Name: Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Leer micro-injectie van RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens voor onderzoek naar eiwitexpressie tijdens lensontwikkeling. Deze methode biedt snelle, flexibele in vivo analyse van genfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (aan J.X.J) en F32DK134051 (aan FMA), en Welch Foundation grant: AQ-1507 (aan J.X.J.). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De figuren zijn gedeeltelijk gemaakt met Biorender.com.

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de Wet dierenwelzijn en de Uitvoeringsregeling dierenwelzijn volgens de principes van de Handreiking verzorging en gebruik van proefdieren. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Health Science Center van de Universiteit van Texas in San Antonio. Voor een overzicht van het protocol, zie figuur 1; zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig01.jpg"> Figuur 1: Experimenteel overzicht. 1 . De eerste stap van het protocol is de bepaling van een of meer specifieke doeleiwitten, de identificatie van de bijbehorende gensequentie(n) en het genereren van DNA-fragmenten. 2 . Klonering van de gensequentie(n) in een retrovirale vector door initiële klonering in een adaptervector, 3. gevolgd door een virale vector . 4 . Bereiding van virale deeltjes met een hoge titer met behulp van verpakkingscellen om te oogsten en te concentreren. 5 . De laatste stap, en de focus van dit protocol, is de micro-injectie van de RCAS(A)-virusdeeltjes in het lenslumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Bereiding van recombinante retrovirussen met een hoge titer
<ol><li>Polymerasekettingreactie (PCR) om DNA-fragmenten van doeleiwitten te maken OPMERKING: Deze sectie is bedoeld om de DNA-sequentie te amplificeren die overeenkomt met het doellenseiwit. Voor meer details, zie 7,8.<ol><li>Ontwerp primers voor PCR, overeenkomend met het eiwit van belang, om DNA-fragmenten te maken met hun carboxyl-termini in frame met of zonder een FLAG-epitoopsequentie (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), een stopcodon en een restrictie-enzymplaats (d.w.z. EcoRI) aanwezig in het polylinkergebied van CLa12NCO)) volgens de specificaties die zijn vermeld in eerder gepubliceerde protocollen, met sequenties voor adequate restrictie-enzymen1, 7,8,10,11.</li>
		<li>Voer de PCR-reactie10 uit. Combineer 100 pmol sense en antisense van de ontworpen primers met 0,5 μg connexine cDNA (zoals Cx50, Cx43 of chimere Cx50*43L-combinaties) tot de PCR-reactiebuffer naar keuze. Voer 30 cycli uit, elk bestaande uit 94 °C gedurende 1 min, 58 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging gedurende 10 minuten bij 72 °C.</li>
		<li>Isoleer en zuiver PCR-producten met een gelzuiveringskit.</li>
		<li>Verbeter de gezuiverde PCR-producten met behulp van restrictie-enzymen naar keuze volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonen van DNA-inserts in adaptorplasmide OPMERKING: Het inbrengen van DNA-fragmenten in een adaptervector elimineert de noodzaak voor helpercellen/virussen om de stabiliteit van de RCAS(A)-vector te verhogen14. Voor meer details, zie 7,8.<ol><li>Subkloon DNA fragmenteert in een adapterplasmide, Cla12NCO met behulp van een kleverige ligatiereactie. Meng de PCR-fragmenten met restrictie-enzymen en Cla12NCO in een verhouding van 2-5:1. Voer ligatie en DNA-transformatie uit met behulp van competente cellen.</li>
