Name: Een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Ontdek een geoptimaliseerde omgekeerde polytransfectiemethode voor muizenembryonale stamcellen in 2i- en LIF-medium. Deze aanpak verbetert celviabiliteit en transfectie-efficiëntie voor snelle optimalisatie van plasmideverhoudingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de vele bijdragen aan het veld erkennen die niet in dit werk werden geciteerd vanwege ruimtebeperkingen, evenals de financieringsinstanties die deze mogelijkheid hebben geboden. De auteurs erkennen financiering van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die dit werk ondersteunden. KM is de ontvanger van een CGS-M-beurs van NSERC en een Killam Doctoral Scholarship van de University of British Columbia. N.S. is de ontvanger van een Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

1. Bereiding van reagentia voor mPSC-cultuur
<ol><li>Bereid N2-supplement voor.<ol><li>Bereid in niet-steriele omstandigheden de volgende stockoplossingen (stap 1.1.1.1) in een chemische veiligheidszuurkast. Voeg het vaste poeder van elke chemische stof toe aan een vooraf gewogen conische buis van 50 ml. Weeg elke buis na het toevoegen van het poeder en voeg een geschikte hoeveelheid oplosmiddel toe om de onderstaande concentraties te bereiken. Bereid voor één batch media de vermelde minimumhoeveelheid voor. NOTITIE: De volgende reagentia zijn gevaarlijk en moeten worden behandeld in overeenstemming met de plaatselijke chemische veiligheidsrichtlijnen. Zorg voor de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren en werk alleen met de vaste poedervormen van deze chemicaliën in een chemische zuurkast om inademing te voorkomen.<ol><li>Minimaal 0,05 ml natriumseleniet in water van 0,518 mg/ml, 0,5 ml putrescine in water van 160 mg/ml, 0,165 ml progesteron in 100% ethanol van 0,6 mg/ml (zie materiaaltabel).</li>
			<li>Bewaar oplossingen bij -20 °C voor maximaal 2 jaar.</li>
		</ol></li>
		<li>Voeg in een bioveiligheidskast (BSC) het volgende toe aan 58.035 ml DMEM-F12.<ol><li>0,05 ml van een 0,518 mg/ml natriumselenietoplossing, 0,5 ml van een putrescineoplossing van 160 mg/ml, 0,165 ml van een progesteronoplossing van 0,6 mg/ml.</li>
			<li>Filter steriliseer het bovenstaande mengsel met een filter van 0,22 μm.</li>
		</ol></li>
		<li>Bereid nog steeds in de BSC een oplossing van 100 mg/ml apotransferrine.<ol><li>Voeg 5 ml DMEM-F12 toe aan 500 mg apotransferrine (zie materiaaltabel). Langzaam resuspenderen en wassen van de container, vermijd luchtbellen.</li>
			<li>Na zoveel mogelijk resuspenderen en verwijderen met 5 ml, voeg je het toe aan de seleniet/putrescine/progesteronoplossing. Neem meer van de vorige oplossing en was de apotransferrinefles, zodat er zoveel mogelijk uit komt.</li>
		</ol></li>
		<li>Voeg 5 ml 7,5% BSA-fractie V (zie materiaaltabel) toe aan de oplossing.</li>
		<li>Meng en aliquot 6.875 ml per tube. Bewaar aliquots bij -80 °C gedurende maximaal 1 jaar.</li>
		<li>Wanneer u de bovenstaande N2-aliquots gebruikt om N2B27-media te maken, ontdooit u het gewenste aliquot en voegt u 3.125 ml van een 4 mg/ml insulineoplossing (zie materiaaltabel) toe aan de 6.875 N2 voor 10 ml 100x N2.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid N2B27 basale media voor.<ol><li>Ontdooi N2- en B27-supplementen enkele uren of een nacht in een koelkast van 4 °C.</li>
