Name: Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van multipotente stamcellen uit tandpulp via enzymatische digestie. Deze methode toont differentiatie naar osteoblasten, adipocyten en chondrocyten voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Dr. Mathew Mazhavancheril, directeur en hoofd van het Pushpagiri Research Centre in Thiruvalla, dankbaar voor zijn steun bij het documenteren van de procedures in het Research Centre.

Het hierin beschreven protocol is in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele ethische commissie voor menselijk onderzoek (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Het gebruik van geëxtraheerde tanden werd uitgevoerd volgens ethische normen om de integriteit, waardigheid en rechten van de deelnemers te waarborgen. De deelnemers die voor deze studie werden geselecteerd, waren gezonde personen jonger dan 30 jaar die tandextractie nodig hadden voor een orthodontische behandeling. Degenen met uitgebreide tandcariës of ernstige parodontitis werden uitgesloten van het onderzoek. Bladverliezende tanden werden verzameld van kinderen die de extractie van achtergebleven tanden nodig hadden. Er werd ook geïnformeerde schriftelijke toestemming verkregen van de proefpersonen die bij dit onderzoek betrokken waren.
1. Extractie en transport van tanden en kiezen
<ol><li>Verzameling van melk- en blijvende tanden<ol><li>Leg aan de deelnemers het doel van de procedure uit en het mogelijke gebruik van de getrokken tanden voor onderzoeksdoeleinden.</li>
		<li>Voer tandextractie uit onder plaatselijke verdoving door een verdovingsmiddel toe te dienen in de buurt van de te trekken tand. In het bijzonder werd voor dit onderzoek 1,75 ml lidocaïne gemengd met epinefrine (zie materiaaltabel) in een verhouding van 1:200.000 geïnjecteerd. Het heeft de voorkeur om tanden te selecteren die geen ernstige tandcariës of parodontitis vertonen20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>Transport van de geëxtraheerde tanden OPMERKING: Werken onder aseptische omstandigheden wordt aanbevolen om besmetting te voorkomen. Dit omvat het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen en een laboratoriumjas, en werken in een steriele omgeving, zoals een biohazard laminaire flowkap.<ol><li>Nadat de tand is getrokken, spoelt u deze af met een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om het bloed en ander vuil te verwijderen. Verwijder met een steriele tang en scalpel voorzichtig alle vastzittende resten van zacht weefsel van het tandoppervlak (Figuur 2A).</li>
		<li>Dompel de tand onder in een desinfecterende oplossing, zoals 70% ethanol, gedurende 10 s. Spoel de tand na de desinfectie af met steriel PBS om eventuele resten van het desinfectiemiddel weg te spoelen.</li>
		<li>Plaats de tand in een steriele container met het transportmedium. OPMERKING: Het transportmedium bestond uit Alpha-MEM, een commercieel kweekmedium aangevuld met antibiotica: 100 E/ml penicilline/streptomycine (zie Materiaaltabel). Dit medium leverde essentiële voedingsstoffen aan de cellen in de geëxtraheerde tand, waardoor hun overleving tot laboratoriumverwerking werd gegarandeerd. De antibiotica dienden om de groei van bacteriën te remmen.</li>
		<li>Houd tijdens het transport een temperatuur van 4 °C aan om de cellulaire metabolische activiteiten te vertragen en de celdood te vertragen. Transporteer de tand naar het laboratorium voor de volgende stappen, waaronder het verwerken en isoleren van de stamcellen van de tandpulpa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Verzameling van pulpaweefsel
<ol><li>Zet de tand vast met een tandtang om ervoor te zorgen dat deze tijdens de procedure op zijn plaats blijft. Gebruik een diamantschijf om de tand in een tandheelkundig handstuk te snijden (zie Tabel met materialen) dat is aangesloten op een waterkoelmiddel (Figuur 2B). OPMERKING: Het doel is om de pulpakamer bloot te leggen zonder onnodige schade aan het pulpaweefsel binnenin te veroorzaken.</li>
	<li>Gebruik een tandheelkundig graafwerktuig (zie Materiaaltabel) om het pulpweefsel te verwijderen. Dit instrument maakt het mogelijk om pulpa te extraheren zonder schade aan te richten, waardoor de levensvatbaarheid van de stamcellen van de tandpulpa behouden blijft (Figuur 2C).</li>
	<li>Leg het verkregen zakdoekje op een glazen petrischaaltje. Was het pulpaweefsel met fosfaatgebufferde zoutoplossing.</li>
</ol>3. Vertering van pulpaweefsel en celisolatie
<ol><li>Weefselverminking en spijsvertering<ol><li>Hak met een steriel chirurgisch mes het pulpaweefsel voorzichtig in kleine stukjes (Figuur 2D) en plaats het in een mini-weefselvermaler met PBS om een fijn gehomogeniseerd mengsel te verkrijgen. Dit proces vergroot het oppervlak van het weefsel, waardoor een efficiëntere enzymwerking tijdens de spijsvertering mogelijk wordt.</li>
		<li>Breng de gehakte homogene weefselfragmenten over in een buisje van 15 ml en verteer enzymatisch met een mengsel van 3 mg/ml collagenase type I en 4 mg/ml dispase (zie Materiaaltabel). Deze enzymen werden opgelost in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) om de gewenste concentraties te bereiken.</li>
		<li>Incubeer het pulpaweefsel in het enzymmengsel (stap 3.1.2) gedurende ongeveer 2 uur bij 37 °C. Na incubatie neutraliseert u de enzymen en verzamelt u de cellen door centrifugatie (stap 3.2.1) voor verdere kweek.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeren en resuspensie<ol><li>Breng het verteerde weefsel na incubatie over in een centrifugebuis van 15 ml en draai het 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g om de cellen te pelleteren. Deze stap scheidt de cellen van de resterende onverteerde weefselfragmenten en enzymen. Gooi het bovendrijvende medium voorzichtig weg en zorg ervoor dat u de celkorrel op de bodem van de buis niet verstoort.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellet in een vers kweekmedium. Dit medium biedt de nodige voedingsstoffen en omgeving voor de geïsoleerde cellen om te overleven en zich te vermenigvuldigen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Celcultuur
