Name: Ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Leer hoe je gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels uit runderlongweefsel ontwikkelt en karakteriseert. Deze methode optimaliseert decellularisatieprotocollen voor mechanische stabiliteit en biologische relevantie in longweefselmodellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TÜBİTAK) (subsidie nr. 118C238). De volledige verantwoordelijkheid van de publicatie/paper ligt bij de eigenaar van de publicatie. De financiële steun van TÜBİTAK betekent niet dat de inhoud van de publicatie in wetenschappelijke zin door TÜBİTAK is goedgekeurd. De auteurs zijn dankbaar voor het gebruik van de diensten en faciliteiten van het Koç University Research Center for Translational Medicine (KUTTAM). Figuur 1 en Figuur 2a zijn gemaakt met behulp van Biorender.com.

Verse inheemse longen van jonge (1-2 jaar oude) runderdonoren werden verkregen uit een plaatselijk slachthuis en vervoerd in een verzegelde plastic container op ijs naar het laboratorium. Dierenoffers worden uitgevoerd voor algemene vleesconsumptie (longen weggegooid als afval) en zijn niet gerelateerd aan of vanwege het onderzoek. Wij bevestigen dat het slachthuis voldoet aan de nationale wet- en regelgeving voor het offeren van dieren. Verder bevestigen we dat we alleen afvalmateriaal hebben gebruikt en dat het onderzoeksproject geen effect heeft gehad op het aantal geofferde dieren.
1. Oogst van organen en weefselvoorbereiding
<ol><li>Bewaar vers verkregen runderlongweefsel bij -80 °C tot het experiment.</li>
	<li>Wacht op de dag van het experiment tot bevroren longweefsel bij kamertemperatuur is ontdooid.</li>
	<li>Ontleed de weefsels met steriele scalpels en een schaar om de luchtpijp en kraakbeenachtige luchtwegen te verwijderen en hak ze verder in kleine stukjes (5 mm3).</li>
	<li>Grondig wassen met ultrapuur water dat 2% penicilline/streptomycine (P/S) bevat, minstens 3x.</li>
</ol>2. Decellularisatie van weefsels
OPMERKING: Inheemse runderlongweefsels werden gedecellulariseerd met behulp van twee verschillende protocollen.
<ol><li>Vries-dooi methode<ol><li>Bereid weefselmonsters voor volgens stap 1. Dompel gehakte weefsels gedurende 1 minuut onder in 2% jodiumoplossing in steriel gedestilleerd water (dH2O). Voer twee opeenvolgende wasbeurten uit in steriele dH2O.</li>
		<li>Breng gehakte stukjes weefsel over in een buis van 50 ml tot het niveau van 15 ml en voer vijf handmatige vries-dooicycli uit met behulp van een draagbare container met vloeibare stikstof. Vul de buizen tot aan de bovenkant met steriele dH2O en vries de buizen gedurende 2 minuten in vloeibare stikstof in. Breng ze na 2 minuten onmiddellijk over naar een waterbad van 37 °C gedurende 10 minuten. Dit is 1 cyclus van vries-dooi.</li>
		<li>Incubeer de monsters met 30 ml DNase-oplossing (10 E/ml) in 10 mM MgCl2-buffer (pH 7,5) gedurende 1 uur bij 37 °C onder constant schudden bij 100 rpm.</li>
		<li>Ga verder met een uitgebreide wasbeurt met steriele dH2O gedurende 3 dagen onder constant schudden bij 100 tpm, met aanvulling van de oplossing om de 24 uur.</li>
		<li>Voer vriesdrogen en cryofrezen als volgtuit 20: Vries de natte dECM-monsters gedurende 24 uur in bij -80 °C. Breng bevroren monsters over in een lyofilisator en gebruik ze in de droogmodus onder vacuüm gedurende 3 tot 4 dagen totdat ze volledig zijn gedroogd. Na voltooiing van het vriesdrogen maalt u de monsters tot een fijne poedervorm met behulp van een maalapparaat en droogijs. OPMERKING: Deze fijne poedertoestand wordt noodzakelijk geacht vanwege de verbeterde oplosbaarheid tijdens de volgende stadia van het verteringsproces.</li>
	</ol></li>
	<li>Triton-X-100 methode<ol><li>Bereid weefselmonsters voor volgens stap 1. Behandel longweefsel met 1% Triton-X-100 gedurende 3 dagen onder zachte rotatie bij 4 °C. Vervang de oplossing elke 24 uur.</li>
		<li>Incubeer de monsters met DNase-oplossing (10U/ml) in 10 mM MgCl2-buffer (pH 7,5) gedurende 1 uur bij 37 °C onder constant schudden.</li>
		<li>Ga door met een uitgebreide wasbeurt met steriele dH2O gedurende 3 dagen onder zachte rotatie, waarbij de oplossing elke 24 uur wordt bijgevuld.</li>
		<li>Voer vriesdrogen uit gevolgd door cryofrezen zoals beschreven in stap 2.1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. De spijsvertering van pepsine
<ol><li>Verteer dECM-monsters in poedervorm met een concentratie van 15 mg/ml (m/v) in pepsineoplossing (1 mg/ml pepsine in 0,01 M HCl, pH 2). Voer het monsterverteringsproces uit bij kamertemperatuur onder constant roeren gedurende 48 uur en handhaaf de pH van de oplossing regelmatig voor een effectieve vertering.</li>