		<li>Isoleer DNA met behulp van een DNA-isolatiekit.</li>
		<li>Sequentie van het DNA om nauwkeurigheid te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonen in de RCAS(A) virale vector OPMERKING: DNA-fragmenten worden ingebracht in een vehiculum (RCAS(A)-retrovirus) voor de stabiele transductie van een gen in cellen in het zich ontwikkelende kuikenembryo14,15. Voor meer details, zie 7,8,15.<ol><li>Verwerk het Cla12NCO-DNA-fragment van belangbevattende vector met ClaI (1 eenheid per 1 μg DNA) en gel-isoleer de fragmenten.</li>
		<li>Subkloon de DNA-fragmenten in een ClaI-gelineariseerd RCAS(A)-plasmide. Gebruik het restrictie-enzym SalI om de ClaI-plaats op het RCAS(A)-plasmide te onderscheiden.</li>
		<li>Bevestig de juiste oriëntatie van de ingebrachte fragmenten op de constructen door vertering met ClaI- en SalI-restrictie-enzymen.</li>
		<li>Isoleer DNA met behulp van een DNA-isolatiekit.</li>
		<li>Bepaal de DNA-concentratie.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfectie van kuikenembryonale fibroblastcellen (CEF) en RCAS(A)-oogst OPMERKING: Virusverpakkingscellen, CEF's, worden gebruikt om celkweekmedia te verkrijgen/oogsten die virale deeltjesbevatten 15,16. Voor meer details, zie 7,8,15.<ol><li>Transfecte CEF-cellen met recombinante retrovirale DNA-constructen met behulp van het transfectiemiddel volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Voer western blotting uit van de getransfecteerde cellen om hun expressie van het eiwit van belang te onderzoeken.</li>
		<li>Wanneer de getransfecteerde cellen samenvloeiing bereiken, begint u met het verzamelen van het supernatantmedium, het op de juiste manier verwerken/filteren (om cellulair afval te verwijderen met behulp van een filter van 0,22 μm) en bewaren bij -80 °C totdat het klaar is voor concentratie.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentratie en titering van virale voorraden OPMERKING: De pellet en grote hoeveelheden media afkomstig van de cellen die de virale deeltjes bevatten, moeten worden gefilterd. Bovendien moet een virale titertest worden uitgevoerd om de sterkte van het virus tegen de gastheercellen vast te stellen. Voor meer details, zie 6,7,8,15.<ol><li>Ontdooi de kweekmedia die de virionen bevatten.</li>
		<li>Centrifugeer de voedingsbodems op 72.000 × g gedurende 2 uur bij 4 °C.</li>
		<li>Decanteer het supernatans en resuspendeer de virale pellet met het resterende (~50 μL) medium en bewaar bij -80 °C tot gebruik, in ~10 μL virale voorraden.</li>
		<li>Voor titeren, met behulp van QT-6- of CEF-cellen, transfecteert u de cellen met een seriële verdunning van de virale voorraden.</li>
		<li>Na confluentie fixeert u de cellen met 4% formaldehyde.</li>
		<li>Immunokleuring voor virale gag-eiwitten of proces voor alkalische fosfatase histochemisch om de titer te verkrijgen, gedefinieerd als (kolonievormende eenheden) CFU per milliliter (CFU/ml).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig02.jpg"> Figuur 2: Instrumenten en opstelling voor micro-injectie van kuikenslenzen . (A) P-30 handmatige verticale micro-elektrode micropipettrekker. (1) inzet waarop een glazen micropipet wordt getrokken die wordt getrokken. (b) (2) Broedmachine. Broed kippenei gedurende ~65-68 uur uit in een incubator van 37 °C om stadium 18 te bereiken (met een verzegeld, leeg centraal lumen) voor injectie van retrovirus. (C) Opstelling met micro-injectie. (3) verlichtingsapparatuur, (4) Pico-Injector, (5) ontleedmicroscoop, (6) Drummond micromanipulator, (7) computer/camera voor visualisatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