<ol><li>Plateren en incubatie van cellen<ol><li>Breng de geresuspendeerde cellen voorzichtig over in een kweekkolf van 25 cm². OPMERKING: Al het materiaal van een enkele pulp wordt overgebracht in een enkele 25 cm2-cellige cultuurkolf. Een mediavolume van 5-7 ml zorgt voor voldoende dekking en beschikbaarheid van voedingsstoffen voor de cellen. Zorg ervoor dat het kweekmedium voor DPSC's Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) is, aangevuld met 10%-20% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel) om de nodige groeifactoren te leveren. Vul het medium verder aan met 1% penicilline/streptomycine om bacteriële besmetting te voorkomen. Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig over de kolf zijn verdeeld om een homogene groei te bevorderen.</li>
		<li>Incubeer de kolf bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 .</li>
	</ol></li>
	<li>Gemiddelde verandering en monitoring van confluency<ol><li>Vervang het kweekmedium elke 2-3 dagen om verse voedingsstoffen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. Om dit te doen, zuigt u het oude medium voorzichtig op met een steriele serologische pipet en vervangt u het door een nieuw medium.</li>
		<li>Controleer de celcultuur regelmatig onder een microscoop om de groei van de cellen te volgen en controleer op tekenen van besmetting.</li>
		<li>Ga door met dit proces totdat de cellen 80%-90% confluentie bereiken, het punt waarop de cellen het grootste deel van het oppervlak van de kolf bedekken, maar niet te druk zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Celtrypsinisatie en passaging of bevriezing<ol><li>Zodra de cellen 80%-90% confluentie bereiken, verwijdert u het kweekmedium en wast u de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om het resterende medium en niet-aanhangende cellen te verwijderen.</li>
		<li>Voeg een oplossing van 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kolf om de cellen los te maken van het oppervlak van de kolf. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.</li>
		<li>Neutraliseer de trypsine door een gelijk volume kweekmedium toe te voegen en pipetteer de celsuspensie vervolgens voorzichtig op en neer om volledige celloslating te garanderen.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in een vers kweekmedium en leg ze opnieuw op de plaat (passage) voor verdere groei of vries ze in voor toekomstig gebruik. Gebruik bij het invriezen een invriesmedium dat een cryoprotectant bevat, zoals DMSO, om de cellen te beschermen tegen schade tijdens het invriezen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Karakterisering van DPSC's
<ol><li>Analyse van flowcytometrie<ol><li>Om de mesenchymale stamcelaard van de geïsoleerde cellen te bevestigen, voert u flowcytometrieanalyseuit 22,23. Probeer in eerste instantie cellen te trypsiniseren en te verzamelen zoals beschreven in stap 4.3.</li>
		<li>Bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van de trypankleurstofuitsluitingstechniek. Voer de analyse uit met behulp van een cellevensvatbaarheidsanalysator (zie Materiaaltabel) tijdens de2e en 8epassage. Voer fenotypische analyse uit via een flowcytometer tijdens de 3een 7epassage.</li>
		<li>Was de cellen na incubatie in een flowcytometriebuffer om overtollige antilichamen te verwijderen en analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer. OPMERKING: De flowcytometriebuffer is samengesteld uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS), 1%-2% foetaal runderserum (FBS) en 0,1% natriumazide (NaN3). De FBS of BSA blokkeert de niet-specifieke binding van antilichamen, terwijl het natriumazide als conserveermiddel werkt. Een hoog percentage cellen moet de mesenchymale stamcelmarkers tot expressie brengen en de hematopoëtische markers missen, wat hun identiteit als DPSC's bevestigt24.</li>
		<li>Maak de DPSC's los en kleur ze met immunofluorescentie-antilichamen voor flowcytometrieanalyse. OPMERKING: De selectie van markers voor flowcytometrie-analyse van mesenchymale stamcellen (MSC's) is gebaseerd op de consensus die is vastgesteld door de International Society for Cellular Therapy (ISCT), die stelt dat MSC's CD105, CD73 en CD90 tot expressie moeten brengen en niet tot expressie moeten komen van CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79a of CD19 en HLA klasse II25. Deze markers worden vaak gebruikt in onderzoeken naar stamcellen van tandpulpa26. De concentraties van antilichamen voor kleuring kunnen variëren afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt, en het wordt aanbevolen om de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) te volgen voor antilichaamverdunningen en incubatieomstandigheden25.</li>
		<li>Stel de classificatiecriteria27,28 vast voor de expressie van CD-markers zoals vermeld: minder dan 10%, geen expressie; tussen 11% en 40%, lage expressie; een bereik van 41% tot 70%, matige expressie; boven de 71%, hoge expressie.</li>
		<li>Bevestig bovendien de afwezigheid van hematopoëtische markers door een afzonderlijk celaliquot met antilichamen tegen CD34 en CD45 te incuberen.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Differentiatie van meerdere afstammingslijnen
OPMERKING: De volgende stappen schetsen protocollen voor osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van tandheelkundige stamcellen. Begin met het zaaien van culturen met een dichtheid van 1 x 10,5 cellen per putje in een met fibronectine beklede weefselkweekplaat met volledig medium (CM). Bewaak de celgroei totdat 80%-90% confluentie is bereikt voordat het gewenste differentiatieprotocol wordt gestart. Om het differentiatiepotentieel van de DPSC's in meerdere afstammingslijnen te evalueren, start u het differentiatieproces naar osteoblasten, adipocyten en chondrocyten door cellen in platen met 24 putjes te zaaien en ze te kweken in geschikte differentiatiemedia.
