor dieren. Voor de huidige studie werden 8 weken oude Long Evans-ratten gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
1. Voorbereiding van media en vlakke montage
<ol><li>Ames' Medium (1 L)<ol><li>Meng in een glazen fles van 1 liter het Ames' Medium-poeder, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml penicilline/streptomycine 100x en 1 l gedeïoniseerd water (zie materiaaltabel). Stel de pH in op 7,4 en de osmolariteit op 280 mOsm met gedeïoniseerd water of NaHCO3. Steriliseer de oplossing door deze te filteren door een filter met een poriegrootte van 0,2 μm onder een kap. NOTITIE: Bewaar het gesteriliseerde medium bij 4 °C. Deze oplossing blijft stabiel en kan tot 1 maand worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage membranen<ol><li>Bevestig een poreus PTFE-membraan (zie Materiaaltabel) met kleine druppels lijm op een ring. Laat het minstens 15 minuten drogen.</li>
		<li>Om doorschijnendheid te bereiken, dompelt u de membranen gedurende 1 minuut onder in 70% ethanol.</li>
		<li>Spoel de membranen twee keer met gedeïoniseerd water om de ethanol volledig te verwijderen. Bewaar ze in gedeïoniseerd water om ondoorzichtigheid te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GCL-etikettering en platte montage van het netvlies van de rat
OPMERKING: Deze etiketteringsmethode maakt geen onderscheid tussen RGC's en verplaatste amacriene cellen. Als selectieve labeling van RGC's gewenst is, overweeg dan het gebruik van AAV's met RGC-specifieke promotors11 en/of retrograde labeling via de oogzenuw12. Om onderscheid te maken tussen klassen van ON- en OFF-center RGC's, classificeert u RGC's op basis van hun lichtrespons13,14 en gebruikt u nieuwere versies van genetisch gecodeerde calciumindicatoren die een verhoogde gevoeligheid bieden en de mogelijkheid om enkelvoudige actiepotentialen te meten15.
<ol><li>Intravitreale injectie<ol><li>Verdoof de 8 weken oude Long Evans-rat met 2% isofluraan/1% O2 totdat er geen pedaalreflex meer is, en handhaaf de anesthesie met een rattenneusmasker (zie Materiaaltabel). NOTITIE: Plaats het dier tijdens de anesthesie op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden.</li>
		<li>Dien één druppel in de handel verkrijgbare oogdruppels toe (zie Materiaaltabel) om de pupil te verwijden.</li>
		<li>Voordat u doorgaat met de operatie, onderzoekt u het oog op afwijkingen met behulp van fundoscopie en optische coherentietomografie (OCT) met een in vivo retinaal beeldvormingssysteem. Breng één druppel Methocel 2% aan om het contact tussen het hoornvlies en het objectief te vergemakkelijken (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Als er afwijkingen worden gedetecteerd, ga dan niet verder met de volgende stappen voor dat oog.</li>
		<li>Breng een druppel Prescaine aan als plaatselijke verdoving. Fixeer het ooglid en het limbale bindvlies met een in de handel verkrijgbaar hechtdraadfilament (zie Materiaaltabel). Maak een sclerotomie van 1 mm op 4 mm van de limbus met behulp van een naald van 30 G.<ol><li>Bevestig een stompe naald van 36 G aan een precisiespuit en injecteer de AAV-deeltjes met de genetisch gecodeerde calciumindicator gedurende 30 s in het glasvocht, in een hoek van 45°. In deze studie gebruikten we AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml in HBSS) (zie Tabel met materialen). OPMERKING: AAV-constructen die niet coderen voor potentieel tumorigene genproducten of toxinemoleculen en die worden geproduceerd zonder een helpervirus, kunnen worden behandeld in faciliteiten voor bioveiligheidsniveau 1 (BSL-1). Anders, als het als biologisch gevaarlijk materiaal wordt beschouwd onder BSL-2-inperking, moeten de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen16. AAV's die coderen voor GCaMP worden beschouwd als BSL-1 en hoeven niet te worden gemanipuleerd onder bioveiligheidskasten.</li>
		</ol></li>
		<li>Breng één druppel Tobradex aan (zie Materiaaltabel) om ontstekingen te voorkomen en als antibiotische profylaxe.</li>
		<li>Herhaal desgewenst stap 2, 3 en 4 met het andere oog. OPMERKING: Controleer de dieren 12-24 uur na de operatie om er zeker van te zijn dat er geen bijwerkingen zijn.</li>
		<li>Onderzoek drie dagen na injectie de structuur van het netvlies met behulp van fundoscopie en OCT met een in vivo beeldvormingssysteem van het netvlies (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Twee weken na injectie moet de GCL fluorescentie afgeven. Beoordeel de netvliesstructuur en AAV-expressie door middel van fluorescentiefundoscopie met behulp van een in vivo retinaal beeldvormingssysteem. OPMERKING: Volgens Weitz et al.12 wordt fluorescentie van AAV2-CAG-GCaMP5G 1 week na injectie merkbaar en wordt deze na 2 weken intenser. Vanaf de vierde week induceert overexpressie van GCaMP cytomorbiditeit. Stervende cellen vertonen een hoog baseline fluorescentiesignaal in de kern en het cytoplasma dat niet fluctueert als reactie op stimulatie. In gezonde cellen is GCaMP-expressie beperkt tot het cytoplasma en uitgesloten van de kern 7,8,12,17,18. Deze kenmerken kunnen ex vivo worden waargenomen tijdens microscopische beeldvorming. Het venster van genexpressie kan variëren, afhankelijk van de virale vector en de gekozen promotor.</li>
	</ol></li>
	<li>Retina excisie en flat-mount OPMERKING: Twee tot drie weken na injectie worden intravitreaal geïnjecteerde ratten geëuthanaseerd onmiddellijk voordat het elektrofysiologische protocol begint, in overeenstemming met de standaard ethische richtlijnen (Richtlijn 86/609/EU van de Europese Gemeenschappen) en goedgekeurd door lokale ethische commissies. Inhalatie van kooldioxide (CO2) wordt in dit protocol gebruikt als euthanasiemethode.<ol><li>Oog enucleatie<ol><li>Druk voorzichtig op de buitenkant van de oogkas met behulp van een gebogen pincet om het oog iets uit de oogkas te steken.</li>
			<li>Gebruik een veerschaar om de spieren die het oog vasthouden door te knippen en te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat u de oogbol niet doorboort. OPMERKING: Ontleed vanaf deze stap het netvlies onder een stereomicroscoop in zuurstofrijk (95% O2 / 5% CO2) Ames' Medium.</li>
		</ol></li>