2. Micro-injectie van kuikenlens
<ol><li>Voorbereiding van benodigdheden<ol><li>Bereiding van glazen micropipetten voor micro-injectie17 OPMERKING: Glazen capillairen worden gebruikt om glazen micropipetten te maken met een tippunt en een buitendiameter (OD) van ~11 μm voor micro-injectie. De opstelling is weergegeven in figuur 2A.<ol><li>Bevestig het capillair van borosilicaatglas aan de met rubber beklede clips in de handmatige verticale micropipettrekker.</li>
			<li>Stel de warmtetemperatuur (HEAT 1) in op 950 °C en voer een voortrekken uit om een dunner en zachter glascapillair te verkrijgen.</li>
			<li>Stel de warmtetemperatuur (HEAT 2) in op 790 °C en trek secundair om de uiteindelijke micropipetten te produceren.</li>
			<li>Slijp met een micropipetmolen de puntopening tot een buitendiameter van ~11 μm.</li>
			<li>Bewaar de glazen micropipetten voor toekomstige experimenten in een sponsklemkussen in een glazen pot.</li>
		</ol></li>
		<li>Incubatie van bevruchte eicellen tot ontwikkelingsstadium 18 OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van de lens, bij ~65-68 uur embryonale ontwikkeling, scheidt de lens zich van het ectoderm en vormt een afgesloten blaasje met een centraal lumen; Injectie in dit lege lenslumen primeert voor beperkte expressie tot proliferatieve lenscellen 7,8,18.<ol><li>Bevruchte kippeneieren gedurende ~65-68 uur uitbroeden in een bevochtigde schommelbroedmachine van 37 °C (Figuur 2B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Opening van het kippenei OPMERKING: Deze stap beschrijft de identificatie en blootstelling van het embryo voor micro-injectie. Voor meer details, zie 7,8.<ol><li>Veeg het werkgebied grondig af met 70% ethanol.</li>
		<li>Haal de eieren uit de broedmachine, spuit ze zwaar in met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.</li>
		<li>Leg het ei, met het grotere uiteinde van het ei naar boven, op een eierhouder.</li>
		<li>Maak met een pincet met scherpe tanden een gat met een diameter van ~2 cm aan het grotere uiteinde van het ei door voorzichtig op de eierschaal te tikken en fragmenten van de eierschaal te verwijderen (Figuur 3A).</li>
		<li>Gebruik een ontleedmicroscoop om het embryo te lokaliseren.</li>
		<li>Zodra het embryo en de kuikenlens zijn gelokaliseerd, gebruikt u de ontleedmicroscoop en een fijne ontleedtang en schaar om het vruchtwater af te snijden dat onmiddellijk de bovenkant van het embryo bedekt (Figuur 3B). OPMERKING: Snijd niet te ver (alleen genoeg om het embryo ~ 0,5 cm x 0,5 cm bloot te leggen), anders kunnen de embryo's in de dooiermassa zinken; Vermijd indien mogelijk ook het aanraken van bloedvaten.</li>
		<li>Bedek de opening van het ei met een petrischaaltje van 60 mm ter voorbereiding op de volgende stappen.</li>
	</ol></li>