<ol><li>Osteogene differentiatie<ol><li>Begin met het kweken van DPSC's in een regulier groeimedium onder standaardomstandigheden totdat ze 70%-80% samenvloeiing bereiken.</li>
		<li>Verwijder het groeimedium van de cellen en was de cellen vervolgens één keer met 1x PBS. Voeg het Osteogenic Differentiation Medium (ODM) toe aan de cellen. OPMERKING: De ODM bestaat uit Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml amfotericine B, 50 μg/ml ascorbinezuur, 10 mM bèta-glycerofosfaat en 100 nM dexamethason (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Incubeer de cellen in het osteogene medium bij 37 °C met 5% CO2 . Vervang het osteogene medium elke 2-3 dagen. OPMERKING: Na 14 tot 21 dagen zouden de DPSC's gedifferentieerd moeten zijn tot osteoblastachtige cellen. Dit kan worden bevestigd door te controleren op een toename van de expressie van osteoblast-specifieke markers, zoals alkalische fosfatase, of door kleuringstechnieken te gebruiken om gemineraliseerde matrix te detecteren, zoals Alizarin Red S-kleuring.</li>
		<li>Fixeer de cellen door ze gedurende 1 uur bij -20 °C te incuberen met 70% ijskoude ethanol.</li>
		<li>Kleuring van de vaste cellen met 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) kleuroplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 10-15 min. Visualiseer de kleuring onder een microscoop om osteogene differentiatie te bevestigen (Figuur 3). Bevestig de differentiatie door de cellen te kleuren met Alizarin Red S, dat calciumafzettingen identificeert die wijzen op mineralisatie29,30.</li>
	</ol></li>
	<li>Adipogene differentiatie<ol><li>Zoals beschreven in het vorige hoofdstuk, kweek DPSC's onder standaardomstandigheden in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C. Passage de cellen wanneer ze ongeveer 70%-80% samenvloeiing bereiken.</li>
		<li>Zuig het medium op en was de cellen één keer met 1x PBS. Vervang het uitgespoelde medium door adipogeen differentiatiemedium. Dit medium bestaat over het algemeen uit DMEM, 10% FBS, 10 μg/ml insuline, 1 μM dexamethason, 200 μM indomethacine en 0,5 mM IBMX (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Verander het differentiatiemedium elke 3-4 dagen. Was na ongeveer 3 weken de adipogeen-gedifferentieerde DPSC's met PBS en fixeer ze met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Kleur de vaste cellen met Oil Red O (zie Tabel met materialen) om de ophoping van lipidedruppels te visualiseren (Figuur 4). Om adipogene differentiatie verder te bevestigen, voert u genexpressieanalyse uit van adipogene markers zoals peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor gamma (PPARγ) en adiponectine31,32.</li>
	</ol></li>
	<li>Chondrogene differentiatie<ol><li>DPSC-culturen die worden bewaard in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C worden gebruikt voor chondrogene differentiatie. Passage de cellen wanneer ze ongeveer 70%-80% samenvloeiing bereiken.</li>
		<li>Zuig het medium op en was de cellen één keer met 1x PBS. Vervang het vervaagde medium door chondrogenisch differentiatiemedium, dat doorgaans Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 1% ITS, 100 nM dexamethason, 50 μg/ml ascorbaat-2-fosfaat, 40 μg/ml proline en 10 ng/ml Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) bevat (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Houd de cellen in het chondrogene differentiatiemedium en verander het medium elke 2-3 dagen. Na ongeveer drie weken zouden de DPSC's gedifferentieerd moeten zijn in chondrocyt-achtige cellen.</li>
		<li>Fixeer de cellen door ze 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 4% paraformaldehyde (PFA). Kleuring de cellen na fixatie met Alcian Blue (zie Tabel met materialen) en visualiseer ze onder een microscoop om chondrogene differentiatie te bevestigen (Figuur 5).</li>
		<li>Bevestig de differentiatie van DPSC's in chondrocyten met behulp van technieken zoals Alcian Blue-kleuring voor proteoglycanen of genexpressieanalyse van chondrogene markers zoals aggrecan, SOX9 en type II collageen33,34.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol schetst de isolatie, cultuur en karakterisering van tandpulpstamcellen (DPSC's) uit menselijke melktanden en permanente tanden. Het bevat een beschrijving van de opslag en proliferatie van deze cellen, evenals de beoordeling van hun in vitro differentiatiepotentieel tot osteoblasten, adipocyten en chondrocyten35.