		<li>Retina excisie<ol><li>Gebruik een kleine gebogen pincet en een schaar met fijne veer om al het omringende weefsel van de oogbol te verwijderen.</li>
			<li>Neem een stuk filterpapier van ongeveer 3 cm x 3 cm en leg dit op het deksel van een schaal van 3,5 cm. Doordrenk het papier met Ames' Medium.</li>
			<li>Plaats de oogbol op het papier, met het voorste segment naar de operator gericht. Gebruik een rechte pincet om de oogbol vast te houden en plaats ze bovenop de ora serrata in een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van het oppervlak van de schaal. Maak een kleine snede met een mes, waarbij u de ruimte tussen de rechte pincet als referentie gebruikt.</li>
			<li>Vergoed de oogbol in Ames' Medium. Gebruik een rechte pincet en een fijne veerschaar om de voorste en achterste segmenten van het oog te scheiden.</li>
			<li>Verwijder de lens voorzichtig met behulp van twee rechte pincetten. Scheid vervolgens het netvlies van de sclera.</li>
			<li>Knip de sclera in de richting van de oogzenuw met een fijne veerschaar totdat het netvlies is geïsoleerd van de oogschelp.</li>
			<li>Gebruik een fluorescentie-stereomicroscoop om het gebied van het netvlies te identificeren met de beste calciumindicatorexpressie. OPMERKING: De mate van virale verspreiding hangt af van het succes van de intravitreale injectie. Het bereiken van fluorescentie over grote delen van het netvlies kan oefening vergen. De ervaring van de onderzoeker speelt een cruciale rol bij het verkrijgen van optimale resultaten.</li>
			<li>Breng met behulp van een plastic pipet met een gesneden punt het geselecteerde stuk van het netvlies over op het montagemembraan (montagemembranen, stappen). Gebruik een rechte pincet om het netvlies plat te monteren met de GCL naar boven gericht.</li>
			<li>Met een plastic pipet die aan een pipetpunt van 100 μL is bevestigd, verwijdert u de media zodat het netvliesstuk zich aan het poreuze membraan kan hechten. Draai het geheel op de MEA zodat de GCL op de elektroden rust.</li>
			<li>Vul het monsterbad met zuurstofrijk Ames' Medium.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Ex vivo calciumbeeldvorming bij elektrische stimulatie
OPMERKING: In dit werk werd een proof-of-concept MEA gebruikt voor ex vivo experimenten. De op maat gemaakte MEA's werden vervaardigd met poreuze elektroden op basis van grafeen met een diameter van 25 μm op 500 μm dik borosilicaatglas met Ti/Au-sporen en later geïsoleerd met siliciumnitride en SU-8 fotoresist12. De calciumbeeldvormingsmethoden zijn echter geldig, ongeacht het elektrodemateriaal dat voor stimulatie wordt gebruikt.
<ol><li>Stel het perfusiesysteem zo in dat het zuurstofrijke Ames' Medium het monsterbad constant doordringt bij 33 °C met een constant debiet van 5 ml/min.</li>
	<li>Gebruik een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een fluorescentielamp, een FITC-filterkubus en een CMOS-camera, inspecteer het netvlies op een gebied waar de stimulerende elektroden en de fluorescentie van GCaMP-expressiecellen zichtbaar zijn. Voor dit onderzoek is gebruik gemaakt van een 20x NA 0,75 luchtobjectief. OPMERKING: Om de cellen met de elektroden effectief te stimuleren (en vast te leggen), moeten het netvlies en de elektrode nauw contact met elkaar hebben. Cellen bevinden zich dus zichtbaar in hetzelfde brandpuntsvlak als de elektroden. Als dit niet het geval is, herhaal dan de stappen van retina-excisie vanaf stap 8. Houd er bij het gebruik van netvliezen van gezonde diermodellen (met functionerende fotoreceptoren) rekening mee dat elke keer dat de fluorescentielamp wordt ingeschakeld, er enkele opgewekte reacties door het licht worden gegenereerd, aangezien het netvlies lichtgevoelig is voor de golflengte die wordt gebruikt om de GCaMP-sensor op te winden. Deze door licht geïnduceerde calciumveranderingen kunnen worden gebruikt om de gezondheidstoestand van het weefsel te beoordelen. Om te voorkomen dat licht wordt vermengd met elektrisch opgewekte reacties, moet u de fluorescentielamp ten minste 1 minuut voordat u met de beeldacquisitie begint, inschakelen.</li>
	<li>Om elektrisch opgewekte reacties in de GCL op te wekken, selecteert u een elektrode om stroomgestuurde pulsen te verzenden. Stel de elektrische stimulatieparameters in de software van het pulsgeneratorapparaat in, zoals: vorm, amplitude, duur, fasevertraging en frequentie van toe te passen pulsen. OPMERKING: Effectieve stimulusparameters kunnen sterk variëren van pulsbreedtes van 50 μs tot 100 ms, met amplitudes variërend van 0,1 μA tot 10 μA. Deze parameters, samen met stimulusfrequentie, stimuluspolariteit, aantal pulsen en interfasevertragingen, kunnen de spatiotemporele respons beïnvloeden die wordt waargenomen door calciumbeeldvorming 19,20,21,22. Een trein van 40 bifasische pulsen die 1 ms, 2 μA stimulatie leveren, genereert vaak een zichtbare respons in gelabelde neuronen.</li>
	<li>Om de beeldacquisitie te synchroniseren met de stimulatieafgifte, gebruikt u de pulsgenerator als externe trigger om het begin van de beeldacquisitie te regelen. Verbind de camera (zie Materiaaltabel) met de pulsgenerator met behulp van het uitgangstriggersignaal en stel de "Capture Mode" van de camerasoftware in op "External Start Trigger". Druk op Start in de camerasoftware zodat deze wacht op een externe trigger om te starten. Start de beeldacquisitie met de pulsgeneratorsoftware. OPMERKING: De externe triggerbediening kan voor verschillende camera's anders zijn ingesteld. Deze studie verwierf meestal beelden (512 x 512 pixels, 16-bits grijstinten) met 10 frames per seconde gedurende 1 minuut, terwijl ze elke 10 s bursts van bifasische pulstreinen leverden. De pulsafgifte begint na 10 s, dus de eerste frames in alle experimenten komen overeen met spontane activiteit. Afhankelijk van de GCaMP-sensor en de analyse die men zal uitvoeren, moet men mogelijk de opnamesnelheid aanpassen aan de stijg- en vervaltijden van uw calciumindicator8. Houd rekening met de gevoeligheid van de calciumindicator15 voor het detecteren van enkelvoudige actiepotentialen.</li>