	<li>Micro-injectie van geconcentreerde virale voorraad OPMERKING: Virale deeltjes die DNA-fragmenten van doeleiwitten voor transductie bevatten, worden ingebracht in cellen in het lenslumen. De opstelling is weergegeven in figuur 2C. Voor meer details, zie 6,7,8.<ol><li>Ontdooi de virale voorraadvoorraden op ijs.</li>
		<li>Voor visualisatie van de virale voorraad tijdens injectie, verdunt u 1 μL van 10x Fast green in één injectieflacon met virale voorraad die 10 μL bevat.</li>
		<li>Om er zeker van te zijn dat er geen grote brokken onopgelost materiaal zijn die de glazen micropipet kunnen verstoppen, centrifugeert u de oplossingen gedurende 10 s bij 10.000 × g bij 4 °C om "grote brokken" te pelleteren en de supernatanten over te brengen in nieuwe buizen, terwijl de oplossingen op ijs blijven.</li>
		<li>Plaats op een kweekschaal van 35 mm x 10 mm een uitgerekte laboratoriumparafilm en voeg 1 μL steriele zoutoplossing (PBS) toe aan de film (niet-gesteriliseerd, waarbij de afgedekte kant als "schoon" wordt beschouwd).</li>
		<li>Sluit een geprepareerde glazen micropipet aan op een automatische pico-injector.</li>
		<li>Druk op de vulmodus om de steriele zoutoplossing (PBS) in een glazen micropipet te vullen en gebruik vervolgens de injectiemodus om de toegewezen 1 μL vloeistof te testen.</li>
		<li>Plaats een tweede uitgerekte laboratoriumparafilm op het oppervlak van een nieuwe celkweekschaal van 35 mm x 10 mm en voeg 1 μL Fast groen gekleurde virale voorraden toe aan de film.</li>
		<li>Laat de punt van de micropipet in de virale voorraad zakken en druk op het vulmodel om de glazen micropipet te vullen met ~1 μL virale voorraad. NOTITIE: Om uitdroging te voorkomen, plaatst u de punt van de gevulde micropipet in steriele zoutoplossing (PBS) wanneer er een pauze in de procedure is.</li>
		<li>Laat de gevulde glazen micropipet, aangesloten op een automatische injector, met behulp van een ontleedmicroscoop in het doelgebied van het lumen van de embryolens zakken.</li>
		<li>Pas de lichtbron aan om een duidelijke visualisatie van de omtrek van het lensblaasje te garanderen. OPMERKING: Het lumen van de rechterlens (naar boven gericht) wordt meestal gebruikt voor injectie en het linker (naar beneden gericht) wordt intact gehouden als contralaterale controle.</li>
		<li>Zodra u er zeker van bent dat de micropipet op de juiste plaats in het lenslumen is geplaatst, injecteert u 5-40 nL van de virale voorraad (Figuur 3C). OPMERKING: Oefening is zeer noodzakelijk voor een optimale plaatsing van de injectie.</li>
		<li>Wacht ~45 s en verwijder dan voorzichtig de glazen micropipet.</li>
		<li>Controleer met behulp van de ontleedmicroscoop of de micro-injectie in het lenslumen is gelukt door Fast Green-kleurstof te onderzoeken die zonder lekkage in het lege lumen van de lens moet blijven.</li>
		<li>Sluit na de injectieprocedure de opening van de eierschaal af met plakband.</li>
		<li>Breng het embryo terug naar de 37 °C bevochtigde couveuse, zonder draaiende beweging, totdat de gewenste embryonale leeftijd is bereikt voor lensdissectie.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig03.jpg"> Figuur 3: Voorbereiding van kuikens met micro-injectie en schema . (A) Opening van een kippenei. (B) Doorsnijden van het vruchtwater. (C) Kippenlens lumen micro-injectie schema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het bestuderen van eiwitexpressie tijdens de ontwikkeling van kippenlenzen