Chen et al.36 toonden aan dat tandpulpstamcellen (DPSC's) kunnen worden verkregen uit verschillende bronnen, waaronder geïnfecteerde vitale menselijke tanden die zijn aangetast door aandoeningen zoals parodontitis, wortelresorptie, pericoronitis en tandbreuken, evenals overtallige en verkeerd uitgelijnde tanden. Deze bevinding werd verder bevestigd door latere studies die geïnfecteerde vitale tanden identificeerden als mogelijke bronnen van DPSC's 37,38,39,40. Bernardi et al.10 wezen er echter op dat verhoogde wortelresorptie de levensvatbaarheid van deze stamcellen nadelig zou kunnen beïnvloeden. Een belangrijke hindernis in het proces is het behoud van de cellen en het voorkomen van hun afbraak, die onmiddellijk na het trekken of afschilferen van tanden begint. Bovendien is het belangrijk op te merken dat tanden die zijn aangetast door ernstige aandoeningen zoals periapicale abcessen, tumoren of cysten niet mogen worden gebruikt om stamcellen te extraheren40,41.
DPSC's kunnen worden verkregen via de enzymatische vertering (ED) techniek of de uitgroei uit weefsel explantaten (OG) methode, ook bekend als de spontane groeitechniek14,15. Onderzoekers gebruiken deze strategieën om de efficiëntie van celproliferatie of het behoud van morfologische en fenotypische kenmerken van geïsoleerde stamcellen te onderzoeken17. Studies hebben aangetoond dat stamcellen die via de OG-methode zijn geïsoleerd, een langzamere proliferatiesnelheid en een zwakkere expressie van stamcelmarkers vertonen18. Omgekeerd vertoonden DPSC's geïsoleerd via de ED-methode een snellere proliferatie, differentiatie en verhoogde expressie van extra oppervlaktemarkers dan die geïsoleerd door de OG-methode. Interessant is dat onrijpe stamcellen van tandpulp (IDPSC's) geëxtraheerd uit melktanden met behulp van de OG-techniek aantoonden dat celcultuur de selectieve proliferatie van IDPSC's aanmoedigde, waardoor vroege differentiatie werd voorkomen42.
De zuivering van DPSC's is cruciaal voor het verkrijgen van sterk regeneratieve cellen en vereist specifieke celmarkers. Celselectie wordt uitgevoerd met behulp van fluorescentie- of magnetisch geactiveerde celsorteermethoden. Naast de bovengenoemde markers worden ook tal van andere oppervlakteantigenen gebruikt vanwege de heterogene aard van DSC's43. Er is echter geen enkele marker geïdentificeerd om de subpopulaties te scheiden.
Vergeleken met mesenchymale stamcellen afkomstig van beenmerg, zijn DPSC's erkend als een veelbelovende bron van multipotente cellen vanwege hun potentieel voor meerdere afstammingslijnen44. Deze stamvorming is waarschijnlijk het gevolg van de relatieve onrijpheid van de bronweefsels, aangezien verstandskiezen, vaak de bron van DPSC-extractie, de laatste permanente tanden zijn die zich ontwikkelen en dus minder rijp zijn dan beenmerg45. Dit protocol onderzoekt met succes de multipotente aard van stamcellen van tandpulpa door deze cellen te induceren om adipogenese, osteogenese en chondrogenese te ondergaan. Met name DPSC's zijn het enige celtype dat de DSPP-expressie opreguleert wanneer ze onder osteogene omstandigheden worden gekweekt, wat een indicatie is van hun toekomstige differentiatie in odontoblasten46.
Tandstamcellen, geïsoleerd uit verschillende bronnen, vertonen veel proliferatie- en differentiatiemogelijkheden47. De aanzienlijke vooruitgang die is geboekt in in-vitrosystemen heeft een diepgaande invloed gehad op de stamcelbiologie en -therapieën. Ondanks deze vooruitgang blijven er uitdagingen bij het vertalen van stamceltherapieën van de bank naar het bed. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de overleving en stabiliteit van stamcellen om ervoor te zorgen dat conserveringstechnieken de levensvatbaarheid van deze cellen niet in gevaar brengen. Hoewel tandheelkundig stamcelonderzoek veelbelovende resultaten heeft opgeleverd in diermodellen, is er een dringende behoefte om deze bevindingen uit te breiden naar proeven bij mensen. Door rigoureus onderzoek en ontwikkeling te blijven stimuleren, zijn tandheelkundige stamcellen klaar om een substantiële rol te spelen bij het bevorderen van het gebied van stamcelbankieren.
Hoewel het veel wordt gebruikt, heeft de enzymatische vergistingsbenadering voor het isoleren van tandpulpstamcellen (DPSC's) verschillende beperkingen. In de eerste plaats kan het proces de levensvatbaarheid van de cel in gevaar brengen, omdat enzymen zoals collagenase en dispase onbedoeld celmembranen kunnen beschadigen, waardoor er minder levende stamcellen ontstaan17. Bovendien resulteert deze methode vaak in de afbraak van de vitale extracellulaire matrix (ECM), die cruciaal is voor het behoud van de inherente eigenschappen van stamcellen48. De procedure kan ook de markers op het celoppervlak veranderen, waardoor de nauwkeurige identificatie en karakterisering van DPSC's wordt belemmerd43. Afgezien van deze biologische beperkingen is de aanpak tijdrovend, waardoor de risico's van microbiële besmetting als gevolg van langdurige incubaties bij 37 °C toenemen. Bovendien kan de inconsistentie tussen enzymbatches leiden tot variabele resultaten, waardoor de reproduceerbaarheid van de isolatieprocedure in het gedrang komt. De financiële last kan niet over het hoofd worden gezien, aangezien hoogwaardige enzymen die geschikt zijn voor weefselvertering duur zijn49. Bovendien kan in de nasleep van de spijsvertering residuele enzymactiviteit optreden die de celculturen nadelig kan beïnvloeden en hun gezondheid, proliferatie en differentiatie kan beïnvloeden. Ten slotte kan het potentieel voor enzymatische vertering om bepaalde DPSC-subpopulaties bij voorkeur te isoleren boven andere, de resulterende celpool onbedoeld scheeftrekken, waardoor hun therapeutisch potentieel wordt beïnvloed50.