	<li>Sla de beelden op met een bestandsnaam die de toegepaste parameters voor elektrische stimulatie bevat, zoals [Elektrodenummer]_[Pulsamplitude]_[Pulsduur]_[Pulsfrequentie]_Image001.</li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>ImageJ/FIJI om het fluorescentie-intensiteitsprofiel in de loop van de tijd en de ruimtelijke coördinaten uit de celsomas te extraheren<ol><li>Segmenteer de interesseregio (ROI) met de "Area Selection Tools" en voeg deze toe aan de ROI Manager (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Sla het in het menu ROI Manager op als een map .zip (Meer > Opslaan). OPMERKING: Doorgaans kunnen dezelfde ROI's worden toegepast op alle stimulatie-experimenten, omdat ze overeenkomen met hetzelfde gezichtsveld.</li>
		<li>Selecteer de "Gemiddelde grijswaarde" als de parameter die moet worden geëxtraheerd (Analyseer > stel metingen in).</li>
		<li>Extraheer de "Gemiddelde grijswaarde" uit de celsomas door op Meer > Multimaatregel te klikken. Er verschijnt een dialoogvenster. Schakel de opties Alle 600 segmenten meten en Eén rij per segment in om één tabel te verkrijgen waarin kolommen overeenkomen met ROI's en rijen overeenkomen met tijdframes. Sla de gegenereerde tabel op als een .xls spreadsheet.</li>
		<li>Selecteer de "Centroid" als de parameter die moet worden geëxtraheerd (Analyseer > stel metingen in).</li>
		<li>Extraheer het "Centroid" uit de ROI's door op Meten te klikken. De gegenereerde tabel komt overeen met de coördinaten (X,Y) van de ROI's. Sla het op als een .xls spreadsheet.</li>
	</ol></li>
	<li>Op maat gemaakt script om cellen te identificeren die reageren op de stimuli OPMERKING: MATLAB (zie Materiaaltabel) is hier gebruikt, maar de beschreven stappen kunnen in elke programmeertaal worden uitgevoerd. Gebruikers kunnen ons op maat gemaakte script verkrijgen door de bijbehorende auteur op te vragen.<ol><li>Correctie van het fotobleekeffect: Om de achtergrond en het fotobleekeffect te verminderen, neemt u 15-20 frames van de niet-stimulerende perioden vóór elke burst en past u deze aan in een lineaire curve [fit (poly1)]. OPMERKING: In dit geval, voor een film met in totaal 600 frames waarin periodieke uitbarstingen van pulstreinen om de 10 s werden verzonden, werden frames 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 beschouwd als niet-stimulerende perioden.</li>
		<li>Normaliseren met behulp van de formule: (X-min) / (max-min)</li>
		<li>Identificatie van reagerende cellen<ol><li>Bereken het wortelgemiddelde kwadraat (RMS) van de niet-stimulerende perioden op basis van de genormaliseerde gegevens. Dit wordt beschouwd als het basissignaal.</li>
			<li>Bereken het maximum van de stimulerende perioden (kaders tussen de niet-stimulerende periodes). In dit geval, voor een film met in totaal 600 frames waarin periodieke uitbarstingen van pulstreinen om de 10 s werden verzonden, werden frames 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 beschouwd als de stimulerende perioden.</li>
			<li>Als de maximale waarde het basissignaal 2,5 keer overschrijdt voor een specifieke ROI, markeert u de cel als reagerend op die stimulerende periode. Als de cel reageert op drie van de vijf stimulerende perioden, classificeer hem dan als een reagerende cel.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Evaluatie van calciumactiviteit in de laag van retinale ganglioncellen

<ol><li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+causes+of+vision+loss+in+high-income+countries+and+in+Eastern+and+Central+Europe+in+2015%3A+Magnitude%2C+temporal+trends+and+projections%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections.</a> British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).</li>
<li>Li, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+incidence+of+age-related+macular+degeneration+in+Europe%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).</li>
<li>Roska, B., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring vision.</a> Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).</li>
<li>Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornig%2C+R+%22Implantable+Sensor+Systems+for+Medical+Applications%22">Implantable Sensor Systems for Medical Applications</a>. , Elsevier. 469-496 (2013).</li>
<li>Lewis, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+implantable+bionic+devices+for+blindness%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in implantable bionic devices for blindness: a review.</a> ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).</li>
<li>Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+the+retina+to+produce+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+gene+delivery+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The ocular gene delivery landscape.</a> Biomolecules. 11 (8), 1135(2021).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+retinal+ganglion+cell+promoter+for+utility+in+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+diversity+of+retinal+ganglion+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse.</a> Nature. 529, 345-350 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> Nature. 615, 884-891 (2023).</li>
<li>Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Guidelines+April+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biosafety%22%5BJournal%5D)">NIH Guidelines April 2019.</a> Applied Biosafety. 24, Preprint at https://doi.org/10.1177/1535676019871146 (2019).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+expression+in+retinal+ganglion+cells+characterized+using+a+low-cost+fundus+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system.</a> Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018(2017).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+spatial+resolution+of+epiretinal+implants+by+increasing+stimulus+pulse+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration.</a> Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).</li>
<li>Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+strategies+for+selective+activation+of+retinal+ganglion+cell+soma+and+threshold+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction.</a> Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017(2019).</li>
<li>Im, M., Fried, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+properties+of+network-mediated+responses+to+repetitive+stimuli+are+dependent+upon+retinal+ganglion+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type.</a> Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002(2016).</li>
