Name: Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer de MyDoBID-techniek om enkele vezels uit gevriesdroogd menselijk skeletspierweefsel te isoleren en te classificeren op basis van myosine zware keten-isovormen. Deze methode maakt eiwitanalyse op cellulair niveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De antilichamen tegen MHC I (A4.840) en MHCIIa (A4.74) die in deze studie zijn gebruikt, zijn ontwikkeld door Dr. H. M. Blau en het antilichaam tegen MHCIIx (6H1) is ontwikkeld door Dr. C. A. Lucas en verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), dankzij de auspiciën van het National Institute of Child Health and Human Development en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen (Iowa City, IA). We danken Victoria L. Wyckelsma voor het beschikbaar stellen van de menselijke spiermonsters voor dit onderzoek. Het merendeel van de afbeeldingen in figuur 1 is afkomstig van BioRender.com.
Financiering: Deze studie ontving geen externe financiering.

MyDoBID - een nieuwe techniek voor het efficiënt identificeren van spiervezeltypes

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Vezel inzameling Op basis van enkele jaren ervaring kunnen de meeste onderzoekers deze techniek onder de knie krijgen; De praktijk leidt echter tot een snellere en efficiëntere vezelinzameling voor stroomafwaartse analyses. Om 30 enkelvoudige vezelsegmenten van een kwaliteit voor pooling te kunnen isoleren, wordt aanbevolen om 50 vezelsegmenten per monster te verzamelen. Het wordt aanbevolen om de video over het verzamelen van vezels zorgvuldig te bestuderen en na het uitvoeren van twee oefensessies (...

Skeletspieren zijn een heterogeen weefsel, met verschillende cellulaire metabole en contractiele eigenschappen die afhankelijk zijn van het feit of de cel (vezel) langzame spiertrekkingen (type I) of snelle spiertrekkingen (type II) is. Het vezeltype kan worden geïdentificeerd door de myosine zware keten (MHC) isovormen te onderzoeken, die op verschillende manieren van elkaar verschillen, waaronder contractietijd, snelheid van verkorting en vermoeidheidsweerstand1. De belangrijkste MHC-isovormen zijn type I, type IIa, type IIb en type IIx en hun metabole profielen zijn oxidatief (type I en IIa) of glycolytisch (IIx, IIb)1. Het aandeel van deze vezeltypes varieert in spiertype en tussen soorten. Type IIb wordt veel aangetroffen in de spier van knaagdieren. Menselijke spieren bevatten geen type IIb-vezels en bestaan voornamelijk uit MHC-isovormen type I- en IIa-vezels, met een klein aandeel IIx-vezels2. Eiwitexpressieprofielen variëren tussen verschillende vezeltypes en kunnen worden gewijzigd bij veroudering3, lichaamsbeweging 4,5 en ziekte6.
Het meten van cellulaire responsen in verschillende skeletspiervezeltypes wordt vaak over het hoofd gezien of is niet mogelijk vanwege het onderzoek van spierhomogenaten (een mix van alle vezeltypes). Single-fiber western blot maakt het mogelijk om meerdere eiwitten in individuele spiervezels te onderzoeken7. Deze methodologie is eerder gebruikt om nieuwe en informatieve eigenschappen van één vezel te produceren die niet mogelijk waren om te verkrijgen met homogenaatpreparaten. Er zijn echter enkele beperkingen van de oorspronkelijke single-fiber western blot-methodologie, waaronder de tijdrovende aard, het onvermogen om monsterreplicaten te genereren en het gebruik van dure, gevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL)-reagentia. Als vers weefsel wordt gebruikt, is deze methode verder beperkt vanwege de tijdsdruk van het moeten isoleren van individuele vezels binnen een beperkt tijdsbestek (d.w.z. 1-2 uur). Gelukkig wordt deze beperking verzacht door segmenten van één vezel te isoleren van gevriesdroogd weefsel8. Het verzamelen van vezels uit gevriesdroogde monsters wordt echter beperkt door de grootte en kwaliteit van het biopsieweefsel.
Identificatie van het vezeltype met behulp van de dot blotting-methode9 is in dit uitgebreide protocol aanzienlijk uitgewerkt en uitgebreid. Eerder is aangetoond dat slechts ~2-10 mg spierweefsel met nat gewicht voldoende is voor vriesdrogen en MHC-isovormeiwitanalyse met één vezel9. Christensen et al.9 gebruikten 30% van een ~1 mm vezelsegment om de MHC-isovorm te detecteren die aanwezig was door dot-blotting, wat werd bevestigd door western blotting. Dit werk toonde aan dat door western blotting te vervangen door dot blotting, de totale kosten met ~40-voudig werden verlaagd (voor 50 vezelsegmenten). Vezels werden vervolgens "gepoold" in type I- en type II-monsters, wat experimentele replicatie mogelijk maakte9. Een beperking was echter dat er slechts twee vezeltypespecifieke monsters werden verkregen: type I (MHCI-positief) en type II (MHCII-positieve vezels), waarbij type II-monsters een mengsel van MHCIIa en MHCIIx 6,10 bevatten. Het huidige protocol laat met name zien hoe zuivere type IIx-vezels kunnen worden geïdentificeerd en biedt een zeer gedetailleerde workflow (samengevat in figuur 1), inclusief strategieën voor het oplossen van problemen met veelvoorkomende protocolproblemen.

