Name: Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Leer de isolatie en karakterisatie van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen. Dit protocol toont hun therapeutisch potentieel bij ontstekingsziekten zoals Schistosoma mansoni-infectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek ondersteund door een subsidie van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) en Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG en URS dankzij de beurs verleend door respectievelijk Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Primaire cultuur van van vetweefsel afgeleide stamcellen van bijbal van muizen

<ol><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).</li>
<li>Pittenger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+perspective%3A+cell+biology+to+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress.</a> npj Regen Med. 4, 22(2019).</li>
<li>Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+cancer%3A+Clinical+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities.</a> BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).</li>
<li>Mazini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hopes+and+limits+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSCs%29+and+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing.</a> Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanisms+of+mesenchymal+stem+and+stromal+cells+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).</li>
<li>Uccelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue-derived+small+extracellular+vesicles+promote+soft+tissue+repair+through+modulating+M1-to-M2+polarization+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).</li>
<li>Maffioli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+primed+by+pro-inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines.</a> J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-stem-cell-induced+immunoregulation+involves+FAS-ligand-%2FFAS-mediated+T+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis.</a> Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+mesenchymal+stem+cells+in+immunomodulation%3A+pathological+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications.</a> Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+vs.+autologous+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+in+their+medication+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice.</a> Cell Biosci. 11, 187(2021).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+and+promises+of+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+use+as+a+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).</li>
<li>Jurado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+as+part+of+therapy+for+chronic+graft-versus-host+disease%3A+A+phase+I%2FII+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study.</a> Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosome-educated+macrophages+alleviate+systemic+lupus+erythematosus+by+promoting+efferocytosis+and+recruitment+of+IL-17%2B+regulatory+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).</li>
<li>Fernández, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28AdMSC%29+for+the+treatment+of+secondary-progressive+multiple+sclerosis%3A+A+triple+blinded%2C+placebo+controlled%2C+randomized+phase+I%2FII+safety+and+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study.</a> PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).</li>
<li>Abdolmohammadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-based+therapy+as+a+new+therapeutic+approach+for+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation.</a> Life Sci. 312, 121206(2023).</li>
<li>Hoang, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for human diseases.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue.</a> Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).</li>
<li>Strem, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue+derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li>
<li>Kern, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li>
<li>Dominici, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Berryman, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone%27s+effect+on+adipose+tissue%3A+Quality+versus+quantity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).</li>
<li>Shomer, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+rodent+euthanasia+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Review of rodent euthanasia methods.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).</li>
<li>Miranda, V. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+damage+in+schistosomiasis+is+reduced+by+adipose+tissue-derived+stem+cell+therapy+after+praziquantel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment.</a> PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primary+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells.</a> Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).</li>
<li>Boregowda, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).</li>
<li>Sreejit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Cells. 10 (12), 3433(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De MSC's kunnen uit verschillende weefsels worden geëxtraheerd. Ondanks dat beenmerg een veel voorkomende bron van MSC's vertegenwoordigt bij zowel muizen als mensen25,26, hebben we ervoor gekozen om in deze studie met vetweefsel te werken vanwege de rijkdom aan MSC's, de distributie in het lichaam en de gemakkelijke toegang ertoe. Als alternatief kunnen van vet afgeleide stamcellen worden gebruikt om MSC's-achtige onsterfelijke cellen te genereren27.
Sommige punten van de extractie verdienen speciale aandacht voor het succes van de hier gedeelde protocollen. Ten eerste benadrukken we de zorg om het weefsel te verzamelen dat in aseptische omstandigheden moet worden gedaan. Zorg er dus voor dat de muizen goed worden gedesinfecteerd met 70% alcohol voordat u met de operatie begint. Een ander belangrijk punt is om niet dezelfde set pincetten en scharen te gebruiken om het epididymale vetweefsel op te pakken, waardoor elke besmettingsbron wordt vermeden. 
Een tweede punt van zorg is de verwerking van weefsel. De fragmenten in de conische buis moeten goed en krachtig worden geschud met 10 minuten incubatie bij 37 °C. Het is erg belangrijk om het medium de volgende dag te vervangen en vervolgens om de 2-3 dagen. Het wordt aanbevolen om de cultuur dagelijks te observeren en de gemiddelde kleur, celvorm en eventuele interferentie in de omgeving van de cultuur te controleren. 
Een derde zorg betreft de beste tijd/passage voor MSC-karakterisering. Hier raden we aan om het bij de derde doorgang van cellen te doen, maar dit is niet verplicht. Het hangt af van het doel van het onderzoek. In de derde passage hebben we ongeveer 80% van de cellen gekarakteriseerd als MSC's, wat genoeg is voor de doelstellingen van deze studie bijvoorbeeld. De fenotypische karakterisering wordt uitgevoerd door de expressie van hematopoëtische markers (bijvoorbeeld CD34 en CD45) en mesenchymale markers (bijvoorbeeld CD29, CD73, CD90 en CD105) te analyseren. Bovendien benadrukt de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)21 dat de ADSC's een fibroblastachtige morfologie moeten hebben en zich moeten houden aan het plastic van het kweekplatform. De morfologie kan tijdens de groeicultuur onder een microscoop worden waargenomen. De functionele karakterisering wordt uitgevoerd door het potentieel van ADSC's te analyseren om te differentiëren in osteoblast-, adipoblast- en chondroblastcellen. In de fenotypische karakterisering kan het percentage mesenchymale en hematopoëtische markers variëren afhankelijk van de diersoort en de celbron, en niet volledig voldoen aan de door het ISCT aanbevolen aantallen. De ISCT beveelt bijvoorbeeld voor menselijke MSC's ≥95% van CD105, CD73, CD90 en ≤2% van CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79a of CD19 aan, humaan leukocytenantigeen - DR-isotype (HLA-DR)21. Bovendien is het belangrijk om de functionele karakterisering uit te voeren en de multipotentie van cellen te bevestigen die differentiëren tot osteoblasten, chondrocyten en adipocyten. Ten minste twee van deze afstammingslijnen worden aanbevolen om multipotentie te bewijzen. 
Naast deze gemarkeerde punten kunnen sommige hier voorgestelde tests worden vervangen, bijvoorbeeld Alizarin Red S in plaats van Von Kossa-kleuring, Periodic Acid Shiff in plaats van Alcian Blue en polymerasekettingreactie (PCR) in plaats van flowcytometrie. 
Van de drie soorten vetweefsel die bij mensen worden beschreven (wit, bruin en beige), heeft wit vetweefsel de hoogste bron van MSC's28. Dit weefsel kan worden verkregen uit onderhuidse, abdominale en liesstreek, zoals het vet boven de hier gerapporteerde bijbal. De fysieke fragmentatie en enzymatische vertering door collagenase die in het hier gedeelde protocol wordt gebruikt, leiden de stromale vasculaire fractie (SVF) af die bestaat uit vele celtypen, behalve de adipocyten, die tijdens de verwerking uitgeput raken. 
Concluderend zijn de belangrijkste voordelen van het gebruik van vetweefsel als bron van MSC's onder meer hun overvloed en het gemak van methoden voor celisolatie, geassocieerd met het therapeutisch potentieel van de MSC's als ontstekingsremmende en regeneratieve eigenschappen.