<li>Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thresholds+for+activation+of+rabbit+retinal+ganglion+cells+with+relatively+large%2C+extracellular+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).</li>
<li>Ramos, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-reported+complications+after+intravitreal+injection+and+their+predictive+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+Retina%22%5BJournal%5D)">Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors.</a> Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viral+vectors+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy.</a> Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).</li>
<li>Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+new+vectors+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developing new vectors for retinal gene therapy.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291(2023).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Hellström, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+tropism+and+transduction+properties+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+in+adult+retina+after+intravitreal+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection.</a> Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+calcium+sensor+GCaMP-X+overcomes+the+calcium+channel+perturbations+induced+by+the+calmodulin+in+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP.</a> Nature Communications. 9, 1504(2018).</li>
<li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+adeno-associated+viral+%28AAV%29+vector-mediated+transgene+expression+in+retinal+ganglion+cells%3A+comparison+of+five+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters.</a> Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).</li>
<li>Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neuronal+cultures+to+detect+and+study+new+pathogenic+antibodies+involved+in+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 184, e63829(2022).</li>
<li>Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+the+epiretinal+prosthesis+is+not+limited+by+electrode+size%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen om aan het manuscript toe te voegen.

Het hier beschreven protocol dient om de calciumdynamiek te bestuderen die optreedt in de retinale GCL van de rat bij elektrische stimulatie die wordt toegediend met een MEA. Het is een betrouwbare en beheersbare methode, maar vereist enige training, met name om de GCL efficiënt uniform te labelen en om het netvlies op de juiste manier te monteren om een optimaal contact tussen weefsel en elektrode te garanderen. Dit protocol is specifiek voor knaagdieren en moet worden aangepast als het wordt toegepast op een andere laboratoriumsoort. De kritieke punten, wijzigingen en beperkingen van de methodologie worden in detail gepresenteerd.
Intravitreale injecties Injecties worden veel gebruikt voor oculaire genafgifte, waarbij intravitreale injecties de voorkeursprocedure zijn. Het is bewezen dat ze veiliger en minder invasief zijn in vergelijking met subretinale injecties, waarbij de moleculen van belang rechtstreeks tussen de fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel (RPE) worden geïntroduceerd, waardoor netvliesloslating wordt geriskeerd10. Er zijn echter beperkingen, vooral bij het uitvoeren van deze injecties in knaagdiermodellen. Het glasvocht is gelatineachtig en belemmert de virale verspreiding. Bovendien is de lens in knaagdierogen groot, waardoor het niet triviaal is om de naald in te brengen zonder er krassen op te maken. De precisienaalden van de spuit zijn delicaat en moeten vaak worden vervangen. Om obstructie te voorkomen, wast u ze voor en na elk gebruik met gedeïoniseerd water en vervangt u ze regelmatig. Injecteer de inhoud bovendien langzaam om reflux van de oplossing en veranderingen in de intraoculaire druk te voorkomen. Het bereiken van een grote en uniforme fluorescentie over het netvlies kan oefening vergen.
Transductie van netvliescellen Virale vectoren zijn een uitstekende methode voor in vivo genafgifte, en AAV's worden veel gebruikt voor het transduceren van netvliescellen10. Ze zijn goedgekeurd als behandeling voor sommige retinopathieën die blindheid bij de mens veroorzaken24. Hun draagcapaciteit is echter beperkt tot 5 kb, met inbegrip van de vereiste regelgevingselementen (bv. de promotor)10,25. Er zijn meerdere serotypen beschikbaar, elk met een ander tropisme. Kies de meest geschikte AAV op basis van de af te leveren genen en de te transduceren cellen26. Voor het labelen van de RGC's wordt aanbevolen om AAV227 te gebruiken.
Het venster van de genexpressie De optimale virale expressie voor AAV2-CAG-GCaMP5G is 2 tot 3 weken na injectie12,18. Na dat tijdsbestek worden de kernen van getransfecteerde cellen fluorescerend, reageren cellen niet meer op stimuli en sterven ze uiteindelijk 7,28,29. Dit komt door de overexpressie van de GCaMP-indicator, die in de kern wordt getransloceerd. Het tijdvenster voor optimale genexpressie is afhankelijk van de virale vector en de gekozen promotor30 en moet experimenteel worden bepaald voordat verder wordt gegaan met dit protocol.
Contact tussen weefsel en elektrode Voor optimale en reproduceerbare resultaten is een goed contact tussen weefsel en elektrode cruciaal. Slecht contact is meestal te wijten aan de natuurlijke kromming van het netvlies. Een benadering is om het netvlies in vieren te snijden, sectie voor sectie te monteren en af te beelden. Kleine delen van het netvlies kunnen beter worden afgeplat, wat resulteert in een effectiever contact met het oppervlak van de MEA. Een andere mogelijke reden voor slecht contact is de aanwezigheid van glasvocht. Bij het uitvoeren van stimulatie-experimenten die een epi-retinaal implantaat simuleren, is het belangrijk om het glasvocht voorzichtig te verwijderen tijdens retina-excisie, omdat het kan fungeren als een isolator voor stroom. Hier wordt een eenvoudige methode beschreven om te controleren of het contact voldoende is door de elektrode en cellen in hetzelfde brandpuntsvlak te visualiseren.
