Hoogwaardige voorbereiding van hersen- en beenmergkernen voor multioomtesten met één kern
22 december 2023
Het succes van single-cell/single-nuclei transcriptomics en multi-omics hangt grotendeels af van de kwaliteit van cellen/kernen. Daarom moet het isoleren van cellen/kernen uit weefsel en hun zuivering sterk gestandaardiseerd zijn. Dit protocol beschrijft de bereiding van kernen uit de hersenen en het beenmerg voor stroomafwaartse single-nuclei multioomanalyse.
De Cytometry and Biomarkers Technology Unit ondersteunt biomedische projecten door middel van state-of-the-art technologieën en pijplijnen voor celfenotypering en moleculaire profilering met single-cell resolutie. In deze context gebruiken we verschillende tools voor single-cell multiomic analyse om inzicht te krijgen in genexpressie en genregulatie in gezondheid en ziekte. Flowcytometrie identificeert en sourcet individuele cellen op basis van unieke kenmerken.
Recente ontwikkelingen zijn onder meer spectrale sorteerders met een hoge doorvoer op basis van afbeeldingen, en die technologie biedt flexibiliteit bij het ontwerpen van panelen, maakt gelijktijdig gebruik van vergelijkbare kleurstoffen mogelijk en het beheer van autofluorescentie. Een grote experimentele uitdaging bij het gebruik van geavanceerde, eencellige technologieën is het werken met bijzonder fragiele of zeldzame celpopulaties. Elk weefsel- of celtype moet een nauwkeurig afgestemde protocoloptimalisatie ondergaan om voldoende zeer levensvatbare cellen te verkrijgen die zich vertalen in sequentiegegevens van hoge kwaliteit.
Ons aangepaste protocol voor de bereiding van enkele kernen verbetert het herstel van de kernen en minimaliseert de spanning op de kernen. Het is specifiek geoptimaliseerd voor hersen- en beenmergweefsels en omvat alle stappen van monsterdissociatie tot zuivering van kernen.
Overzicht
Deze studie richt zich op de optimalisatie van nuclei-isolatie uit hersen- en beenmergweefsels voor daaropvolgende single-nuclei multiome-assays. Het belang van kwalitatief hoogwaardige nuclei-extractie wordt benadrukt vanwege de impact hiervan op single-cell transcriptomics en multi-omics analyses.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Single-cell transcriptomica
- Multi-omics
- Nucleï-isolatietechnieken
Achtergrond
- Het succes van transcriptomics is afhankelijk van de zuiverheid en kwaliteit van de geïsoleerde cellen/kernen.
- Recente vorderingen in flowcytometrie en beeldgebaseerde technologieën verbeteren de mogelijkheden voor cel sortering.
- Voor fragiele of zeldzame celpopulaties is speciale aandacht nodig, wat geoptimaliseerde protocollen vereist.
Gebruikte methoden
- Gemodificeerd protocol voor de preparatie van kernen uit hersen- en beenmergweefsels
- Muismodel-systeem
- Technieken omvatten flowcytometrie en geautomatiseerde celtelling
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde herstelsnelheden van kernen met minimale stress tijdens de preparatie.
- De zuiverheid van hersenkernen steeg van 36% naar bijna 100% na sortering.
- Een betrouwbare workflow is opgezet voor het prepareren van kernen voor sequencing-gegevens van hoge kwaliteit.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een effectief protocol voor het isoleren van hoogzuivere kernen uit specifieke weefsels.
- De bevindingen hebben belangrijke implicaties voor het verbeteren van single-cell multi-omische analyses in onderzoek naar gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Een hoogwaardige preparatie van kernen uit hersen- en beenmergweefsel vormt de basis voor robuuste single-nuclei multiome-assays, wat direct van invloed is op de betrouwbaarheid van transcriptomische en epigenetische profilering tijdens de vroege ontdekkingsfase. Gestandaardiseerde protocollen voor kernisolatie maken een consistente datageneratie mogelijk, wat de voorspellende betrouwbaarheid vergroot en mechanistische risico's vermindert bij studies naar complexe weefsels. Deze capaciteit is cruciaal voor de verdere ontwikkeling van ziekterelateerde modellen en het versnellen van portfoliobeslissingen in het neurobiologisch en hematologisch onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar celtypespecifieke transcriptionele en epigenetische toestanden in complexe weefsels.
- Ondersteunt functionele doelwitvalidatie door nuclei van hoge integriteit te leveren voor multi-omische readouts.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door reproduceerbare monsterpreparatie en datakwaliteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde kernsuspensies die zijn geoptimaliseerd voor downstream 10X Genomics multiome workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door monster-variabiliteit te minimaliseren.
- Maakt schaalbare preparatie van kernbibliotheken mogelijk voor high-throughput screening van verbindingen of perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziektespecifieke weefselmodellen voor de translationele ontdekking van biomarkers.
- Waarborgt continuïteit van de ontdekkingsfase tot aan de preklinische validatie door de kwaliteit van de kernen over verschillende experimenten heen te behouden.
- Vermindert het risico op technische artefacten die de interpretatie van preklinische gegevens kunnen beïnvloeden.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor de preparatie van kernen vormt de schakel tussen weefselverwerking en single-nuclei multiome sequencing en ondersteunt workflows van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek.
- Discovery Biology: Levert hoogwaardige kernen voor hypothesetoetsing en padanalyse in hersen- en beenmergweefsels.
- Screening: Garandeert assay-gereedheid en reproduceerbaarheid voor multiomische profileringsplatforms.
- Analytics: Levert kwantitatieve metrieken voor de kernkwaliteit om downstream data-analyse en de vergelijking van condities te informeren.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de uitlijning van biomarkers en de getrouwheid van ziektemodellen door de integriteit van kernen te behouden.
- Bedrijfbrede Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar protocol dat aanpasbaar is aan diverse weefseltypes en studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in multi-omische studies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor nuclei-isolatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door betrouwbare data-inputs te waarborgen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van neurobiologie- en hematologieprogramma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissociatie, isolatie van kernen en kwaliteitscontrolebeoordeling.
- Vereist toegang tot flowcytometrie, geautomatiseerd celttellen en sequencing-infrastructuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid tussen studies en locaties te waarborgen.
- Kan protocolaanpassingen vereisen voor verschillende weefseltypen of soorten.
- Afhankelijk van het behoud van de levensvatbaarheid en integriteit van de kernen tijdens de verwerkingsstappen.