<table><tbody><tr><td>1x Denaturing buffer</td><td>Maak volgens recept</td><td>De bestanddelen kunnen worden verkregen bij Sigma-Aldrich of andere chemische distributeurs</td><td>&nbsp;1x denaturing buffer wordt gemaakt door 3x denaturing buffer 1 op 3 v/v te verdunnen met 1X Tris-HCl (pH 6.8). Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>3x Denaturing buffer</td><td>Maak volgens recept</td><td>De bestanddelen kunnen worden verkregen bij Sigma-Aldrich of andere chemische distributeurs</td><td>3x denaturing buffer bevat: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M ureum, 10% 2-mercaptoethanol en 0.001% broomfenolblauw, pH 6.8.&nbsp; Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>N/A</td><td>100% ethanol kan bij elk bedrijf worden verkregen</td><td>Verdund tot 95% met ultra-puur H2O.</td></tr><tr><td>Actine konijn polyklonaal antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2066</td><td>Verdun 1 op 1.000 met BSA-buffer.</td></tr><tr><td>Analytische weegschalen</td><td>Mettler Toledo</td><td>Modelnummer: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaamversterker</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>Productnaam is Miser Antibody Extender Solution NC.</td></tr><tr><td>Beker (100 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Modelnaam: Mini Spin.</td></tr><tr><td>Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.</td><td>Diploma</td><td>In de winkel gekocht</td><td></td></tr><tr><td>BSA-buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; NaN3: S2002</td><td>Rundserumalbumine (BSA), fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS) en natriumazid (NaN3). Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Hefboom voor cassetteopening&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>Wordt gebruikt om de cassettes van de voorgegoten gel te openen.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Modelnummer: Universal hood III</td><td>Elk beeldvormingssysteem met Stain-Free gelbeeldvormingsmogelijkheden.</td></tr><tr><td>Criterion blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>Inclusief ijspack, overdrachtsschaal, roller, 2 cassettehouders, filterpapier, schuimkussens en deksel met kabels.</td></tr><tr><td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (verbeterde chemiluminescentie)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>Productnaam: Clarity Max Western ECL Substrate.</td></tr><tr><td>Elektroforesebuffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>Verdun 10x TGS 1 op 10 met ultra-puur H2O.</td></tr><tr><td>Filterpapier, 0.34 mm dik</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>Bulkgrootte 3 MM, pak 100 vellen, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>Fijne weefselsessers</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Juwelierstang nr. 5.</td></tr><tr><td>Vlakke plastic schaal/deksel&nbsp;&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Groot genoeg om de membraan op te plaatsen. Zorg ervoor dat het oppervlak volledig vlak is.</td></tr><tr><td>Vriesdroger</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4.5 L met glazen kamermonsterstap.</td></tr><tr><td>Vriezer -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elke vriezer met een constante temperatuur van -80 &deg;C is geschikt.</td></tr><tr><td>Gelontspanners</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Schuif onder de membraan om de membraan te verzamelen of te verplaatsen.</td></tr><tr><td>Grijze potlood</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Image lab software&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Figuren verwijzen naar softwareversie 5.2.1, maar andere versies kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1660521</td><td>Elke incubator die op 37 &deg;C kan worden ingesteld, zou voldoende zijn.</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Magneetschuimer met vlooien</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Membraanroller&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>Kan worden gekocht in het Transfer-bundelpakket. Als dit product echter niet beschikbaar is, zou elke gladde oppervlakte cilindrische buis die lang genoeg is om over de membraan te rollen, voldoende zijn.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes&nbsp; (0.6 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Muis IgG HRP secundair</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>Geit anti-muis IgG (H+L), RRID AB_228341. Verdun op 1 op 20.000 in blokkeerbuffer.</td></tr><tr><td>Muis IgM HRP secundair</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Geit Anti-Muis IgM mu-keten. Gebruik bij dezelfde verdunning als muis IgG.</td></tr><tr><td>Myosine Heavy Chain I (MHCI) primaire antilichaam</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>Verdunningsbereik: 1 op 200 tot 1 op 500 in BSA-buffer.</td></tr><tr><td>Myosine Heavy Chain IIa (MHCIIa) primaire antilichaam</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>Verdunningsbereik: 1 op 200 tot 1 op 500 in BSA-buffer.</td></tr><tr><td>Myosine Heavy Chain IIx (MHCII

vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om specifieke myosine heavy chain (MHC) isovormen in segmenten van individuele spiervezels te identificeren met behulp van dot blotting, hierna aangeduid als Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Dit protocol beschrijft het proces van het vriesdrogen van menselijke skeletspieren en het isoleren van segmenten van afzonderlijke spiervezels. Met behulp van MyDoBID worden type I- en II-vezels geclassificeerd met respectievelijk MHCI- en IIa-specifieke antilichamen. Geclassificeerde vezels worden vervolgens gecombineerd tot vezeltypespecifieke monsters voor elke biopsie.
Het totale eiwit in elk monster wordt bepaald door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en UV-geactiveerde geltechnologie. Het vezeltype van monsters wordt gevalideerd met behulp van western blotting. Het belang van het uitvoeren van normalisatie van de eiwitbelasting om de detectie van doeleiwitten in meerdere westernvlekken te verbeteren, wordt ook beschreven. De voordelen van het consolideren van geclassificeerde vezels in vezeltypespecifieke monsters in vergelijking met westernblots met één vezel, zijn onder meer de veelzijdigheid van monsters, een grotere doorvoer van monsters, een kortere tijdsinvestering en kostenbesparende maatregelen, en dat alles met behoud van waardevolle vezeltypespecifieke informatie die vaak over het hoofd wordt gezien met behulp van gehomogeniseerde spiermonsters. Het doel van het protocol is om nauwkeurige en efficiënte identificatie te bereiken van type I- en type II-vezels geïsoleerd uit gevriesdroogde menselijke skeletspiermonsters.
Deze individuele vezels worden vervolgens gecombineerd om type I en type II vezeltype-specifieke monsters te creëren. Bovendien wordt het protocol uitgebreid met de identificatie van type IIx-vezels, waarbij actine wordt gebruikt als marker voor vezels die negatief waren voor MHCI en MHCIIa, die worden bevestigd als IIx-vezels door western blotting. Elk vezeltype-specifiek monster wordt vervolgens gebruikt om de expressie van verschillende doeleiwitten te kwantificeren met behulp van western blotting-technieken.

Identificatie van individuele MHCI-, MHCIIa- en MHCIIx-spiervezels met behulp van dot blotting Een kenmerk van MyDoBID is de categorisering van de variërende MHC- en Actine-signaalintensiteitssterkte in een bepaalde vezel (Figuur 4A). Het vezeltype werd geïdentificeerd door de aan- of afwezigheid van MHCI- en IIa-isovormen (Figuur 4B). Zes vezels vertoonden geen MHC- of actinedetectie, wat aangeeft dat er geen vezels waren verzameld. De resul...

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Ons onderzoek concentreert zich op skeletspieren, die bestaan uit cellen met onderscheidende metabole en contractiele eigenschappen, gekenmerkt als langzame of snelle spiervezels. We verdiepen ons in de factoren die bijdragen aan deze verschillen en onderzoeken hun implicaties in de context van veroudering, lichaamsbeweging en verschillende ziekten. Het meten van cellulaire reacties in verschillende skeletspiervezels wordt vaak over het hoofd gezien, of is niet mogelijk vanwege het onderzoek van spierhomogenaten.De MyDoBID-techniek stelt ons in staat om herhaaldelijk eiwitverschillen van vezeltypes te analyseren die voorheen onmogelijk te meten waren. Dit protocol identificeert nauwkeurig en efficiënt type één en type twee spiervezels uit gevriesdroogde menselijke skeletspiermonsters. Deze onlangs herziene methode biedt onderzoekers een eenvoudige benadering om eiwitverschillen in skeletspieren op cellulair niveau te onderzoeken.Het vergemakkelijkt met name de identificatie van type twee X-vezels, en deze zijn van oudsher moeilijk te onderscheiden. De techniek stelt onderzoekers in staat om licht te werpen op alle vezelsoorten, inclusief de ongrijpbare type twee X-vezel. Met de MyD

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate the sample preparation of human skeletal muscle tissue and its staining for transmission electron microscopy to visualize and quantify subcellular glycogen distribution.

Transmission Electron Microscopy to Quantify Glycogen Distribution in Human Skeletal Muscles

Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek voor de biopsie van de musculus tibialis voorste die vezelschade beperkt.

Verzameling skeletspierbiopten uit het superieure compartiment van human musculus Tibialis Anterior voor mechanische evaluatie

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

We stellen een protocol voor om vetzuren te identificeren zonder dat ze hoeven te worden gezuiverd. Het combineert informatie over de retentietijd met de massaspectra van drie soorten vetzuurderivaten: vetzuurmethylesters (FAME's), 4,4-dimethyloxazolinederivaten (DMOX) en 3-pyridylcarbinylester (picolinyl).

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

Leer de MyDoBID-techniek om enkele vezels uit gevriesdroogd menselijk skeletspierweefsel te isoleren en te classificeren op basis van myosine zware keten-isovormen. Deze methode maakt eiwitanalyse op cellulair niveau mogelijk.

Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

Meer video's verkennen