		<li>Meng in een BSC 484,5 ml DMEM-F12 en 484,5 ml neurobasale media (zie materiaaltabel) in een steriele fles van 1 liter.</li>
		<li>Voeg 10 ml B27 en 10 ml N2-supplement toe aan de media.</li>
		<li>Voeg 1 ml 55 mM bèta-mercaptoethanol toe (zie materiaaltabel). Voeg 10 ml 100x glutamax toe. Meng krachtig door de fles rond te draaien.</li>
		<li>Aliquot het gewenste volume per aliquot (meestal 100 ml) en bewaar bij -80 °C gedurende maximaal 1 jaar. Na ontdooien bij 4 °C maximaal 3 weken bewaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid NBiL-media voor.<ol><li>Ontdooi een aliquot van 100 ml N2B27 basaal medium van -80 °C in de koelkast van 4 °C.</li>
		<li>Voeg in een BSC LIF (zie materiaaltabel) toe tot een eindconcentratie van 10 μg/l.</li>
		<li>Voeg CHIR99021 (3 μM definitief) en PD0325901 (1 μM definitief) toe (zie materiaaltabel). Goed mengen met een serologische pipet van 50 ml. Maximaal 2 weken bewaren bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid 0,2% gelatine-oplossing.<ol><li>Breng 500 ml dubbel gedistilleerd H2O over in een glazen fles van 1 liter.</li>
		<li>Meet 1 g gelatine af (zie Materiaaltabel) en voeg deze toe aan het water. Meng door de fles te schudden tot deze grotendeels is opgelost.</li>
		<li>Autoclaaf het mengsel van gelatine en water bij 15 psi, 121 °C gedurende 35 minuten. Eenmaal afgekoeld, steriliseer het filter met een filter van 0,22 μm in een BSC. Bewaren bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid wasmedia voor.<ol><li>Meng in een BSC 160 μL 7,5% BSA per 10 ml DMEM-F12.</li>
		<li>Schaal het bovenstaande op en bereid het in grote hoeveelheden voor voor toekomstig gebruik (bijv. 8 ml 7,5% BSA tot 500 ml DMEM-F12). Bewaren bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bereiding van reagentia voor mPSC-polytransfectie
OPMERKING: De volgende waarden worden gegeven voor een enkele put van een plaat met 24 putjes. Waarden kunnen dienovereenkomstig worden geschaald. De sequenties van alle DNA/plasmiden worden gedetailleerd beschreven in aanvullend bestand 1.
<ol><li>Bereken het volume DNA-oplossing dat nodig is per behandeling.<ol><li>Bereid 500 ng DNA per putje/toestand voor.<ol><li>Als u een enkel plasmide transfecteert met een DNA-oplossing van 100 ng/μl, bereid dan één buisje met 5 μl DNA.</li>
			<li>Als u twee plasmiden van elk 100 ng/μl transfecteert, maak dan twee buisjes met elk 2,5 μl klaar, één voor elk plasmide.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Voer in een BSC het volgende uit: Voor elke transfectiebehandeling van 500 ng (zie materiaaltabel) doet u aliquot 25 μl OptiMEM in een buisje van 1,5 ml.<ol><li>Schaal dit dienovereenkomstig - voor het bovenstaande voorbeeld bereidt u twee buisjes voor, elk met 250 ng DNA (2,5 μL) en 12,5 μL OptiMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg het benodigde volume DNA voor die behandeling toe aan de OptiMEM in het buisje.</li>
	<li>Maak voor elk buisje met 500 ng DNA en OptiMEM een passend buisje met nog eens 25 μL OptiMEM en 1 μL kationisch transfectiereagens op basis van lipiden.<ol><li>Nogmaals, deze waarden moeten dienovereenkomstig worden geschaald. Bereid voor het bovenstaande voorbeeld twee buisjes voor, elk met 12,5 μL OptiMEM en 0,5 μL transfectiereagens. OPMERKING: Gebruik bij het schalen van waarden de massa toegevoegd DNA, niet het volume dat nodig is voor die hoeveelheid DNA. Reacties met transfectiereagens en DNA kunnen worden geschaald (bijv. als 5 putjes met hetzelfde DNA moeten worden getransfecteerd). Houd de verhoudingen van reagentia hetzelfde, maar schaal dienovereenkomstig (bijv. 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μL transfectiereagens: 50 μL OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bereiding van mPSC's voor transfectie