	<li>Breng de digesten over in een buis en centrifugeer gedurende 10 minuten op 5000 x g .</li>
	<li>Vang het supernatans op en neutraliseer en buffer het tot fysiologische omstandigheden (pH 7, 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS)) door toevoeging van 5M NaOH en 10x PBS. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om geconcentreerde alkalische oplossingen te gebruiken voor de pH-aanpassing van de zure vertering, omdat deze aanpak ongewenste volume-uitzetting vermijdt die de gelering in de volgende stappen nadelig zou kunnen beïnvloeden.</li>
	<li>Bewaar de pre-gel digests bij -20 °C voor verder onderzoek.</li>
</ol>4. Histologische kleuring
<ol><li>Fixeer een kleine portie (5mm3) gedecellulariseerd weefselmonster in 1 ml 3,7% formaldehydeoplossing bij 4 °C gedurende een nacht.</li>
	<li>Incubeer weefsels in buisjes met 1 ml 30% sucroseoplossing in PBS gedurende 12 uur bij 4 °C op een vaste rots.</li>
	<li>Om weefsels in te bedden in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT), giet u 1 ml OCT in een cryomal, plaatst u weefsel in het midden van de cryomal en giet u vervolgens 2 ml OCT bovenop het weefsel.</li>
	<li>Plaats cryomallen met tissues op droogijs en vries ze snel in met vloeibare stikstof. Monsters zijn klaar wanneer OCT helemaal wit wordt, wat meestal 3 minuten duurt. Bewaar in LT ingebedde weefsels bij -20 °C tot gebruik.</li>
	<li>Verkrijg secties van 10 μm in de cryostaat bij -25 °C op een objectglaasje met poly-L-lysinecoating en breng het objectglaasje over naar kamertemperatuur zodat het weefselgedeelte op het objectglaasje kan smelten. Bewaar de objectglaasjes tot gebruik bij -20 °C.</li>
	<li>Om de afwezigheid van kernen na decellularisatie te bevestigen, voert u een hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) uit zoals hieronder beschreven.<ol><li>Incubeer de glaasjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dompel de objectglaasjes onder in PBS en kleur ze met kant-en-klare 50 ml hematoxyline-oplossing in een kleurpot gedurende 3 minuten, gevolgd door een wasbeurt van 3 minuten met kraanwater.</li>
		<li>Dompel de glaasjes onder in 95% ethanol en kleur ze met 50 ml 0,5% alcoholische Eosine-oplossing gedurende 45 s in een kleurpot.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer Sirius-roodkleuring uit om het behoud van het collageengehalte na decellularisatie aan te tonen.<ol><li>Hydrateer de objectglaasjes met PBS en dompel ze gedurende 1 uur onder in 50 ml 0,1% Siriusrood in een verzadigde waterige oplossing van picrinezuur in een kleurpot.</li>
		<li>Spoel de glaasjes gedurende 5 seconden af met 0,5% azijnzuuroplossing en dehydrateer alle glaasjes door ze achtereenvolgens gedurende 1 minuut in 70%, 95% en 100% ethanol te laten weken.</li>
	</ol></li>
	<li>Om het sGAG-gehalte in weefselmonsters te analyseren, voert u Alcian-blauwkleuring uit zoals hieronder beschreven.<ol><li>Dompel de objectglaasjes gedurende 30 minuten onder in 50 ml 1% Alcianblauw in 3% azijnzuuroplossing (pH 2,5) in een kleurpotje. Was de glijbanen gedurende 2 minuten met stromend kraanwater.</li>
		<li>Dehydrateer alle glaasjes door ze achtereenvolgens gedurende 1 minuut in 70%, 95% en 100% ethanol te laten weken.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg 0,1 ml montagemedium toe aan de monsters en visualiseer met behulp van lichtmicroscopie met een vergroting van 10x.</li>
</ol>5. Mechanische karakterisering
<ol><li>Implementeer oscillerende reologiemetingen met behulp van een reometer met parallelle plaatgeometrie.</li>
	<li>Giet 250 μL pre-geloplossing op ijs op een voorgekoelde (4 °C) onderste plaat om snelle gelering te voorkomen.</li>
	<li>Laat de parallelle plaat van 20 mm zakken totdat de pre-geloplossing een schijf vormt met een spleetbreedte van 1 mm tussen de twee platen.</li>
	<li>Start de meting onmiddellijk. Meet opslag- en verliesmoduli in de loop van de tijd met een vaste frequentie en rek terwijl u de onderste plaat gedurende 30 minuten verwarmt tot 37 °C om de geleringskinetiek te observeren. Gebruik een vaste frequentie van 0,5 Hz en 0,1% rek.</li>
	<li>Voer een kruiphersteltest uit nadat de waarde van de opslagmodulus stopt met stijgen en een plateau bereikt.</li>
	<li>Breng 1 Pa schuifspanning aan op de hydrogel gedurende 15 minuten, meet de rek, ontlaad het monster van de spanning en registreer de verandering in rekwaarde gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Teken een grafiek tussen spanning en tijd om het stress-ontspannende gedrag te laten zien. Herhaal metingen voor drie verschillende dECM-digesten als replicaten.</li>
</ol>