<ol><li>Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+potent+embryonic+chick+lens+model+for+studying+congenital+cataracts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo.</a> Communications Biology. 4 (1), 325(2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Crystallins+of+the+chicken+lens%3A+remnants+of+an+ancient+vertebrate+gene+family+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds.</a> The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).</li>
<li>Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+development.+I.+Role+of+the+lens+in+eye+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Lens development. I. Role of the lens in eye growth.</a> Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).</li>
<li>McKeehan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+portions+of+the+chick+lens+without+contact+with+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup.</a> The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).</li>
<li>Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+effect+of+BAFF+on+chicken+B+cell+development+revealed+by+RCAS+retroviral+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo.</a> Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).</li>
<li>Fekete, D. M., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+retroviral+vectors+encoding+alkaline+phosphatase+reveal+spatial+restriction+of+viral+gene+expression%2Ftransduction+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).</li>
<li>Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+retroviruses+to+express+connexins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of retroviruses to express connexins.</a> Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).</li>
<li>Jiang, J. X., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+of+connexins+in+embryonic+chick+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).</li>
<li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+autofluorescent+proteins+reveals+a+novel+protein+permeable+pathway+between+cells+in+the+lens+core%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core.</a> Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).</li>
<li>Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+0+enhances+gap+junction+coupling+via+its+cell+adhesion+function+and+interaction+with+connexin+50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50.</a> Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+extracellular+domain+of+connexin+50+is+important+for+in+cell+adhesion%2C+lens+differentiation%2C+and+adhesion+molecule+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).</li>
<li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+gene+expression+and+protein+targeting+in+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).</li>
<li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organization+of+primary+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organization of primary lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).</li>
<li>Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptor+plasmids+simplify+the+insertion+of+foreign+DNA+into+helper-independent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors.</a> Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).</li>
<li>Yan, R. T., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+RCAS+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer RCAS retrovirus.</a> Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).</li>
<li>Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+macrophage+activation+in+immune-privileged+lens+through+CSF-1+protein+intravitreal+injection+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+and+regulatory+status+of+food%2C+drug+and+cosmetics+colour+additives+exempt+from+certification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification.</a> Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).</li>
<li>Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+differentiation+by+chicken+lens+epithelium+in+in+vitro+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture.</a> Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).</li>
<li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li>
<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).</li>
<li>Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomicrographic+evaluation+of+drug-induced+cataracts+in+cultured+embryonic+chick+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens.</a> Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).</li>
<li>Musil, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+embryonic+chick+lens+cells+as+a+model+system+to+study+lens+gap+junctions+and+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).</li>
<li>West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+the+lens+epithelial+explant+system+to+study+lens+differentiation+and+cataractogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).</li>
<li>Upreti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+explants+treated+with+vitreous+humor+undergo+alterations+in+chromatin+landscape+with+concurrent+activation+of+genes+associated+with+fiber+cell+differentiation+and+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response.</a> Cells. 12 (3), 501(2023).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).</li>
<li>Briskin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+retroviral+transgenes+are+highly+expressed+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biologica%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties zijn die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dit experimentele model biedt de mogelijkheid om het eiwit of de eiwitten van belang tot expressie te brengen in de intacte lens, wat leidt tot de studie van de functionele relevantie van deze eiwitten in de structuur en functie van de lens. Het embryonale kuiken-micro-injectiemodel is gedeeltelijk gebaseerd op het werk van Fekete et. al.6 en werd verder ontwikkeld door Jiang et. al.8 en is gebruikt als een middel om zowel virale plasmiden als middelen zoals agonisten, klei...