Een alternatief voor ex vivo netvliesmetingen is om neuronen direct op het oppervlak van de elektroden te laten groeien. Primaire kweek van neuronen, zoals hippocampusneuronen31, kan nuttig zijn voor de eerste tests om de functionaliteit van het nieuwe stimulerende apparaat te evalueren. Deze aanpak vereist echter nog steeds het gebruik van proefdieren en vertegenwoordigt niet de complexiteit van het netvliesnetwerk, wat belangrijk is voor het evalueren van synaptische reacties op stimulatie.
Om de cellen onder de elektrode en elektrodesporen te visualiseren, kunnen MEA's worden gebruikt die zijn vervaardigd met transparante materialen zoals indiumtinoxide (ITO) 19,20,32. Naast optische metingen kan GCL-activiteit bij elektrische stimulatie worden beoordeeld door middel van elektrische opnames. De MEA kan worden gebruikt om de lokale veldpotentiaal (LFP) van het weefsel vast te leggen. Dit gaat echter ten koste van de ruimtelijke resolutie, aangezien elke elektrode activiteit van meerdere cellen tegelijk vastlegt (afhankelijk van de afmetingen van de elektrode). Optische opname overwint deze beperking en biedt kaarten met een hogere ruimtelijke resolutie. Het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen actieve en inactieve cellen terwijl een groot gezichtsveld wordt gemeten met een resolutie van één cel. Van alle cellulaire activiteitsverslaggevers zijn calciumindicatoren goed beschreven en worden ze het meestgebruikt33.

Het netvlies bevat fotoreceptoren, dit zijn cellen die verantwoordelijk zijn voor het waarnemen van licht. Ze vangen fotonen op en zetten ze om in zenuwimpulsen. Deze impulsen worden vervolgens verwerkt in het netvlies en doorgegeven aan de visuele cortex, wat resulteert in de vorming van een visueel beeld1. Retinitis Pigmentosa (RP) en leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD) zijn degeneratieve ziekten die worden gekenmerkt door het progressieve verlies van fotoreceptoren. Deze retinopathieënbehoren wereldwijd tot de belangrijkste oorzaken van blindheid1, treffen miljoenen mensen en hebben aanzienlijke medische, persoonlijke en sociaaleconomische gevolgen voor patiënten, gezondheidszorgsystemen en de samenleving als geheel. Bovendien wordt verwacht dat AMD-gevallen met de vergrijzing van de bevolking tegen 2050 met 15% zullen toenemen2.
Momenteel zijn er tal van onderzoeksinspanningen aan de gang om het gezichtsvermogen te herstellen bij patiënten die aan deze aandoeningen lijden3. Een veelbelovende aanpak is het gebruik van netvliesprothesen, die effectief zijn gebleken bij het gedeeltelijk herstellen van het gezichtsvermogen 4,5. Deze apparaten vangen licht op van de visuele scène en zetten het om in elektrische pulsen. Deze pulsen worden afgegeven via elektroden in een micro-elektrode-array (MEA) die in het oog is geïmplanteerd, waardoor de overlevende neuronen worden gestimuleerd en de functie van de verloren fotoreceptoren wordt omzeild. De geactiveerde retinale ganglioncellen (RGC's) geven de output door aan de hersenen, waar het wordt geïnterpreteerd als visuele waarneming. De belangrijkste beperkingen van de huidige implantaten liggen echter in de resolutie van de elektrode-weefselinterface6 en de niet-selectieve stimulatie van verschillende celtypen. Om het ontwerp van nieuwe implanteerbare apparaten voor een efficiënter herstel van het gezichtsvermogen te optimaliseren, is het daarom van cruciaal belang om te begrijpen hoe stimulatieparadigma's kunnen worden ontwikkeld om selectief cellen in de nabijheid van de elektroden te activeren.
Calciumbeeldvorming is een veelgebruikte techniek voor het bestuderen van neurale activiteit en biedt verschillende voordelen ten opzichte van niet-optische methoden 7,8. Ten eerste biedt het cellulaire en subcellulaire resolutie. Ten tweede kunnen calciummarkers zich richten op specifieke celtypen. Ten derde maakt het het mogelijk om op lange termijn te volgen, en ten vierde maakt het de observatie van hele celpopulaties mogelijk terwijl onderscheid wordt gemaakt tussen actieve en inactieve cellen. Deze methode levert indirect bewijs van cellulaire activiteit met een temporele resolutie in het bereik van honderden milliseconden. Genetisch gecodeerde fluorescerende calciumindicatoren, zoals GCaMP-sensoren, ondergaan een conformatieverandering bij binding aan calcium, wat resulteert in verhoogde fluorescentie9. Recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) zijn een effectief middel om retinale cellen te transduceren met GCaMP10.
Dit protocol presenteert een efficiënte methode die calciumbeeldvorming gebruikt voor het testen van stimulatieprotocollen van retinale implantaten. In het bijzonder richten we ons op ex vivo netvliesweefsel van ratten en geven we gedetailleerde stapsgewijze instructies, van monsteracquisitie tot data-analyse. Door deze uitgebreide gids aan te bieden, kunnen onderzoekers met verschillende achtergronden met vertrouwen beginnen met experimenten met elektrische stimulatie.