Vergelijkende studie van decellularisatietechnieken voor ECM-hydrogels in de longen van runderen

<ol><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+micropattern+arrays+fabricated+by+lung-derived+dECM+hydrogels+for+chemotherapeutic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening.</a> Mater Today Bio. 15, 100274(2022).</li>
<li>Ulldemolins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels-derived+vesicles+contribute+to+epithelial+lung+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair.</a> Polymers. 14 (22), 4907(2022).</li>
<li>Biehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardized+multi-tissue+decellularization+protocol+for+the+derivation+of+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials.</a> Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cartilage+in+human+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+and+autologous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix.</a> Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22In+vivo+applications+and+development.Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies.</a> In vivo applications and development.Acta Biomater. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schwartz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+screening+approach+reveals+microenvironmental+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance.</a> Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).</li>
<li>Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+3D+in+vitro+tumor+models+for+screening+cell+aggregation+mediated+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response.</a> Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+extracellular+matrix+accumulated+by+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion.</a> Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).</li>
<li>Bual, R. P., Ijima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+extracellular+matrix+component+promotes+maintenance+of+liver-specific+functions+and+larger+aggregates+formation+of+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes.</a> Regen Ther. 11, 258-268 (2019).</li>
<li>Jhala, D., Vasita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+extracellular+matrix+mimicking+strategies+for+an+artificial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Poly+Rev%22%5BJournal%5D)">A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche.</a> Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).</li>
<li>Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+detergent+type+on+the+performance+of+liver+decellularized+extracellular+matrix-based+bio-inks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks.</a> J Tissue Eng. 12, 2041731421997091(2021).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+printing+scaffold+with+porcine+skin+decellularized+bio-ink+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering.</a> Materials. 13 (16), 3522(2020).</li>
<li>Won, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+dermal+substitute+using+decellularized+dermis+extracellular+matrix+derived+bio-ink%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogel+microspheres+fabricated+using+a+temperature-controlling+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).</li>
<li>Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinvasive+extracellular+matrix+remodeling+for+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression.</a> Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+extracellular+matrix+and+its+molecular+and+cellular+regulators+in+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity.</a> Front Oncol. 8, 431(2018).</li>
<li>Takeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+system+using+three-dimensional+cardiac+tissues+containing+multiple+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types.</a> Sci Rep. 11 (1), 5654(2021).</li>
<li>Jensen, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific%2C+fibroblast-derived+matrix+as+a+tool+for+studying+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3331(2021).</li>
<li>Kuşoğlu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decellularization+methods+in+bovine+lung+tissue+reveals+distinct+biochemical+composition%2C+stiffness%2C+and+viscoelasticity+in+reconstituted+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).</li>
<li>Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Sci Rep. 9 (1), 14933(2019).</li>
<li>Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vascularized+lung+cancer-on-a-chip+with+lung+extracellular+matrix+hydrogels+for+in+vitro+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening.</a> Cancers (Basel). 13 (16), 3930(2021).</li>
<li>Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+bioengineering%3A+advances+and+challenges+in+lung+decellularization+and+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization.</a> Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).</li>
<li>Roth, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+freeze-thaw+cycles+for+decellularization+of+tendon+tissue+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 13(2017).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).</li>
<li>Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+extracellular+matrix+viscoelasticity+on+cellular+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour.</a> Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+tunable+stress+relaxation+regulate+stem+cell+fate+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Van organen afgeleide hydrogels zijn veelbelovende modellen geworden die de ECM van het natuurlijke weefsel recapituleren en de organotypische cellulaire functie nabootsen. Hoewel gedecellulariseerde long-ECM vaak is gebruikt in weefselmanipulatie, zal een grondige karakterisering van de samenstelling en mechanische eigenschappen van biomaterialen bijdragen aan een beter begrip van hoe cel-ECM-interacties kunnen worden gemoduleerd voor het modelleren van biologische processen tijdens homeostase of ziekte. Met name de beo...