Stamcelonderzoek is tot bloei gekomen in de biomedische wetenschap vanwege de veelbelovende toepassingen in regeneratieve geneeskunde en weefselmanipulatie. Tandpulpstamcellen (DPSC's), afgeleid van het pulpaweefsel van zowel menselijke melktanden als permanente tanden, hebben veel belangstelling getrokken als bron van stamcellen vanwege hun gemakkelijke beschikbaarheid en multipotente capaciteit 1,2. Deze cellen hebben het potentieel om te differentiëren in verschillende celtypen, waaronder adipocyten, osteoblasten en chondrocyten, zoals bevestigd door talrijke onderzoeken3.
In de afgelopen decennia zijn het onderzoek en de therapeutische toepassingen van stamcellen enorm toegenomen. Het uitgebreide potentieel van stamcellen vereist een diversificatie van de bronnen waaruit ze worden verkregen. Verschillende factoren zijn van invloed op de efficiëntie, levensvatbaarheid en stambaarheid van de gekozen cellen. Ondanks het bestaan van verschillende bekende stamcelreservoirs, zoals beenmerg en vetweefsel, beperken de invasieve procedures, de morbiditeit op de plaats en de ethische bezwaren in verband met deze bronnen vaak hun exploratie 4,5. Onder de verschillende stamcelbronnen hebben tandheelkundige stamcellen aandacht gekregen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid, hoge plasticiteit en diverse mogelijke toepassingen. Met name stamcellen van menselijke tandpulpa zijn uitgebreid onderzocht op hun therapeutische vooruitzichten6. Tanden, die vaak worden weggegooid als medisch afval, bevatten een schat aan mesenchymale stamcellen7. Het beschermen van deze waardevolle stamcelpool vereist collectieve inspanningen van patiënten, tandartsen en artsen om ervoor te zorgen dat deze middelen niet worden verspild, waardoor elke stamcel van tandpulp beschikbaar komt voor toekomstige regeneratieve behoeften.
Van tandpulp afgeleide stamcellen, zoals menselijke volwassen tandpulpstamcellen (DPSC's) en stamcellen van geëxfolieerde menselijke melktanden (SHED), bevinden zich in de perivasculaire nis van de tandpulpa. Aangenomen wordt dat deze cellen afkomstig zijn van craniale neurale topcellen en vroege markers vertonen voor zowel mesenchymale stamcellen (MSC's) als neuro-ectodermale stamcellen. DPSC's en SHED's hebben multipotentie aangetoond en het vermogen om verschillende weefseltypes te regenereren8.
Mogelijke bronnen van tandstamcellen omvatten gezonde melktanden en permanente tanden. Stamcellen vormen slechts ongeveer 1% van de totale celpopulatie in de pulpa, wat het belang van effectieve isolatie- en expansietechnieken benadrukt9. Bijgevolg zijn de extractie en expansie van deze stamcellen cruciale stappen in DPSC-isolatie10. Geëxtraheerde of geëxfolieerde tanden moeten worden bewaard in een voedingsrijk transportmedium, zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks-gebufferde zoutoplossing (HBSS).
Het verkrijgen van tandpulp kan op verschillende manieren worden bereikt, afhankelijk van het tandtype 7,11. Voor melktanden met geresorbeerde wortels kan extractie worden uitgevoerd via de worteltop. Evenzo kunnen steriele broches met weerhaken worden gebruikt om pulp te verkrijgen van permanente tanden met een onrijpe open top. In het geval van blijvende tanden met volledig ontwikkelde wortels, omvat toegang tot de pulpakamer het scheiden van de tandkroon van de wortel. Dit wordt bereikt door de tand door te snijden met behulp van een diamantschijf bij de cementemailverbinding. Deze incisie legt de pulpakamer bloot, waardoor het pulpaweefsel kan worden opgehaald 12,13,14.
Tandpulpstamcellen (DPSC's) kunnen worden geïsoleerd door enzymatische vertering (ED) of uitgroei uit weefselexplantaten (OG), ook wel spontane groei genoemd. De ED-methode maakt gebruik van enzymen, voornamelijk collagenase I en dispase, om het weefsel af te breken tot eencellige suspensies15,16. De OG-methode, eenvoudiger en sneller, houdt in dat de pulpfragmenten worden gehakt en direct in een kweekplaat worden geplaatst, waardoor cellen uit de weefselexplantaten kunnen groeien17. Onderzoekers hebben beide technieken gebruikt en vergeleken om de celproliferatiesnelheid, het behoud van geïsoleerde stamceleigenschappen, differentiatie en de expressie van oppervlaktemarkers tebeoordelen18. Het opstellen en standaardiseren van protocollen voor het verwerven van DPSC's met een hoge efficiëntie en stamkracht kan de weg vrijmaken voor effectieve en veilige therapieën19. Dit protocol omvat het extraheren van DPSC's met behulp van enzymatische vergisting, laboratoriumverwerking, conservering en celdifferentiatie met colorimetrische kleuring voor adipogenese, osteogenese en chondrogenese.
Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, presenteert een stapsgewijze procedure, te beginnen met de eerste isolatie van tandpulp uit de tand, gevolgd door de kweek en het onderhoud van DPSC's in het laboratorium, en eindigend met hun karakterisering met behulp van specifieke stamcelmarkers (Figuur 1). De technieken voor het induceren van deze stamcellen in verschillende cellijnen, waarbij hun multipotentie wordt benadrukt, worden ook beschreven.

```html
<table>
<tbody>
<tr>
<td>3-isobuty-l-methyl-xanthine&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>I5879</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Azijnzuur&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>AS001</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Alcian Blue&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>RM471</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Alizarin Red S staining solution</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>GRM894</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Alkaline phosphatase -Staining kit</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;-MEM)&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td>Gibco</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;-MEM)&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td>Gibco</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td>Gibco</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td>Gibco</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>P4333</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Ascorbaat-2-fosfaat</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>012-04802</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Beta-glycerofosfaat&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>G9422-10G</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Biosafety cabinet-Laminar flow hood</td>
<td>Labconco Corporation,MO 64132-2696,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, en HLA-DR</td>
<td>BioLegend, Inc.CA 92121,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cell strainer (70 &micro;m )</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>TCP025</td>
<td>Cell strainer</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>REMI Elektrotechnik Limited (REMI)</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>1101 | 1102</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>CO2 Incubator</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Collageenase type I</td>
<td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Collageenase type I</td>
<td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Complete Growth Medium</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>AT006</td>
<td>DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Conical tubes (15 of 50 )</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
<td>546021P/546041P</td>
<td>15 mL en 50 mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryo freezing container</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td>15-350-50</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cryolabels</td>
<td>Label India:</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cryovial storage boxes&nbsp;</td>
<td>Cryostore Storage Boxes</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cryovials</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cryovials (1.8 mL)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td>PW1282</td>
<td>Self standing</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture flask (25 cm&sup2;)</td>
<td>Corning Inc.NY 14831,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Culture flasks</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>TCG4/TCG6</td>
<td>T25/T75</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture Plates</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>TCP129/TCP008</td>
<td>60 mm/100 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Dental Diamond Discs</td>
<td>Komet SC 29730, USA</td>
<td></td>
<td>Komet&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dental Spoon Excavator</td>
<td>Brasseler,GA 31419,USA</td>
<td>5023591U0</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dexamethason</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>D4902-25MG</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dexamethosone</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>D4902-25MG</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dexamethosone</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>D4902-25MG</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
<td>TC185</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>Roche Diagnostics,Mannheim,Germany.</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol (70%)</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>MB106</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol -70%</td>
<td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td>
<td></td>
<td>Fisher Scientific</td>
</tr>
<tr>
<td>Extraction forceps&nbsp;</td>
<td>Dentsply Sirona, USA</td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
<td>F2442-500ML</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
<td>F2442-500ML</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td>
<td>RM9954</td>
<td></td>

isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth

Op het gebied van regeneratieve geneeskunde en therapeutische toepassingen wint stamcelonderzoek snel aan kracht. Tandpulpstamcellen (DPSC's), die aanwezig zijn in zowel melktanden als permanente tanden, zijn naar voren gekomen als een essentiële stamcelbron vanwege hun toegankelijkheid, aanpassingsvermogen en aangeboren differentiatievermogen. DPSC's bieden een direct beschikbaar en overvloedig reservoir van mesenchymale stamcellen, met een indrukwekkende veelzijdigheid en potentieel, met name voor regeneratieve doeleinden. Ondanks hun belofte ligt de belangrijkste hindernis in het effectief isoleren en karakteriseren van DPSC's, aangezien hun vertegenwoordiging als een minuscule fractie in tandpulpacellen. Even cruciaal is het juiste behoud van deze onschatbare cellulaire hulpbron. De twee overheersende methoden voor DPSC-isolatie zijn enzymatische vertering (ED) en uitgroei van weefselexplantaten (OG), vaak aangeduid als spontane groei. Dit protocol concentreert zich voornamelijk op de enzymatische vergistingsbenadering voor DPSC-isolatie, waarbij de stappen voor extractie, verwerking in het laboratorium en celbehoud ingewikkeld worden beschreven. Naast extractie en conservering gaat het protocol in op het differentiatievermogen van DPSC's. In het bijzonder schetst het de procedures die worden gebruikt om deze stamcellen te laten differentiëren in adipocyten, osteoblasten en chondrocyten, waarbij hun multipotente eigenschappen worden getoond. Het daaropvolgende gebruik van colorimetrische kleuringstechnieken vergemakkelijkt nauwkeurige visualisatie en bevestiging van succesvolle differentiatie, waardoor het kaliber en de functionaliteit van de geïsoleerde DPSC's worden gevalideerd. Dit uitgebreide protocol fungeert als een blauwdruk die het hele spectrum van extractie, teelt, conservering en karakterisering van tandpulpstamcellen omvat. Het onderstreept het substantiële potentieel van DPSC's, het voortstuwen van de exploratie van stamcellen en veelbelovend voor toekomstige regeneratieve en therapeutische doorbraken.