<table><tbody><tr><td>20x NA 0.75 S Fluor air objective</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20X</td><td>-</td></tr><tr><td>3.5 cm Cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>12-565-90</td><td>-</td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>VWR</td><td>613-5373</td><td>-</td></tr><tr><td>36 G blunt needle</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>-</td></tr><tr><td>6 cm Cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>12-565-94</td><td>-</td></tr><tr><td>AAV2-CAG-GCaMP5G&nbsp;</td><td>Vector Biolabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420</td><td>-</td></tr><tr><td>Blade</td><td>Swann-morton</td><td>0308</td><td>-</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td>-</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air liquide</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Curved-forceps&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Fine spring-scissors</td><td>FST</td><td>91501-09</td><td>-</td></tr><tr><td>FITC filter cube</td><td>Nikon</td><td>Standard series</td><td>-</td></tr><tr><td>Fluorescent lamp</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C-HGFI</td><td>-</td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td>-</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Capricorn</td><td>HBSS-1A</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI&nbsp;</td><td>NIH</td><td>v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>In vivo retinal imaging system&nbsp;</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>Micron III</td><td>-</td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td>-</td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Arrane Baxter Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Long-Evans rat</td><td>Janvier</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>MATLAB (Version R2021b)&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Media filters</td><td>Merckmillipore</td><td>SCGPS02RE</td><td>-</td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>Omni Vision</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Microelectrode array (MEA)</td><td>-</td><td>Custom-made</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermofisher</td><td>42427</td><td>-</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>-</td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Alcon Cus&iacute; Laboratories</td><td>653437.3</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td>VWR</td><td>612-1793</td><td>-</td></tr><tr><td>Porous membrane</td><td>Merckmillipore</td><td>#JVWP01300</td><td>-</td></tr><tr><td>Precision syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>10 &micro;l Nanofil</td><td>-</td></tr><tr><td>Prescaina</td><td>Llorens</td><td>-</td><td>Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic</td></tr><tr><td>Rat nasal mask</td><td>Xenotec</td><td>XRK-RA</td><td>-</td></tr><tr><td>Small curved-forceps&nbsp;</td><td>Bbraun</td><td>AESCBD311R</td><td>-</td></tr><tr><td>Spring-scissors&nbsp;</td><td>FST</td><td>15040-11</td><td>-</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>-</td></tr><tr><td>Straight forceps&nbsp;</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>-</td></tr><tr><td>Suture filament</td><td>Vitrex Medical</td><td>4328</td><td>Nilon monofilament, 7/0, DS12</td></tr><tr><td>Tobradex</td><td>Alcon Cus&iacute; Laboratories</td><td>-</td><td>Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL)</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Alcon Cus&iacute; Laboratories</td><td>653486</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>Washer</td><td>Thorlabs</td><td>W8S038</td><td>-</td></tr></tbody></table>

calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Netvliesdystrofieën zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van blindheid. Er worden uitgebreide inspanningen geleverd om geavanceerde netvliesprothesen te ontwikkelen die de aangetaste lichtgevoelige fotoreceptorcellen in het gedegenereerde netvlies kunnen omzeilen, met als doel het gezichtsvermogen gedeeltelijk te herstellen door visuele waarnemingen te induceren. Een veelgebruikte onderzoeksrichting is het ontwerp en de productie van implanteerbare apparaten met een flexibele fysieke structuur, waarin een groot aantal elektroden is ondergebracht. Dit maakt het mogelijk om efficiënt en nauwkeurig visuele waarnemingen te genereren. Bij elke technologische vooruitgang ontstaat er echter behoefte aan een betrouwbare en beheersbare ex vivo-methode om de functionaliteit van het apparaat te verifiëren voordat wordt overgegaan tot in-vivo-experimenten , waarbij factoren buiten de prestaties van het apparaat een rol spelen. Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag (GCL) na elektrische stimulatie. In het bijzonder worden de volgende stappen geschetst: (1) het fluorescerend labelen van het netvlies van de rat met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren, (2) het opvangen van het fluorescentiesignaal met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop terwijl verschillende patronen van elektrische stimulatie worden toegepast, en (3) het extraheren en analyseren van de calciumsporen uit individuele cellen binnen de GCL. Door deze procedure te volgen, kunnen onderzoekers efficiënt nieuwe stimulatieprotocollen testen voordat ze in vivo experimenten uitvoeren.

Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, is gebaseerd op de fluorescentiebeeldvormings- en elektrische stimulatiestudies uitgevoerd door Weitz et al.12. Het protocol bestaat uit drie hoofdonderdelen: (1) fluorescerende labeling van de GCL en platte montage van het netvlies op de MEA (Figuur 1-links), (2) visualisatie van calciumactiviteit in de GCL tijdens elektrische stimulatie (Figuur 1-midden), en (3) extractie, verwerking en interpretatie van de beeldvormingsgegevens (Figuur 1-rechts).
Ten eerste, zoals afgebeeld in figuur 1-links, worden Long Evans-ratten intravitreaal geïnjecteerd met AAV2-CAG-GCaMP5G voorafgaand aan de beeldvormingssessie. De optimale virale expressie voor deze vector vindt 2 tot 3 weken na injectie plaats12,18. Nadat het dier volledig is verdoofd, wordt een geleidegat gemaakt met behulp van een naald van 30 G en vervolgens wordt 5 μL AAV2-CAG-GCaMP5G langzaam in het glasvocht geïnjecteerd met behulp van een stompe naald van 36 G die aan een precisiespuit is bevestigd om reflux te voorkomen. Tijdens virale expressie wordt een in vivo retinaal beeldvormingssysteem gebruikt om de toestand van het netvlies na de operatie te beoordelen, waarbij OCT-beelden een gedetailleerde visualisatie van de retinale lagen bieden. Zodra genexpressie is bereikt, wordt het netvlies voorzichtig uit de oogschelp gehaald met behulp van een stereomicroscoop en zeer nauwkeurige dissectie-instrumenten. Vanaf dit punt wordt het weefsel gemanipuleerd in zuurstofrijke media om het monster te bewaren. Het uitgesneden netvlies, met de GCL naar boven gericht, wordt vervolgens gemonteerd op een platform dat is ontworpen voor vlakke montage om stabiliteit te garanderen en te voorkomen dat het monster gaat zweven. Het monster wordt op het MEA-oppervlak gemonteerd met de GCL naar de elektroden gericht.
Vervolgens wordt de MEA op het interfacebord op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gemonteerd (Figuur 1-midden). Het netvliesmonster wordt bij 33 °C geperfuseerd met zuurstofhoudende media met behulp van een perfusiesysteem. Het monster kan in deze configuratie enkele uren worden bewaard. Het gewenste stimulatieschema wordt geprogrammeerd en beelden worden verkregen met een snelheid van 10 frames per seconde. Het wordt aanbevolen om de films een naam te geven op basis van de toegepaste parameters voor elektrische stimulatie. Beeldacquisitie moet beginnen vóór het begin van de stimulatie om enkele basisframes zonder stimulatie te verkrijgen, die als een negatieve controle zullen dienen.