Conventionele monolaagkweekomstandigheden bieden geen getrouwe weergave van inheemse weefselmicro-omgevingen en missen het vermogen om een driedimensionale (3D) steiger te bieden met instructieve liganden die cel-matrix en cel-cel interacties mogelijk maken1. De samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM) en mechanische eigenschappen zijn zeer weefselspecifiek, tijdsafhankelijk en ondergaan veranderingen in pathologische omstandigheden. Daarom is er behoefte aan biomimetische 3D-weefselmodellen die het mogelijk maken dergelijke kenmerken af te stemmen, cellulair gedrag te moduleren en de gewenste weefselfunctionaliteit te bereiken. Inheemse ECM-afgeleide biomaterialen trekken veel aandacht in weefselmanipulatie met de mogelijkheid om direct weefselspecifieke ECM 1,2,3,4,5 te gebruiken. ECM-gebaseerde dragers zijn gebruikt in vele toepassingen, variërend van weefselregeneratie tot de ontwikkeling van ziektemodellen. Ze worden gebruikt als injecteerbare of implanteerbare biomateriaalsteigers 4,5, in toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen 6,7, bij de ontwikkeling van materialen die celgroei induceren 8,9,10, als bio-inkten 11,12,13, in microfluïdica14 en in kankerweefselmodellen 15,16,17 18,19.
Decellularisatie van weefsels en organen is een populaire benadering voor het genereren van steigers die weefselspecifieke ECM nabootsen. De reconstitutie van gedecellulariseerde weefsels en organen tot hydrogels maakt het mogelijk cellen in te bedden in biomimetische 3D-weefselmodellen20. Decellularisatietechnieken richten zich voornamelijk op het elimineren van cellulaire componenten met behoud van de ECM-samenstelling. Fysische methoden zoals vries-dooicycli of chemische processen zoals Triton-X-100-behandeling worden vaak toegepast om weefsels te decellulariseren. Bovendien heeft DNase-behandeling de voorkeur voor het verwijderen van resterend DNA om de immunologische reacties bij celinbedding te minimaliseren. Het is van cruciaal belang om maximale celverwijdering en minimale ECM-stoornis te bereiken om decellularisatieprocedures te optimaliseren21. Naast deze aspecten is de karakterisering van de biochemische en mechanische eigenschappen van gereconstitueerde steigers, waaronder visco-elasticiteit en stijfheid, cruciaal voor het verbeteren van gemanipuleerde 3D-weefselmodellen die zijn afgeleid van native matrices20.
Orgaanspecifieke ECM in longweefselengineering maakt het mogelijk om de pulmonale micro-omgeving na te bootsen om ontwikkelings-, homeostatische of pathologische processen in vitro te modelleren en therapieën te testen in een fysio-mimetische setting 20,22,23. Eerdere studies hebben decellularisatie van longweefsel van verschillende soorten, zoals ratten, varkens en mensen, aangetoond, maar deze methoden moeten nog worden aangepast aan minder vaak gebruikte soorten zoals runderen. Een beter begrip van de parameters van het decellularisatieproces en hoe deze de resulterende gereconstitueerde ECM-steigers beïnvloeden met betrekking tot biochemische samenstelling en mechanische eigenschappen, zal een betere afstemming van dergelijke aspecten mogelijk maken en de weg vrijmaken voor betrouwbaardere weefselmodellen op het gebied van gezondheid en ziekte. In deze studie wordt decellularisatie van runderlongen met twee verschillende methoden, vries-dooicycli en Triton-X-100-behandeling, expliciet beschreven en gevolgd door biochemische en mechanische analyses van gedecellulariseerde long-ECM (dECM) hydrogels. De bevindingen laten zien dat beide methoden een effectieve decellularisatie en retentie van ECM-liganden opleveren. Met name de keuze van de methode verandert de resulterende stijfheid en visco-elasticiteit van gereconstitueerde hydrogels aanzienlijk. Hydrogels afgeleid van de runder-dECM vertonen opmerkelijke biochemische analogieën met de extracellulaire matrix van de menselijke long, en ze vertonen betrouwbare thermische geleringskenmerken20. Zoals eerder beschreven, zijn beide methoden geschikt voor de 3D-kweek van longkankercellen, gezonde bronchiale epitheelcellen en van patiënten afgeleide longorganoïden20.