De succesvolle uitvoering van het geschetste protocol leverde tandpulpstamcellen (DPSC's) op die in staat zijn tot differentiatie van meerdere afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoont.
Levensvatbaarheidsanalyses De levensvatbaarheid van de DPSC's werd op verschillende tijdstippen beoordeeld met behulp van een Trypan Blue-uitsluitingstest. De resultaten tonen een consistent hoge levensvatbaarheid (meer dan 95%) gedurende de cultuurperiode, wat de robuustheid van ons isolatie- en cultuurprotocol aantoont.
Kolonievormende eenheid (CFU) assays CFU-assays werden uitgevoerd om het zelfvernieuwingsvermogen van de DPSC's te evalueren. Een eencellige suspensie werd met een lage dichtheid geplateerd en gedurende 14 dagen gekweekt. De gevormde kolonies werden vervolgens gekleurd en geteld. De resultaten laten veel kolonies zien, wat wijst op een hoog percentage zelfvernieuwende cellen binnen de DPSC-populatie.
Verdubbelingstijd van cellen De verdubbelingstijd van de cellen werd berekend op basis van de groeicurve van de DPSC's. Cellen werden met een specifieke dichtheid gezaaid en regelmatig geteld om een groeicurve te construeren. De verdubbelingstijd werd vervolgens berekend aan de hand van de exponentiële groeifase van de curve. De resultaten laten een verdubbelingstijd zien die consistent is met die gerapporteerd voor MSC's, wat wijst op een gezonde en proliferatieve celpopulatie (Figuur 6).
Analyse van flowcytometrie De flowcytometrie-analyse toonde aan dat een grote meerderheid van de DPSC's (bijv. >95%) positief was voor CD90, CD73 en CD105, wat hun identiteit als MSC's bevestigde (Figuur 7). Bovendien was minder dan 2% van de cellen positief voor CD45, CD34 en HLA-DR, wat de afwezigheid van significante hematopoëtische of endotheelcelbesmetting bevestigt.
Osteogene differentiatie Na voltooiing van de osteogene differentiatie vertoonden de cellen een gemineraliseerde matrix, die wordt gevisualiseerd door Alizarine Red S-kleuring (Figuur 3). De aanwezigheid van rode kleuring in de gekleurde cellen duidt op de succesvolle afzetting van een gemineraliseerde matrix, een essentieel kenmerk van osteogene differentiatie. Het onvermogen om met succes differentiatiekleuring te bereiken, kan mogelijk verband houden met uitdagingen waarmee u wordt geconfronteerd tijdens de monsterafnameprocedure.
Adipogene differentiatie Tijdens de adipogene differentiatie verzamelden de DPSC's lipidedruppeltjes, wat wijst op adipogenese. De lipidedruppeltjes kunnen worden waargenomen met Oil Red O-kleuring (Figuur 4). Een succesvolle differentiatie resulteerde in oranjerood gekleurde lipidedruppeltjes in de cellen.
Chondrogene differentiatie Ten slotte produceerden DPSC's na chondrogene differentiatie glycosaminoglycanen, een kritieke kraakbeencomponent die wordt bevestigd door Alcian Blue-kleuring, die zich bindt aan deze glycosaminoglycanen. Cellen die met succes chondrogenese ondergingen, vertoonden blauwe verkleuring bij kleuring (figuur 5).
De cellen die geen respectievelijke kleurveranderingen in de kleuringsprocedures vertoonden, kunnen te wijten zijn aan de suboptimale differentiatie, mogelijk als gevolg van problemen met de differentiatiemedia of de initiële kwaliteit van de DPSC's. Het is belangrijk om de kwaliteit van media en supplementen en het gezondheids- en passagenummer van de gebruikte DPSC's te waarborgen. De succesvolle differentiatie van DPSC's in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten bevestigt de multipotente aard van deze cellen en onderstreept hun potentieel in regeneratieve geneeskunde en therapeutische toepassingen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de isolatie, karakterisering en differentiatie van stamcellen van tandpulpa. Deze afbeelding geeft een schematische weergave van de workflow voor het isoleren, karakteriseren en differentiëren van tandpulpstamcellen (DPSC's). Het proces begint met de extractie van de tand (of tanden), gevolgd door de isolatie van het pulpaweefsel, waaruit de DPSC's zijn afgeleid. Na isolatie ondergaan de DPSC's verschillende karakteriseringstests om hun stamcelidentiteit te bevestigen en hun levensvatbaarheid, proliferatiesnelheid en andere belangrijke kenmerken te beoordelen. De laatste fase die in dit diagram wordt weergegeven, omvat de inductie van differentiatie, waarbij de DPSC's worden behandeld met specifieke factoren om hun transformatie naar gespecialiseerde celtypen, zoals osteoblasten, adipocyten of chondrocyten, te begeleiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig02.jpg"> Figuur 2: Pulpa-extractie van geëxtraheerde tanden. (A) Een geëxtraheerde tand die is voorbereid voor pulpaweefselextractie. (B) Doorsneden van de geëxtraheerde tand met behulp van een diamantboor. (C) Verwijdering van het pulpaweefsel uit de pulpakamer. (D) Fragmentatie van het pulpaweefsel met behulp van een chirurgisch mes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig03.jpg"> Figuur 3: Osteogene differentiatie van tandpulpastamcellen (DPSC's) aangetoond door Alizarine Red S-kleuring (40x). De felrode kleuring onthult de afzetting van de gemineraliseerde matrix, een kenmerkend kenmerk van osteoblasten, wat een succesvolle osteogene differentiatie bevestigt. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig04.jpg"> Figuur 4: Adipogene differentiatie van tandpulpastamcellen (DPSC's) aangetoond door Oil Red O-kleuring. De aanwezigheid van felrode druppeltjes vertegenwoordigt lipidenaccumulatie, een kenmerk van adipocyten, wat een succesvolle adipogene differentiatie bevestigt. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig05.jpg"> Figuur 5: Chondrogene differentiatie van tandpulpastamcellen (DPSC's) aangetoond door Alcian Blue Staining (40x). De intens blauwe kleur duidt op de aanwezigheid van een proteoglycaanrijke extracellulaire matrix, een kenmerk van chondrocyten, wat een succesvolle chondrogene differentiatie bevestigt. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig06.jpg"> Figuur 6: Celverdubbelingstijd voor tandpulpastamcellen (DPSC's). Deze figuur illustreert de groeicurve van DPSC's in de loop van de tijd. Cellen werden aanvankelijk gezaaid met een specifieke dichtheid en celtellingen werden met regelmatige tussenpozen gemeten (weergegeven op de x-as) om de proliferatiesnelheid te volgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig07.jpg"> Figuur 7: Expressie van stamceloppervlaktemarkers in DPSC-cultuur. Deze figuur toont de expressie van specifieke oppervlaktemarkeringen op DPSC's. De mesenchymale stamcelmarkers CD44, CD90 en CD105 vertonen hoge expressieniveaus, wat wijst op de aanwezigheid van mesenchymale eigenschappen in deze cellen. Omgekeerd is de expressie van hematopoëtische markers (CD34 en CD45) en het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex klasse II-molecuul (HLA-DR) bijna verwaarloosbaar, wat de afwezigheid van hematopoëtische afstammingscellen in de cultuur bevestigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

In the realm of regenerative medicine and therapeutic applications, stem cell research is rapidly gaining traction. Dental pulp stem cells (DPSCs), which ...

Begin met het vastzetten van de getrokken menselijke tand op zijn plaats met een tandtang. Snijd vervolgens de tand af met behulp van een diamantschijf die is verbonden met een tandheelkundig handstuk en een waterkoelmiddel. Verwijder met een tandgraafmachine het pulpaweefsel van de tand.Gebruik vervolgens een steriel chirurgisch mes om het pulpaweefsel voorzichtig in kleine fragmenten te hakken. Plaats deze fragmenten vervolgens in een mini-weefselvermaler met PBS om een homogeen mengsel te vormen. Breng de gehakte weefselfragmenten over in een buis van 15 milliliter en verteer ze met een mengsel van collagenase type één en dispase.Incubeer het weefsel in het enzymmengsel bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Neutraliseer na incubatie de enzymen. Breng vervolgens het verteerde weefsel over in een buis van 15 milliliter en draai gedurende vijf minuten op 300 G bij kamertemperatuur.Gooi het supernatans vervolgens voorzichtig weg en suspendeer de pellet opnieuw in verse DMEM, aangevuld met 10 tot 20%FBS. Breng voor celkweek de celsuspensie voorzichtig over in een kweekkolf van 25 vierkante centimeter. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in 5%koolstofdioxide.Zuig het medium na twee tot drie dagen voorzichtig op met een steriele serologische pipet en vervang het door een vers medium. Schakel vervolgens, voor de karakterisering van DPSC's, de flowcytometer in en bevestig de mesenchymale stamcelaard van de geïsoleerde cellen. De succesvolle differentiatie van DPSC's in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten bevestigt de multi-potente aard van DPSC's.De verdubbelingstijd van DPSC's kwam overeen met die gerapporteerd voor mesenchymale stamcellen, wat wijst op een gezonde en proliferatieve celpopulatie. De flowcytometrie-analyse toonde aan dat een meerderheid van de DPSC's positief was voor CD-90, CD-73 en CD-105, wat hun identiteit als mesenchymale stamcellen bevestigt. Bovendien was minder dan 2% van de cellen positief voor CD-34, CD-45 en HLADR, wat de afwezigheid van significante hematopoëtische of endotheelcelbesmetting bevestigt.

isolation-culture-characterization-dental-pulp-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

Wij bieden protocollen voor evaluatie van mesenchymale stamcellen van tandmerg geïsoleerd en prostaatkanker cel interacties op basis van directe en indirecte co kweekmethoden. Voorwaarde medium en trans-well membranen zijn geschikt voor het analyseren van indirecte paracrine activiteit. Zaaien differentieel is gekleurd cellen samen een passend model voor directe cel-cel interactie.

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te...

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling, groei en in vivo beeldvorming van NK cellen uit hESCs en iPSCs.

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

We presenteren een protocol om te onderzoeken het mRNA uitdrukking biomarkers voor beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) geïnduceerd door vitamine C (vitamine C) en 1,25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes.

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Leer de isolatie en cultuur van multipotente stamcellen uit tandpulp via enzymatische digestie. Deze methode toont differentiatie naar osteoblasten, adipocyten en chondrocyten voor regeneratieve geneeskunde.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

Meer video's verkennen