OPMERKING: Voor omgekeerde transfectie bereidt u het kweekvat voor en passeert u de mPSC's direct voordat u de transfectiereagentia toevoegt. Voor voorwaartse transfectie, doorgang en plaat de cellen 12-18 uur voorafgaand aan de transfectie zodat de cellen zich aan de plaat kunnen hechten.
<ol><li>Bereid een met 0,2% gelatine omhuld celkweekvat voor.<ol><li>Plan het aantal putjes dat nodig is voor de transfectie (één putje van een plaat met 24 putjes per behandeling/groep).</li>
		<li>Voeg 200 μL van de 0,2% gelatineoplossing toe aan elk van de gewenste putjes in de plaat met 24 putjes.</li>
		<li>Schud de plaat voorzichtig om de oplossing gelijkmatig te verdelen en zorg ervoor dat deze de hele bodem van het putje bedekt.</li>
		<li>Laat de putjes minimaal 15 minuten op kamertemperatuur coaten.</li>
		<li>Verwijder met behulp van een vacuümaspirator voorzichtig alle overgebleven gelatine uit de putjes (kantel de plaat om ervoor te zorgen dat alle vloeistof wordt verwijderd zonder de gelatinelaag eraf te schrapen).</li>
		<li>Voeg 0,5 ml NBiL-media (stap 1.3) toe aan elk putje en laat de plaat in een weefselkweekincubator voorverwarmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage mPSC's.<ol><li>Aliquot 30 ml wasmiddel (stap 1.5) in een conische buis van 50 ml.</li>
		<li>Zuig de oude media op uit het weefselkweekschaaltje van mESC's. OPMERKING: Verschillende aspiratietechnieken zijn toegestaan. Welke techniek ook wordt gekozen, zorg ervoor dat de cellen niet gedurende langere tijd droog blijven (maximaal ongeveer 30 s).</li>
		<li>Voeg de benodigde hoeveelheid in de handel verkrijgbaar celafscheidingsmedium toe (1,5 ml voor een schaal van 10 cm, schaal dienovereenkomstig, zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Wacht 3-5 minuten voordat u 15-20 keer op en neer pipettert met een P1000-pipet om een eencellige suspensie te verkrijgen. Bekijk cellen onder een microscoop om een eencellige suspensie te garanderen.</li>
		<li>Breng de cellen in het ontkoppelingsmedium over in de buis van 50 ml met wasmiddel.</li>
		<li>Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig wasmedia op, zodat er geen restvloeistof in de buis achterblijft.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in een kleine hoeveelheid wasmiddel (~300 μL). Tel de celsuspensie met behulp van een hemocytometer om de celdichtheid te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Omgekeerde transfectie van mPSC's
<ol><li>Bereid polytransfectiereagentia voor volgens stap 2.</li>
	<li>Bereid het celkweekvat en de doorgangsmPSC's voor volgens stap 3.</li>
	<li>Aliquot 200 μL NBiL-media op 1,5 ml buisjes, één voor elke behandeling.</li>
	<li>Voeg 26 μl van het OptiMEM:transfectie-reagensmengsel toe aan het DNA:OptiMEM-mengsel. Meng de reagentia snel en krachtig door ongeveer 10 keer te pipetteren. Laat het mengsel 5 minuten op kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Breng op basis van de celdichtheid het benodigde celvolume over van de 300 μL celsuspensie naar de 200 μL NBiL-buisjes om 25.000 cellen per buisje te verkrijgen.</li>