<table><tbody><tr><td>Absolute ethanol</td><td>ISOLAB</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>ISOLAB</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Alcian blauw oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8438</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I uit runderpancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HR-2 reometer</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entellan montagemedium</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Eosine oplossing</td><td>Bright-slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-980-485</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Jodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematoxiline kleuring</td><td>Merck</td><td>2.BS01-103-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td></td></tr><tr><td>Pepsine uit porcine maagslijmvlies</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Picrinezuur</td><td>Polysciences</td><td>88-89-1</td><td></td></tr><tr><td>Sirius Rood</td><td>Polysciences</td><td>09400-25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Merck</td><td>112298</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Het gebruik van extracellulaire matrix (ECM)-afgeleide hydrogels in weefselmanipulatie is steeds populairder geworden, omdat ze de natuurlijke omgeving van cellen in vitro kunnen nabootsen. Het handhaven van de oorspronkelijke biochemische inhoud van de ECM, het bereiken van mechanische stabiliteit en het begrijpen van de impact van het decellularisatieproces op de mechanische eigenschappen van de ECM-hydrogels zijn echter een uitdaging. Hier werd een pijplijn beschreven voor decellularisatie van runderlongweefsel met behulp van twee verschillende protocollen, stroomafwaartse karakterisering van de effectiviteit van decellularisatie, fabricage van gereconstitueerde gedecellulariseerde long-ECM-hydrogels en beoordeling van hun mechanische en cytocompatibiliteitseigenschappen. Decellularisatie van de runderlong werd nagestreefd met behulp van een fysische (vries-dooicycli) of chemische (op wasmiddel gebaseerde) methode. Hematoxyline- en eosinekleuring werd uitgevoerd om de decellularisatie en retentie van belangrijke ECM-componenten te valideren. Voor de evaluatie van het resterende collageen- en sulfaatgehalte aan glycosaminoglycaan (sGAG) in de gedecellulariseerde monsters, werden respectievelijk Sirius-rood- en Alcian-blauwkleuringstechnieken gebruikt. Mechanische eigenschappen van de gedecellulariseerde long-ECM-hydrogels werden gekenmerkt door oscillerende reologie. De resultaten suggereren dat gedecellulariseerde hydrogels van runderlongen een betrouwbaar organotypisch<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> alternatief kunnen bieden voor commerciële ECM-producten door de meeste inheemse ECM-componenten te behouden. Bovendien laten deze bevindingen zien dat de decellularisatiemethode naar keuze een aanzienlijke invloed heeft op de kinetiek van de gelering, evenals op de stijfheid en visco-elastische eigenschappen van de resulterende hydrogels.