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn volwassen multipotentiaalcellen die differentiëren tot cellen zoals osteoblast, chondroblast en adipocyt 1,2. Deze cellen bevinden zich in verschillende organen en kunnen daarom worden geëxtraheerd uit volwassen weefsels zoals beenmerg, spieren, vet, haarzakjes, tandwortel, placenta, dermis, perichondrium, navelstreng, long, lever en milt 3,4.
De effecten van MSC's op de fysiologie en het immuunsysteem zijn gerapporteerd 5,6. Deze cellen zijn veelbelovend voor de behandeling van verschillende ziekten, zowel in de menselijke als in de diergeneeskunde. De MSC's kunnen ontstekingen onder controle houden en angiogenese en weefselhomeostase bevorderen via verschillende mechanismen, zoals cel-celcontact, oplosbare factoren en kleine extracellulaire blaasjes 7,8,9,10. Bovendien zijn de MSC's immuunbevoorrechte cellen die in staat zijn om te overleven in immunologisch onverenigbare allogene transplantatieontvangers, omdat deze cellen een lage expressie vertonen van klasse I major histocompatibility complex (MHC)-moleculen en worden gebruikt in celgebaseerde therapie voor allogene transplantatie11,12. De lage immunogeniciteit in combinatie met het regeneratieve potentieel maakt MSC's ideale kandidaten voor celtherapie, zoals graft-versus-host-ziekte (GvHD)13, systemische lupus erythematosus (SLE)14 en multiple sclerose15, onder andere16,17.
Ondanks het feit dat MSC's zich in verschillende volwassen weefsels bevinden, biedt het vetweefsel voordelen ten opzichte van andere bronnen, zoals toegankelijkheid voor oogsten, met minimale chirurgische ingrepen; groot aantal beschikbare cellen met hoge uitzettingssnelheid; en eenvoudige in-vitro-uitbreiding met behulp van een eenvoudig uit te voeren protocol zonder de noodzaak van specifieke apparatuur en goedkope materialen 18,19,20. Eenmaal geëxtraheerd, moeten de van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) worden gekarakteriseerd zoals vastgesteld door de International Society for Cellular Therapy (ISCT)21. MSC's moeten dus morfologie fibroblastachtige, gehechtheid aan plastische cultuur vertonen, waarbij een hoog percentage (≥95%) mesenchymale markers zoals endoglin (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) en Thy-1 (CD90) tot expressie worden gebracht, en een laag percentage (≤2%) hematopoëtische markers zoals leukocyt gemeenschappelijk antigeen (CD45), transmembraanfosfoglycoproteïne (CD34), glycolipide-verankerd membraanglycoproteïne (CD14), integrine alfa M (CD11b), B-celantigeenreceptorcomplex-geassocieerde eiwit-alfaketen (CD79α) of B-lymfocytenoppervlakteantigeen B4 (CD19) en klasse II humaan leukocytenantigeen (HLA-II). Bovendien is een functionele karakterisering vereist en moeten de cellen in staat zijn om te differentiëren tot osteoblast-, chondroblast- of adipoblastcellen21.
Hier laten we zien hoe de MSC's uit epididymaal vetweefsel kunnen worden verkregen met behulp van mechanische dissociatie en enzymatische vertering voor in vitro-studies en de morfologische karakterisering die is gepreconconiseerd door ISCT.