Het doel van dit protocol is het beschrijven van de methodologie van embryonale micro-injectie met kippenlenzen van een RCAS(A) (replicatiecompetent aviair sarcoom/leukose retrovirus A). Effectieve retrovirale toediening in een embryonale kippenlens is een veelbelovend hulpmiddel gebleken voor de in vivo studie van het moleculaire mechanisme en de structuur-functie van lenseiwitten in de fysiologie, pathologische omstandigheden en ontwikkeling van normale lenzen. Bovendien zou dit experimentele model kunnen worden gebruikt voor de identificatie van therapeutische doelwitten en het screenen van geneesmiddelen voor aandoeningen zoals aangeboren staar bij de mens. Al met al is dit protocol bedoeld om de nodige stappen uit te stippelen voor de ontwikkeling van een aanpasbaar platform voor de studie van lenseiwitten.
Embryonale kuikens (Gallus domesticus) zijn, vanwege hun gelijkenis in lensstructuur en functie met de menselijke lens, een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie 1,2,3,4. Het gebruik van een RCAS(A)-replicatiecompetent aviair retrovirus wordt beschouwd als een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten tot expressie te brengen in kuikenembryo's. Het heeft met name een uniek vermogen om de doelgenoverdracht te beperken tot proliferatieve lensvezelcellen zonder de noodzaak van weefselspecifieke promotors, gebruikmakend van het unieke embryonale ontwikkelingstijdsbestek waarin de aanwezigheid van leeg lenslumen in situ RCAS(A)-micro-injectie in de beperkte plaats mogelijk maakt voor de expressie van exogene eiwitten in proliferatieve lensvezelcellen5, 6,7,8.
De micro-injectieprocedure voor kuikenembryo's, die hier uitgebreid wordt beschreven, is oorspronkelijk gedeeltelijk gebaseerd op het werk van Fekete et. al.6 en verder ontwikkeld door Jiang et. al.8 en is gebruikt als een middel om zowel virale als niet-virale plasmiden in de lens van embryonale kuikens te introduceren 1,9,10,11,12,13. Over het algemeen toont het eerdere werk het potentieel aan van het gebruik van deze methodologie om de ontwikkeling, differentiatie, cellulaire communicatie en ziekteprogressie van lenzen te bestuderen, en voor het ontdekken en testen van therapeutische doelen voor lenspathologische aandoeningen zoals staar.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m Filter</td><td>Corning</td><td>431118</td><td>Voor het verwijderen van cellulair puin uit media</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Cultuurschaal</td><td>FisherScientific</td><td>50-202-030</td><td>Te gebruiken tijdens micro-injectie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Fisherbrand</td><td>13-100-676</td><td>Om oplossing te centrifugeren</td></tr><tr><td>Constructs</td><td>GENEWIZ</td><td>-</td><td>Voor het genereren van constructen</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-144A</td><td>Visualisatie van lens voor micro-injectie</td></tr><tr><td>DNA PCR-primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td>Generatie van primers: Intracellulaire lus (IL)-verwijderde Cx50 (residuen 1&ndash;97 en 149&ndash;400) evenals de Cla12NCO-vector werden verkregen met het volgende paar primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC IL's van Cx43 (residuen 98&ndash;150) en Cx46 (residuen 98&ndash;166) werden&nbsp; verkregen met de volgende paar primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectievelijk Cla12NCO-Cx43 construct-template werd verkregen met het volgende paar primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC IL's van Cx50 (residuen 98&ndash;148) of Cx46 (residuen 98&ndash;166) werden gekloneerd door gebruik te maken van Cla12NCO-Cx50 en Cla12NCO-Cx46 constructen als templates met het volgende paar primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectievelijk</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II Automatisch Nanoliter-injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Micro-injectie Pipet</td></tr><tr><td>Dual Gooseneck Lights Microscoop Verlichting</td><td>AmScope</td><td>LED-50WY</td><td>Verlichting voor visualisatie</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Arends Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Eierhouder</td><td>-</td><td>-</td><td>Zelfgemaakte piepschuim ringen met 2-inch diameter en een halve inch hoogte</td></tr><tr><td>Eierincubator</td><td>GQF Manufacturing Company Inc.</td><td>1502</td><td>Voor incubatie van bevruchte eieren</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fisher scientific</td><td>F99-10</td><td>Voor visualisatie van virale stock injectie</td></tr><tr><td>Bevruchte witte leghorn kippen eieren</td><td>Texas A&amp;M University</td><td>N/A</td><td>Diermodel van keuze voor micro-injectie (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories</td><td></td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Fluoresceïne-geconjugeerd anti-muis IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-095-003</td><td>Voor anti-FLAG&nbsp; 1:500</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>FisherScientific</td><td>22-327379</td><td>Voor het verplaatsen van dingen en isolatie</td></tr><tr><td>Glazen capillaire buisjes</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Glazen micropipet voor micro-injectie (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm lengte)</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>L3000001</td><td>Voor transfectie</td></tr><tr><td>Manuele verticale micropipet trekker</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td>Om een glazen micropipet van de juiste maat te verkrijgen</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td>FisherScientific</td><td>02-682-004</td><td>Oplossing oplossen</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Voor beeldvorming kleuring</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>FisherScientific</td><td>03-448-254</td><td>Plaatsen oplossing</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td>Voor het precies leveren van kleine vloeistofdelen door micropijpen door het toepassen van een gereguleerd druk gedurende een digitaal ingestelde periode</td></tr><tr><td>Konijn anti-chick AQP0</td><td>Zelf gegenereerd</td><td>-</td><td>Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Moleculaire klonen en functionele karakterisering van chick lens vezel connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.</td></tr><tr><td>Konijn anti-FLAG antilichaam</td><td>Rockland Immunichemicals</td><td>600-401-383</td><td>Voor het kleuren van FLAG</td></tr><tr><td>Rhodamine-geconjugeerd anti-konijn IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-295-003</td><td>Voor anti-AQP0&nbsp; 1:500</td></tr><tr><td>Sponsapklem pad</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td>Voor het opslaan van glazen micropipet</td></tr></tbody></table>