	<li>Na 5 minuten incubatie van het mengsel van Lipofectamine 2000 (L2K, transfectiereagens) en DNA, voeg het toe aan de 1,5 ml buis met cellen en meng goed door te pipetteren. Laat de cellen 5 minuten bij kamertemperatuur met het reagens incuberen.</li>
	<li>Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer de vloeistof en laat ongeveer 50 μl over.</li>
	<li>Resuspendeer de celpellet met 100 μL NBiL-media. Breng de cellen over naar de plaat en plaats de plaat in de couveuse. Vervang de media 24 uur later door nieuwe NBiL-media.</li>
</ol>5. Voorwaartse transfectie van mPSC's
<ol><li>Bereid 12-18 uur voorafgaand aan de transfectie het celkweekvat en de mPSC's voor volgens stap 3.</li>
	<li>Breng op basis van de celdichtheid het benodigde celvolume over van het 300 μL celmengsel naar 25.000 cellen per putje. Plaats het bord in de couveuse.</li>
	<li>1 uur voor transfectie de media uit alle putjes opzuigen en vervangen door 0,5 ml NBiL-media. Plaats het bord in de couveuse.</li>
	<li>Bereid op het moment van transfectie mPSC-polytransfectiereagentia voor volgens stap 2.</li>
	<li>Voeg 26 μl van het OptiMEM:transfectie-reagensmengsel toe aan het DNA:OptiMEM-mengsel. Meng de reagentia snel en krachtig door ongeveer 10 keer te pipetteren. Laat het gecombineerde mengsel 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Voeg het gecombineerde mengsel druppelsgewijs toe aan de kuiltjes. Plaats het bord in de couveuse. Verander de media 24 uur later.</li>
</ol>6. Flowcytometrie
<ol><li>Zuig de media 48 uur na transfectie op uit de getransfecteerde plaat met 24 putjes.</li>
	<li>Voeg 200 μL trypsine toe aan elk putje, draai rond en incubeer gedurende 30 s bij 37 °C. Tik op de zijkanten van de plaat en voeg 200 μL ijskoude FACS-buffer toe (2% FBS in PBS).</li>
	<li>Open en label een V-bodem plaat met 96 putjes, beginnend bij A1. Meng de inhoud van elk putje op de getransfecteerde plaat om de cellen los te maken en maak eencellige oplossingen met een P200-pipet. Breng 200 μl over van elk putje naar het juiste putje op de plaat met 96 putjes.</li>
	<li>Voeg 15 ml FACS-buffer toe aan een reagensreservoir van 50 ml. Centrifugeer de plaat op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg door de plaat met 96 putjes met een snelle en soepele beweging in de gootsteen om te keren.</li>
	<li>Gebruik een meerkanaalspipet om de pellets op de plaat met 96 putjes te resuspenderen in 150 μL FACS-buffer uit het reagensreservoir. Herhaal stap 6.4-6.5 twee keer. Plaats de plaat met 96 putjes in een met ijs gevulde doos, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Haal de monsters door een flowcytometer om de populatieverdelingen van de fluorescerende reporters te verkrijgen.<ol><li>Zorg ervoor dat de cytometer geschikt is in termen van laser- en filtercombinaties voor het uit te voeren experiment (gebruik bijvoorbeeld geen infraroodreporter als het niet mogelijk is om te exciteren of te detecteren in het verrode spectrum).</li>
		<li>Voeg extra monsters toe voor standaardisatiekorrels om MEFL-conversie van gegevens tijdens de analyse mogelijk te maken. Zorg ervoor dat er voldoende cellen per monster worden verzameld voor een passende statistische analyse9.</li>
	</ol></li>
	<li>Converteer fluorescentie-eenheden uit de onbewerkte cytometerbestanden en analyseer de gegevens met behulp van een van de verschillende methoden, zoals op Python of MATLAB gebaseerde pijplijnen of in de handel verkrijgbare software 9,13.</li>
</ol>