Ten slotte, zoals geïllustreerd in figuur 1-rechts, worden de gegevens geëxtraheerd uit de time-lapse-beelden door de celsoma te segmenteren. Fotoblekende effecten worden gecorrigeerd door de gegevens aan te passen en responsieve cellen worden geïdentificeerd. Responsieve cellen worden gedefinieerd als cellen met fluorescentiepieken tijdens stimulatie die hun basislijn 2,5 keer overschrijden. Als een cel reageert op drie van de vijf uitbarstingen van stimulatie, wordt het beschouwd als reagerend op die specifieke stimulatietrein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig01v4.jpg"> Figuur 1: Overzicht van het onderzoek. Schematische illustratie van het protocol voor (links) fluorescerend labelen van de GCL van het netvlies en monstermontage, (midden) voorbereiding voor ex vivo opnames met elektrische stimulatie door een MEA, en (rechts) het analyseren van de calciumbeeldvormingsgegevens om responsieve cellen te classificeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Intravitreal-geïnjecteerd netvlies De incidentie van complicaties geassocieerd met intravitreale injecties is zeer laag. Er zijn echter enkele complicaties die kunnen voortvloeien uit de operatie zelf, ongeacht het geïnjecteerde onderdeel. Deze complicaties omvatten cataractvorming, glasvochtbloeding, verhoging van de intraoculaire druk en endoftalmitis23. Om te bepalen of deze complicaties worden veroorzaakt door de operatie, moet het dier vóór de procedure worden geëvalueerd met behulp van funduscopie en OCT. Drie dagen na de injectie moeten de dieren worden opgevolgd. In figuur 2A-D is het netvlies van een gezond geïnjecteerd dier weergegeven. Na twee weken injectie beginnen de RGC's fluorescentie tot expressie te brengen, die kan worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiefundoscopie (Figuur 2B,C). OCT-beelden bieden een gedetailleerde visualisatie van de dispositie en dikte van retinale lagen (Figuur 2D), wat een hogere resolutie biedt in vergelijking met funduscopie, met name bij het beoordelen van netvliesloslating. Zodra het netvlies plat is gemonteerd en in beeld is gebracht met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, wordt het mogelijk om de cellen en axonenbundels te onderscheiden. In tegenstelling tot andere calciumindicatoren is de GCaMP-indicator beperkt tot het cytoplasma7 en wordt fluorescentie uitgesloten van de kern (Figuur 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve beelden van het intravitreale-geïnjecteerde netvlies. (A) Fundoscopie, (B) fluorescentiefundoscopie, (C) inzoomen van de fluorescentiefundoscopie, (D) OCT-beeld en (E) epifluorescentiebeeld van het uitgesneden netvlies gemonteerd op een aangepaste MEA met op grafeen gebaseerde elektroden op 500 μm dik borosilicaatglas. In (E) komen de zwarte lijnen overeen met Ti/Au-sporen. Schaalbalken: 115 μm (D) en 100 μm (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Elektroden en GCL-contact Om neurale reacties effectief op te roepen, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het plat gemonteerde netvlies in nauw contact staat met het oppervlak van de MEA. Een eenvoudige manier om dit te verifiëren is door visueel te bevestigen of de cellen en elektroden zich in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden (Figuur 3A). Als de cellen zich niet in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden als de elektroden (Figuur 3B), geeft dit aan dat het contact suboptimaal is, wat zal resulteren in minder effectieve stimulatie.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig03.jpg"> Figuur 3: Elektroden en GCL-contact. (A) Cellen en de elektrode (sterretje) in hetzelfde brandpuntsvlak. (B) Cellen en elektroden die zich niet in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden, wat wijst op suboptimaal contact voor elektrische stimulatie in dat gebied. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Ex vivo calciumbeeldvorming na elektrische stimulatie door een MEA De resulterende gegevens van calciumbeeldvorming bestaan uit time-lapse-beelden die de neurale activiteit van honderden cellen volgen als reactie op elektrische stimulatie. Supradrempelstimuli veroorzaken een calciuminstroom in de celsommen, wat resulteert in een plotselinge verandering in de fluorescentie-intensiteit (video 1). Dit protocol maakt het mogelijk om te bepalen of een elektrode, MEA en/of stimulatie-algoritme de gewenste respons in neuraal weefsel opwekt. De grootte en toonhoogte van de elektroden op de MEA, evenals het aandeel weefsel dat wordt bestudeerd, bepalen de juiste objectieveitsvergroting die moet worden gekozen. Voor onderzoeken met stimulatie met één elektrode met diameters van 5 μm tot 100 μm is doorgaans een objectiefvergroting van 20-25x geschikt (Figuur 4A), wat een gezichtsveld oplevert van ongeveer 600 μm x 600 μm. Voor experimenten met stimulatie met meerdere elektroden kan een vergroting van 4-10x het objectief nodig zijn om een groter gebied van ongeveer 2 mm x 2 mm te beoordelen. Responsieve cellen kunnen eenvoudig worden geïdentificeerd door een standaarddeviatiebeeldprojectie van de time-lapse-film te genereren (Afbeelding 4B en Video 1).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig04.jpg"> Figuur 4: Calciumbeeldvorming van de GCL met elektrische stimulatie door een elektrode met een diameter van 25 μm. (A) Maximale projectie van een time-lapse-film van 60 seconden en (B) standaarddeviatieprojectie die duidelijk cellen weergeeft die reageren op elektrische stimuli van een poreuze elektrode op basis van grafeen met een diameter van 25 μm. De stimulerende elektrode is aangegeven met een sterretje. Schaalbalk: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Analyse van de calciumdynamiek in de loop van de tijd bij gecontroleerde stimulatie Voor elke geïdentificeerde celsoma werden de gemiddelde intensiteitswaarden in de loop van de tijd geëxtraheerd. Figuur 5A toont de fotobleekgecorrigeerde calciumsporen van de responsieve cellen. In dit voorbeeld werden elke 10 s vijf uitbarstingen van bifasische pulstreinen (kathodisch-eerst, 40 cycli, 1 ms duur, 2 μA amplitude) afgeleverd (aangegeven door zwarte lijnen) tijdens een beeldacquisitie van 60 s. Binnen een bepaald experiment worden dezelfde vijf pulstreinen toegepast om de consistentie van de respons te testen. De frames die tijdens de niet-stimulerende perioden zijn vastgelegd (rood gemarkeerd) worden gebruikt om een lineaire pasvorm uit te voeren, waarbij wordt gecorrigeerd voor het fotobleekeffect.