<table><tbody><tr><td>140 &deg;C High Heat Sterilization CO2 Incubator</td><td>RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China</td><td>C180</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid glacial</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1748</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>A9186</td><td>BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5</td></tr><tr><td>Alcohol 70%</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>65350-M</td><td>70% in water</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>555005</td><td>Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells</td></tr><tr><td>Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>551387</td><td>Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells</td></tr><tr><td>Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>559864</td><td>Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes</td></tr><tr><td>Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>553266</td><td>Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors</td></tr><tr><td>Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>557266</td><td>Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1008</td><td></td></tr><tr><td>Automatic pipettes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>4700850N</td><td>Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Niet van toepassing</td><td></td><td>1 eenheid</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates (6-well)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>Z707759</td><td>07 eenheden steriele. TPP weefselkweekplaten</td></tr><tr><td>Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>CLS353077</td><td>01 eenheid steriele. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-behandeld oppervlak, ronde bodem heldere wells, steriele</td></tr><tr><td>Chondrogenic medium</td><td>Stem Pro Chondrogenesis Differentiation&ndash;Life Technologies</td><td>A1007101</td><td>TGF-&beta;2, TGF-&beta;3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-fosfaat</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Life Technologies, California, USA</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>kurk- of piepschuimbord bedekt met aluminium</td><td>Niet van toepassing</td><td></td><td>1 eenheid</td></tr><tr><td>katoen</td><td>Niet van toepassing</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Niet van toepassing</td><td></td><td>03 eenheden steriele</td></tr><tr><td>DPX-bevestigingsmiddel voor histologie</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gewijzigd Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>D5523</td><td>Met 1000 mg/L glucose en L-glutamine, zonder natriumbicarbonaat, poeder, geschikt voor celkweek</td></tr><tr><td>Eosine B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>861006</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>Formaline</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermische naald (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Niet van toepassing</td><td></td><td>5 eenheden</td></tr><tr><td>Indomethacine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>I0200000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>563935</td><td>70% in H2O</td></tr><tr><td>Ketamine-D4 hydrochloride oplossing</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>K-006</td><td>1,0 mg/mL in methanol (als vrije base), gecertificeerde referentiemateriaal, Cerilliant&reg;</td></tr><tr><td>Neubauer kamer</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>BR718620</td><td>BRAND tellingskamer BLAUBRAND Neubauer patroon. Met clips, dubbel geregeld</td></tr><tr><td>Nichiryo pipettentips (0,1&ndash;10 &mu;L)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>Z645540</td><td>Volumebereik 0,1&ndash;10 &mu;L, langwerpig, bulkpack. Steriele</td></tr><tr><td>Nichiryo pipettentips (1&ndash;10 mL)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>Z717401</td><td>Volumebereik 1&ndash;10 mL, universeel, bulkpack. Steriele</td></tr><tr><td>Nichiryo pipettentips (200 &mu;L)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>Z645516</td><td>Maximaal volume 200 &mu;L, gradueel, ministack. Steriele</td></tr><tr><td>Oil-Red O oplossing</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>O1391</td><td>0,5% in isopropanol</td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>107.151</td><td>46&ndash;48, in blokvorm</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>P4333</td><td>Oplossing gestabiliseerd, met 10.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine/mL, 0,1 &mu;m gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing 1x (PBS).</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>P3813</td><td>Poeder, pH 7

isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn uitgebreid bestudeerd als een nieuwe therapeutische benadering, voornamelijk om verergerde ontstekingen te stoppen vanwege hun potentieel om de immuunrespons te moduleren. De MSC's zijn immuunbevoorrechte cellen die in staat zijn om te overleven in immunologisch onverenigbare allogene transplantatieontvangers op basis van lage expressie van klasse I major histocompatibility complex (MHC)-moleculen en bij het gebruik van celgebaseerde therapie voor allogene transplantatie. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende weefsels, waarvan het beenmerg en vetweefsel de meest worden gebruikt. We bieden een eenvoudig protocol om MSC's te isoleren, te kweken en te karakteriseren uit epididymaal vetweefsel van muizen. Het epididymale vetweefsel wordt chirurgisch weggesneden, fysiek gefragmenteerd en verteerd met 0,15% collagenase type II-oplossing. Vervolgens worden primaire vetweefsel-afgeleide stamcellen (ADSC's) gekweekt en in vitro geëxpandeerd, en wordt de fenotypische karakterisering uitgevoerd door middel van flowcytometrie. We bieden ook de stappen om de ADSC's te differentiëren in osteogene, adipogene en chondrogene cellen, gevolgd door functionele karakterisering van elke cellijn. Het hier verstrekte protocol kan worden gebruikt voor in vivo en ex vivo experimenten, en als alternatief kunnen de van vet afgeleide stamcellen worden gebruikt om MSC's-achtige onsterfelijke cellen te genereren.