Vergelijkende analyse van voorwaartse en achterwaartse transfectiemethoden op mPSC's

<ol><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li>
<li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156(2013).</li>
<li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+pluripotency%3A+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li>
<li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146(2019).</li>
<li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bpoly-transfection%26%2334%3B+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A &#34;poly-transfection&#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793(2023).</li>
<li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611(2010).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Een belangrijke reden voor de wijdverbreide acceptatie van transfectieprotocollen is hun reproduceerbaarheid en toegankelijkheid; Deze protocollen vereisen echter wel optimalisatie in experimentele contexten. Hierboven zijn de standaardtests niet genoemd die nodig zijn wanneer u voor het eerst een nieuwe cellijn probeert te transfecteren. Ten eerste is de keuze van het transfectiereagens van cruciaal belang, aangezien in de handel verkrijgbare reagentia niet voor iedereen geschikt zijn en zullen variëren in de efficiënti...

Levering van DNA en RNA aan zoogdiercellen dient als een kernpijler van biomedisch onderzoek1. Een veelgebruikte methode voor het introduceren van exogene nucleïnezuren (NA) in zoogdiercellen is door middel van transiënte transfectie 2,3. Deze techniek is gebaseerd op het mengen van NA met in de handel verkrijgbare transfectiereagentia die in staat zijn om ze in de ontvangende cellen af te leveren. Meestal wordt NA afgeleverd via voorwaartse transfectie, waarbij cellen die zich aan een tweedimensionaal oppervlak hechten, het transfectiecomplex ontvangen. Hoewel voorwaartse transfectie voor de meest voorkomende gevestigde cellijnen robuust is en protocollen goed zijn gepubliceerd, transfecteren meer nicheceltypen met niet-monolaagse morfologieën niet gemakkelijk, waardoor de hoeveelheid NA die kan worden afgeleverd en het aantal cellen dat het ontvangt, wordt beperkt.
Pluripotente stamcellen (PSC's) dienen als een aantrekkelijk model voor het begrijpen van ontwikkeling en als een hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde, gezien hun vermogen om zich voor onbepaalde tijd te delen en elk lichaamsceltype te produceren. Voor PSC's van muizen (mPSC's) behouden routinematige in vitro kweekomstandigheden met 2 remmers en LIF (2i/LIF) een koepelachtige koloniemorfologie, waardoor het aantal cellen dat wordt blootgesteld aan een voorwaartse transfectie direct wordt beperkt 4,5,6. Om dit aan te pakken, kan een omgekeerde transfectie worden uitgevoerd: cellen worden toegevoegd aan een schaal die media en transfectiereagens bevat, in plaats van transfectiereagens toe te voegen aan aanhangende cellen7. Hoewel dit het aantal cellen dat aan het reagens wordt blootgesteld, verhoogt, moeten de cellen ook gelijktijdig worden gepasseerd en getransfecteerd.
Onderzoekers gaan verder dan eenvoudige enkelvoudige NA-transfecties en streven er vaak naar om verschillende NA-constructen in vitro in een populatie cellen af te leveren. Dit wordt meestal bereikt door middel van een co-transfectie, waarbij de NA's in een bepaalde verhouding (1:1, 9:1, enz.) worden gemengd en vervolgens worden gecombineerd met het gekozen transfectiereagens8. Dit levert een mix van NA's en reagens op die de oorspronkelijke verhouding van NA's tot elkaar behoudt - hoewel cellen in de behandeling verschillende hoeveelheden van deze mix kunnen krijgen, krijgen ze allemaal dezelfde verhouding9. Hoewel dit voordelig is wanneer de gewenste verhouding van onderdelen bekend is, kan het van tevoren bepalen van deze verhouding arbeidsintensief zijn, waarbij elke verhouding een andere voorwaarde vormt. Een alternatief is om een "poly-transfectie" uit te voeren, waarbij individuele NA's onafhankelijk van elkaar worden gemengd met het transfectiereagens9. Door transfectiecomplexen te combineren die individuele NA's bevatten (in plaats van NA's te combineren voordat de complexen worden gemaakt), kunnen onderzoekers een breed scala aan NA-stoichiometrieën onderzoeken in een enkel transfectie-experiment9. Dit is met name waardevol in gevallen waarin van de producten van verschillende NA's wordt verwacht dat ze met elkaar interageren, zoals met induceerbare transcriptiesystemen of systemen met ingebouwde feedback 1,10,11. Om dit effectief te doen, is echter een hoge transfectie-efficiëntie nodig. Naarmate het aantal unieke getransfecteerde NA's toeneemt, neemt de kans dat een bepaalde cel alle gewenste NA's ontvangt exponentieel af 9,12.
Het volgende rapport beschrijft een omgekeerd transfectieprotocol voor mPSC's met behulp van een op kationen gebaseerd transfectiereagens, waarbij cellen gedurende maximaal 5 minuten worden blootgesteld aan het reagens-NA-mengsel om de levensvatbaarheid te maximaliseren en de tijd buiten typische kweekomstandigheden te minimaliseren. Vergelijking van dit protocol met de standaard voorwaartse transfectie van deze cellen toont een hogere transfectie-efficiëntie en een toename van het totale aantal overlevende getransfecteerde cellen. Door deze omgekeerde transfectie te combineren met een drie-plasmide poly-transfectie met eenvoudige fluorescerende reporters, wordt een uitgebreid potentieel aangetoond om NA-ratio's met een hoge transfectie-efficiëntie te screenen.

<table><tbody><tr><td>Accutase&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferrin&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraction V (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML1046-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>MilliporeSigma</td><td>D6421-24X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry standardization beads</td><td>Spherotech</td><td>URCP-38-2K</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12585-0014</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>PZ0162-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8783</td><td>Chemisch gevaar - raadpleeg lokale veiligheidsrichtlijnen, zorg voor de juiste PPE en werk met de vaste poedervorm alleen in een chemische afzuigkap</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6780</td><td>Chemisch gevaar - raadpleeg lokale veiligheidsrichtlijnen, zorg voor de juiste PPE en werk met de vaste poedervorm alleen in een chemische afzuigkap</td></tr><tr><td>Recombinant mLIF&nbsp;</td><td>BioTechne</td><td>8878-LF-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumseleniet&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5261-25G</td><td>Chemisch gevaar - raadpleeg lokale veiligheidsrichtlijnen, zorg voor de juiste PPE en werk met de vaste poedervorm alleen in een chemische afzuigkap</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