Zodra de reagerende cellen zijn geïdentificeerd en hun coördinaten (x,y) bekend zijn ten opzichte van de stimulerende elektrode, kan men de relatie onderzoeken tussen de stroom die nodig is om de cellen te activeren en de afstand tot de stimulerende elektrode (Figuur 5B). Zoals verwacht hebben cellen die zich dichter bij de stimulerende elektrode bevinden lagere stroomwaarden nodig om een reactie op te roepen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig05.jpg"> Figuur 5: Weergave van de elektrisch opgewekte reacties. (A) Calciumsporen van celsomas bij 5 uitbarstingen van pulstreinen (bifasisch, kathodisch-eerst, 40 cycli, duur van 1 ms, amplitude van 2 μA) om de 10 s (zwarte lijnen) tijdens een beeldacquisitie van 60 seconden. Niet-stimulerende (rood gemarkeerde frames) en stimulerende perioden (geel gemarkeerde frames) worden weergegeven. Sporen die het basissignaal (wortelgemiddelde kwadraat van de niet-stimulerende perioden) 2,5 keer overschrijden, worden beschouwd als opgewekte reacties. Cellen die in drie van de vijf stimulerende perioden reageren, worden geclassificeerd als reagerende cellen. (B) Kaart van de verdeling van de calciumactiviteit met de stimulerende elektrode (zwart omlijnde cirkel) en cellen (grijs omlijnde cirkel). De kleurcode vertegenwoordigt de minimale pulsamplitude die nodig is om een cellulaire respons op te roepen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Video 1: Calciumbeeldvorming van de GCL met elektrische stimulatie door een elektrode met een diameter van 25 μm. De video toont verschillen in fluorescentie-intensiteit als gevolg van elektrische stimulatie van een poreuze elektrode op basis van grafeen met een diameter van 25 μm. De linkerkant toont de originele film en de rechterkant toont de standaarddeviatieprojectie waar reagerende cellen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. Schaalbalk: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/Figure_S1.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Hoewel er pogingen zijn gedaan om implanteerbare apparaten voor het netvlies te testen met behulp van ex vivo-methoden, ontbrak het aan een grondig en gedetailleerd protocol van monsterverkrijging tot gegevensanalyse. Met dit werk willen we deze leemte opvullen door onderzoekers met verschillende achtergronden de nodige tools te bieden om vol vertrouwen aan neurale retinale stimulatie-experimenten te beginnen. Calciumbeeldvorming is een populaire techniek voor het bestuderen van neurale activiteit die verschillende voordelen biedt ten opzichte van niet-optische methoden.Het biedt cellulaire resolutie en kan zich richten op de specifieke celtypen. Het is vooral nuttig voor het testen van nieuwe MEA's, omdat het onderscheid maakt tussen actieve en inactieve cellen bij elektrische stimulatie. We introduceren een robuuste methodologie voor het bestuderen van de reacties van de retinale neuronen door het gebruik van calciumbeeldvorming.Deze benadering zou inzicht kunnen bieden in selectieve excitatie van de cellen, een cruciale stap in het ontwikkelen van betere stimulatieprotocollen, het verbeteren van de implantaatprestaties en het bevorderen van de stand van de techniek. Ons laboratorium richt zich op het ontwikkelen van geavanceerde microscopietechnieken. Momenteel werken we aan het vastleggen van calciumdynamiek in 3D om een beter begrip te krijgen van de negatieve interactie in het hele weefsel.

calcium-imaging-in-electrically-stimulated-flat-mounted-retinas

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Spontane activiteit van de ontwikkeling van neuronale netwerken kan worden gemeten met behulp van AM-ester vormen van calcium-gevoelige indicator kleurstoffen. Veranderingen in de intracellulaire calcium, met vermelding van neuronale activatie, worden gedetecteerd als voorbijgaande veranderingen in de indicator fluorescentie met een-of twee-foton beeldvorming. Dit protocol kan worden aangepast voor een bereik van hun ontwikkeling afhankelijk van neuronale...

Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks

Source: Zhilyakov, N. V. et. al., Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the imaging technique of recording fast calcium transients at nerve endings using confocal microscopy. By stimulating the nerve and capturing fluorescence changes from calcium-binding dyes, it visualizes dynamic calcium influx and clearance at the nerve ending, offering precise insights into...

Imaging Fast Calcium Transients in Mouse Nerve Endings Using Confocal Microscopy

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Na verwijdering uit het lichaam, is neuronaal weefsel sterk beïnvloed door omgevingsfactoren, waardoor eventuele degradatie van het weefsel na 6-8 uur. Met behulp van een unieke incubatie werkwijze, die nauw bewaakt en regelt de extracellulaire omgeving van het weefsel, kan levensvatbaarheid van het weefsel aanzienlijk worden verlengd&gt; 24 uur.

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Celcalciumbeeldvorming is een veelzijdige methodologie om dynamische signalering van individuele cellen te bestuderen, op gemengde populaties in cultuur of zelfs op ontwaakte dieren, gebaseerd op de expressie van calciumdoorlatende kanalen / receptoren die unieke functionele handtekeningen geven.

Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer calciumbeeldvorming voor retinale ganglioncellen bij elektrische stimulatie met ex vivo rattenretina's. Deze methode biedt cellulaire resolutie voor het testen van retinale prothesen en verbetert het begrip van neuronale reacties.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Meer video's verkennen