Decellularisatie Decellularisatie van runderlongweefsel om dECM-hydrogels te produceren die de oorspronkelijke micro-omgeving van de longen zouden recapituleren, is bereikt door zowel fysieke (vries-dooi) als chemische (Triton-X-100) methoden. Na dissectie werden weefselstukken gewassen in dH2O-bevattende antibiotica om ziekteverwekkers te verwijderen die later de steriliteit van de dECM-hydrogels kunnen beïnvloeden. In totaal werden vijf cycli toegepast, afwisselend tussen vloeibare stikst...

Het protocol verduidelijkt twee verschillende decellularisatiemethodologieën die worden toegepast op inheemse longweefsels van runderen, en geeft een uitgebreid overzicht van hun respectieve karakteriseringen.

Ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...

development-characterization-decellularized-lung-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We hebben een gedecellulariseerde long extracellulaire matrix en nieuwe biomimetische bioreactor die kunnen worden gebruikt om functionele longweefsel te genereren. Door zaaien cellen in de matrix en het kweken in de bioreactor, genereren wij weefsel dat effectieve gasuitwisseling laat zien wanneer transplanted in vivo voor een korte periode van tijd.

Procedure voor Lung Techniek

Deze video beschrijft een techniek om extracellulaire matrixhydrogels af te leiden door muriene melkzuurkussens te decellulariseren na ex vivo bestraling voor in vitro studies. Deze hydrogel helpt bij het nabootsen van de in vivo borstweefselomgeving na de bestraling om het gedrag van tumorcellen te bestuderen.

Decellulariserende Mammary Fat Pads: Afleiden van Extracellulaire Matrix Hydrogels van Mammary Fat Pads

Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Hier presenteren we een protocol om een nier cortex extracellulaire matrix afkomstige hydrogel te behouden van de inheemse nier extracellulaire matrix (ECM) structurele en biochemische samenstelling. Het fabricageprocédé en de toepassingen daarvan worden beschreven. Tot slot, een perspectief over het gebruik van deze hydrogel ter ondersteuning van de nier-specifieke cellulaire en weefsels regeneratie en bioengineering wordt besproken.

Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Dit protocol presenteert een methode voor decellularisatie en daaropvolgende hydrogel vorming van muriene borst vetpads na ex vivo bestraling.

Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

Dit protocol beschrijft een methode om reproduceerbare, kleinschalige gemanipuleerde longweefsels te genereren, door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken opnieuw te bevolken met alveolaire epitheliale type 2-cellen, fibroblasten en endotheelcellen.

Gemanipuleerde longweefsels bereid uit gedecellulariseerde longplakken

Dit artikel introduceert een nieuwe methode voor de synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix (DC-ECM) hydrogels. DC-ECM-hydrogels hebben een uitstekende biocompatibiliteit en bieden een superieure micro-omgeving voor celgroei. Daarom kunnen ze ideale celsteigers en biologische afgiftesystemen zijn.

Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie van regionaal gedecellulariseerd longweefsel. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van complexiteiten in de extracellulaire matrix en cel-matrix interacties.

Dissectie en isolatie van regiospecifiek gedecellulariseerd longweefsel

Leer hoe je gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels uit runderlongweefsel ontwikkelt en karakteriseert. Deze methode optimaliseert decellularisatieprotocollen voor mechanische stabiliteit en biologische relevantie in longweefselmodellen.

Ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen

Meer video's verkennen