micro-injectie van recombinant rcas(a)-retrovirus in embryonale kippenlens

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonale kip (Gallus domesticus) is een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie, gezien de hoge mate van gelijkenis met de menselijke lens. RCAS(A) is een replicatiecompetent kippenretrovirus dat delende cellen infecteert, wat dient als een krachtig hulpmiddel om de in situ expressie en functie van wildtype en mutante eiwitten tijdens de ontwikkeling van de lens te bestuderen door micro-injectie in het lege lumen van het lensblaasje in vroege ontwikkelingsstadia, waardoor de werking ervan wordt beperkt tot de omliggende prolifererende lenscellen. Vergeleken met andere benaderingen, zoals transgene modellen en ex vivo culturen, biedt het gebruik van een RCAS(A)-replicatiecompetent aviair retrovirus een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten in kuikenembryo's tot expressie te brengen. In het bijzonder kan gerichte genoverdracht worden beperkt tot proliferatieve lensvezelcellen zonder dat er weefselspecifieke promotors nodig zijn. In dit artikel geven we een kort overzicht van de stappen die nodig zijn voor de bereiding van recombinant retrovirus RCAS(A), geven we een gedetailleerd, uitgebreid overzicht van de micro-injectieprocedure en geven we voorbeeldresultaten van de techniek.

Na de bepaling van een of meer specifieke doeleiwitten en de identificatie van de bijbehorende gensequentie(n), omvat de algemene experimentele benadering het klonen van de gensequentie(s) in een retrovirale RCAS(A)-vector door het initiële klonen in een adaptorvector, gevolgd door een virale vector. Ten tweede worden virale deeltjes met een hoge titer bereid met behulp van verpakkingscellen om de virionen te oogsten en te concentreren. Deze eerste twee belangrijke stappen zijn grotendeels beschreven en representatieve r...

Dit protocoldocument beschrijft de methodologie van embryonale micro-injectie van een RCAS(A)-retrovirus met kippenlenzen als een hulpmiddel voor het bestuderen van de in situ functie en expressie van eiwitten tijdens de ontwikkeling van lenzen.

Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

De gepresenteerde methodologie van embryonale micro-injectie van een RCAS-retrovirus met kippenlenzen is bedoeld als een hulpmiddel voor het bestuderen van de in situ functie en expressie van eiwitten tijdens de ontwikkeling van lenzen. Vergeleken met andere benaderingen, zoals transgene modellen en ex vivo-culturen, biedt het RCAS-replicatiecompetente aviaire retrovirus een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem voor het tot expressie brengen van exogene eiwitten in kuikenembryo's. Gerichte genoverdracht kan worden beperkt tot proliferatieve lensvezelcellen zonder dat er promotors nodig zijn.Er is een prominent potentieel voor het gebruik van deze methodologie om lensontwikkeling, differentiatie, cellulaire communicatie en ziekteprogressie te bestuderen, en voor het ontdekken en testen van therapeutische doelen voor lenspathologische aandoeningen zoals staar.

microinjection-recombinant-rcas-retrovirus-into-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.

Single Cell Transfectie in kippenembryo&#39;s

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

We presenteren een protocol om aan te tonen van een roman somatic gene transfersysteem met behulp van RIP-Tag; RIP-BTW muismodel om te bestuderen van de functie van genen in metastase. De aviaire retrovirussen zijn intracardiacally om ervoor te zorgen genenoverdracht in pre-maligne, noninvasive laesies van de cellen van de alvleesklier β in volwassen muizen geleverd.

Identificatie en karakterisering van metastatische factoren door genenoverdracht in de roman RIP-Tag; RIP-BTW lymfkliertest Model

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

We beschrijven een methode om primaire culturen van kegelfotoreceptoren te verkrijgen van het netvlies van kippenembryo's en het gebruik ervan voor screening met een hoog gehalte.

Met kegels verrijkte culturen van het netvlies van kippenembryo's om staaf tot kegel cellulaire interacties te bestuderen

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Het algemene doel van dit artikel is om te beschrijven hoe te presteren in ovo intracellulaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's. Deze aanpak is zeer nuttig om de ontwikkelingsbiologie van kippenembryo's te bestuderen.

In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's

Leer micro-injectie van RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens voor onderzoek naar eiwitexpressie tijdens lensontwikkeling. Deze methode biedt snelle, flexibele in vivo analyse van genfunctie.

Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens

Meer video's verkennen