Cellen geëxtraheerd uit vetweefsel volgens het hier gepresenteerde protocol vertoonden een morfologie die voldeed aan de minimale criteria voor MSC's voorgesteld door ISCT. Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Fenotypisch vertoonden ADSC's in de eerste dagen van de celkweek aanhankelijkheid aan plastische en fibroblastachtige morfologie (Figuur 2A). Bovendien groeiden ze homogeen en vormden ze kolonies. Bovendien vertoonden ADSC's een lage expressie van CD34 (2,12%) en CD45 (1,81%), beide hematopoëtische markers, en een hoge expressie van CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) en CD90 (55,1%), allemaal mesenchymale celmarkers (Figuur 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig02.jpg"> Figuur 2: Fenotypische karakterisering van van vetweefsel afgeleide cellen. (A) De morfologie van ADSC's verandert van rond naar fibroblastachtig op dag 2, 4 en 8 van de kweek; schaalbalk = 22,22 μm. (B) Histogrammen voor markers die al dan niet (CD71, CD29 en CD90) door ASC worden uitgedrukt (CD34 en CD45). Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Miranda et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Functioneel gezien vertoonden ADSC's multipotentie om te differentiëren in osteoblast, adipoblast en chondroblast wanneer ze gedurende 14 of 21 dagen in geconditioneerde media voor elke afstamming werden gekweekt (Figuur 3). De Von Kossa-kleuring onthulde gemineraliseerde knobbeltjes in de extracellulaire matrix, kenmerkend voor het osteogeneseproces (Figuur 3). De olierode O-kleuring toonde lipidevacuolen aan in het cytoplasma van ADSC's, en de Alcian Blue-kleuring bevestigde de aanwezigheid van glycosaminoglycaan in de extracellulaire matrix (Figuur 3). Samen hebben fenotypische en functionele kenmerken de populatie van cellen die uit epididymaal vetweefsel worden geëxtraheerd als MSC's bevestigd.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig03.jpg"> Figuur 3: Functionele karakterisering van van vetweefsel afgeleide cellen. Osteogene, adipogene en chondrogene multiafstammingspotentieel van ADSC na 14 en 21 dagen op kweek. Schaalbalk = 50 μm (bovenste paneel), 100 μm (middelste en onderste panelen). Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Miranda et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied as a new therapeutic approach, mainly to stop exacerbated inflammation due to their potential ...

Mijn onderzoek richt zich op van vet afgeleide mesenchymale stamcellen als een nieuwe benadering, behandeling die al dan niet geassocieerd is met andere therapieën om de ontsteking van verschillende ziekten te verbeteren. We hebben aangetoond dat het gebruik van vetmesenchymale stamcellen in combinatie met Praziquantel de granulomateuze reactie bij een Schistosoma mansoni-infectie significant heeft gecontroleerd, wat de voordelen van deze gecombineerde behandelingsaanpak benadrukt. Ons protocol pakt de onderzoekslacune aan in de nauwgezette verzameling van epididymaal vetweefsel onder aseptische omstandigheden, dat de fysieke verwerking gepaard gaat met krachtig schudden, en identificeert de optimale tijd voor het gebruik van van vet afgeleide stamcellen.Ons protocol biedt aanzienlijke voordelen, met name de overvloedige beschikbaarheid en de potentiële sterkte voor isolatie van mesenchymale stamcellen. Bovendien hebben mesenchymale stamcellen krachtige therapeutische eigenschappen, waaronder ontstekingsremmende en weefselregeneratiemogelijkheden.

isolation-vitro-expansion-characterization-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.

Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen een potentiële bron zijn van MSC's die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC's bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC's van dezelfde rat Ad-MSC's.

Isolatie van rat vetweefsel Mesenchymale stamcellen voor differentiatie in insulineproducerende cellen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

In dit artikel tonen we de isolatie van murine inwoner long mesenchymale stamcellen (MSC long), hun expansie, karakterisering en analyse van immunomodulerende eigenschappen.

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Leer de isolatie en karakterisatie van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen. Dit protocol toont hun therapeutisch potentieel bij ontstekingsziekten zoals Schistosoma mansoni-infectie.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Meer video's verkennen