Vanwege de relatieve eenvoud en het gebruiksgemak is transiënte transfectie van zoogdiercellijnen met nucleïnezuren een steunpilaar geworden in biomedisch onderzoek. Hoewel de meest gebruikte cellijnen robuuste protocollen hebben voor transfectie in aanhangende tweedimensionale cultuur, vertalen deze protocollen zich vaak niet goed naar minder bestudeerde lijnen of lijnen met atypische, moeilijk te transfecte morfologieën. Met behulp van pluripotente stamcellen van muizen gekweekt in 2i/LIF-media, een veelgebruikt kweekmodel voor regeneratieve geneeskunde, schetst deze methode een geoptimaliseerd, snel omgekeerd transfectieprotocol dat in staat is om een hogere transfectie-efficiëntie te bereiken. Door gebruik te maken van dit protocol wordt een polytransfectie van drie plasmide uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van de hoger dan normale efficiëntie bij de afgifte van plasmiden om een uitgebreid bereik van plasmide-stoichiometrie te bestuderen. Dit omgekeerde poly-transfectieprotocol maakt een experimentele methode met één pot mogelijk, waardoor gebruikers de plasmideverhoudingen in een enkele put kunnen optimaliseren, in plaats van over verschillende co-transfecties. Door de snelle verkenning van het effect van DNA-stoichiometrie op de algehele functie van afgeleverde genetische circuits te vergemakkelijken, minimaliseert dit protocol de tijd en kosten van embryonale stamceltransfectie.

Zowel voorwaartse als omgekeerde transfecties zijn afhankelijk van de interactie tussen het celmembraan en inkomende transfectiereagens-DNA-complexen, waardoor de afgifte van NA aan de ontvangende cellen mogelijk is. Waar deze technieken verschillen, is de toestand van de cel bij levering - terwijl DNA meestal wordt afgeleverd aan aanhangende celmonolagen in traditionele voorwaartse transfectie, vertrouwt omgekeerde transfectie in plaats daarvan op het feit dat het reagens-DNA-complex de cellen ontmoet terwijl het zich i...

Dit protocol beschrijft een methode voor omgekeerde polytransfectie van embryonale stamcellen van muizen tijdens kweek met 2i- en LIF-media. Deze methode levert een hogere levensvatbaarheid en efficiëntie op dan traditionele voorwaartse transfectieprotocollen, terwijl het ook een optimalisatie van plasmideverhoudingen in één pot mogelijk maakt.

Een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Ons werk richt zich over het algemeen op het gebruik van synthetische genetische apparaten om het lot en gedrag van stamcellen te manipuleren. Door cellulaire toestanden te beheersen, willen we de ontwikkeling van cellulaire therapieën van de volgende generatie bevorderen. Onlangs is een dieper begrip van de relatie tussen de dosering van een lotbepalend gen en de afstamming van de cel tot stand gekomen.Dit werd mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van genetische controllers die in staat zijn om een bepaald gen precies te titreren. Klassieke moleculair-biologische technieken zoals transfectie of lentivirale transductie voor eenvoudige gen-overexpressie zullen altijd een steunpilaar zijn. Ons vakgebied heeft echter onlangs synthetische apparaten gebruikt die lineaire en niet-lineaire feedback bevatten om complexere outputs te verkrijgen uit geleverd DNA.Gendosering speelt een sleutelrol bij het bepalen van de uitkomst van genexpressie. Bij het afleveren van meerdere exogene genen is een belangrijke experimentele factor hoeveel van elk gen het optimale of gewenste resultaat zal geven. Ons protocol stelt onderzoekers in staat om snel doseringen in één behandeling te scannen, op zoek naar de gewenste verhouding van DNA-apparaten.

an-optimized-mouse-embryonic-stem-cell-based-reverse-poly

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Complexe genetische circuits zijn tijdrovend om te ontwerpen, testen en optimaliseren. Om dit proces te vergemakkelijken, worden zoogdiercellen getransfecteerd op een manier die het testen van meerdere stoichiometrieën van circuitcomponenten in een enkele put mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft de stappen voor experimentele planning, transfectie en data-analyse.

Snelle ontwikkeling van celtoestandsidentificatiecircuits met polytransfectie

Ontdek een geoptimaliseerde omgekeerde polytransfectiemethode voor muizenembryonale stamcellen in 2i- en LIF-medium. Deze aanpak verbetert celviabiliteit en transfectie-efficiëntie voor snelle optimalisatie van plasmideverhoudingen.

Een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen (Video) | JoVE Journal

Een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen

Meer video's verkennen